专利名称：用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法，以及利用该酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成的活性物质的方法。
背景技术：
传统杀虫剂的筛选思路是先筛选对昆虫有毒性的化合物，然后确定其作用靶点。这种筛选方法的缺陷性是比较盲目，筛选得到的化合物往往对人畜毒性大，容易污染环境，而且研发周期长、成本高。作用于昆虫特有的代谢途径(如几丁质合成酶)的生物农药被称为“二十一世纪农药”，对环境和人畜非常安全，是新型生物农药的研发热点。近年来，虽然该领域获得了一些可喜的研究成果，但由于受到筛选方法落后的制约，没有取得突破性的进展。因此，筛选新型杀虫剂的关键是建立一套快速有效的筛选方法。
几丁质是NDP-乙酰氨基葡萄糖(NDP-GlcNAc)的聚合物。几丁质是昆虫表皮(外骨骼)的主要成分，也是许多昆虫肠道表皮的重要成分。任何干扰昆虫几丁质合成的物质都会对昆虫的生长和发育产生剧烈的影响。几丁质合成酶(NDP-GlcNAc转移酶，E2.4.1.16)是催化生成几丁质聚合反应的关键酶。近年来，干扰几丁质合成途径是新型生物农药研发的热点，取得了一些研究成果。苯甲酰基苯基脲类即除虫脲是最为成功的例子。但是除虫脲只是偶然发现的，而且没有直接作用在几丁质合成酶上，更多是全身性的影响。其他作用于这个位点的化合物如尼可霉素和Polyxin等，普遍药效比较低且容易产生抗、耐药性。因此目前迫切需要筛选作用于昆虫几丁质合成酶的新化合物。
迄今已克隆了果蝇等少数模式昆虫的几丁质合成酶基因，但对昆虫几丁质合成酶缺乏系统的研究，酶促反应机理尚不清楚。几丁质也是真菌细胞壁的主要组成成分。相比昆虫，真菌的几丁质合成酶(chitin synthase，CHS)研究得比较深入。已经在真菌中分离到6种几丁质合成酶的同功酶，其中CHS1、CHS2、CHS3比较普遍。也已经克隆了部分真菌的几丁质合成酶的基因。在酿酒酵母中有CHS1、CHS2和CHS3三种同功酶，每个酶具有不同的功能和位点，其中CHS1和CHS3同时缺陷会引起酵母细胞的死亡。CHS3催化大部分的几丁质的合成。研究表明，昆虫和酵母几丁质合成酶的不同之处主要是C-端和N-端的氨基酸残基变化，而催化域的氨基酸残基同源性非常高。昆虫和酵母几丁质合成酶体外酶促反应要求的条件基本一致，且底物与产物相同。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法，以及应用该酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成的活性物质。筛选出来的活性物质可以开发为新型高效、高选择性昆虫生长调节剂。
本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)三种不同基因型的酵母组成。
其中，指示菌酵母A是现有酵母(W303)；指示菌酵母B( CHS2)是阻断酵母几丁质合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2)；指示菌酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1)是整合表达昆虫几丁质合成酶催化域和阻断酵母几丁质合成酶CHS1基因的基因工程菌酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型的构建方法包括1.用现有的PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2(genebank序列号M23865，网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获得重组子酵母( CHS2)。
具体方法是用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段，大小为100到500。通过PCR融合或者用酶切连接，将酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合，产生两段融合DNA。采用PEG转化法、电转化法或者CaCl2转化法等合适的方法，将上述两个融合片段转化酵母(W303)感受态细胞。在选择性平板上筛选目的重组子，即酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS2被阻断，不能合成CHS2。通过PCR或者采用其他方法如Northern杂交来鉴定重组子。
2.在酵母( CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因，得到重组子酵母( CHS2，DmCS-1+)再采用现有的PCR基因阻断技术阻断该酵母( CHS2，DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1(genebank序列号M14045，网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)；获得重组子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
昆虫和酵母几丁质合成酶的不同之处主要是C-端和N-端的氨基酸残基变化，而催化域的氨基酸残基同源性非常高。几丁质合成酶C-端和N-端的氨基酸序列主要功能是酶的定向运输。在昆虫中几丁质合成酶的表达和运输中有组织专一性，而酵母只是单细胞无组织。因此用昆虫的几丁质合成酶取代酵母的几丁质合成酶的功能，只需要用昆虫几丁质合成酶催化域替换酵母的几丁质合成酶的催化域。这样既可以实现催化功能，又能让杂合的几丁质合成酶运输到合适的位置。因此，酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)具体方法可以是(1).果蝇几丁质合成酶基因的催化域是由其编码序列的第一个外显子编码的。用PCR方法扩增果蝇几丁质合成酶基因DmCS-1(genebank序列号AF227729，网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的催化域编码序列。用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶(CHS1)的催化域上游的编码序列和催化域下游的编码序列。通过PCR融合或者用酶切连接等方法，将CHS1催化域上游的编码序列、果蝇几丁质合成酶基因的催化域编码序列、CHS1催化域下游的编码序列按顺序连接起来。连接产物克隆到整合型表达载体，得到果蝇几丁质合成酶的整合表达载体(含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体)，并在大肠杆菌中增殖。用内切酶(位点在CHS1的催化域上游的序列内，至少离起始碱基100bp)线性化含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体，转化酵母( CHS2)的感受态细胞。在选择性平板上筛选目的重组子。通过PCR或者采用其他方法如Northern杂交来鉴定重组子。获得重组子酵母( CHS2，DmCS-1+)。
(2).采用与上述步骤1阻断CHS2一样的方法，用PCR基因阻断技术，阻断酵母( CHS2，DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1；不同之处是来自酵母的两个片段是几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段。获得重组子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
3.由现有野生型酵母(W303)与上述获得的重组子酵母( CHS2)和酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作为指示菌，构成本发明的用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型。
上述构建的本发明酵母模型可用于筛选抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质，包括抑制昆虫几丁质合成酶的物质(化合物)和能产生抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物。抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质可以开发为新型昆虫生长调节剂，用于害虫的防治。
应用本发明酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质的具体方法是同时以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作为指示菌，以已知的几丁质合成酶抑制剂为正对照；分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板，继续培养一段时间；根据指示菌生长状况，按以下筛选供试物质如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性，可以用于开发为昆虫生长调节剂；如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长，对酵母A没有抑制作用，说明供试物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性，可以用于开发为杀菌剂或者杀虫剂。
应用本发明酵母模型筛选产生抑制昆虫几丁质合成酶的活性物质的微生物的具体方法是同时以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作为指示菌，以已知的几丁质合成酶抑制剂为正对照，以供试微生物培养物上清液为供试物质；分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板，继续培养一段时间；根据指示菌生长状况，按以下筛选供试物质如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质，可以用于开发生产昆虫生长调节剂；如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长，对酵母A没有抑制作用，说明供试微生物产生的活性物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性，可以用于开发生产杀菌剂或者杀虫剂本发明用昆虫几丁质合成酶基因取代酵母的几丁质合成酶基因，在酵母中表达昆虫几丁质合成酶满足酵母几丁质合成的需要；构建了以昆虫几丁质合成酶为靶标的酵母筛选模型；并应用该模型建立了一种新的昆虫几丁质合成酶抑制剂筛选方法；该方法是一种新型生物农药筛选方法，其所筛选的活性物质靶标非常专一，具有高度选择性；克服了传统筛选方法靶标比较盲目，筛选的化合物往往对人畜毒性大和容易污染环境，而且研发周期长、成本高的缺点；同时与传统的筛选方法相比，本方法对活性物质更为灵敏，能有效的检测出不同来源的、传统筛选方法难以检测到的低浓度的抑制昆虫几丁质合成酶活性物质。这些活性物质可以开发为具有高度选择性的新型生物农药，用于害虫防治。
以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是果蝇几丁质合成酶的整合表达载体的结构示意图；图2是用酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物的流程图。
具体实施例方式
实施例1构建筛选昆虫几丁质合成酶抑制的酵母模型1.采用PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2，构建酵母( CHS2)以酵母(W303)的DNA为模板，用引物1和2扩增出几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段。PCR反应体系包括20ng酵母DNA，5μM引物1、2各1μl，5μl 10倍PCR缓冲液，5μl 2mMdNTPs，1U pfu酶，加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟，接着30个温度循环(94℃1分钟，55℃30秒，72℃2分钟)，再72℃8分钟，最后保持在4℃。
以酵母(W303)的DNA为模板，用引物3和4扩增出几丁质合成酶基因CHS2 3’端片段。PCR反应体系和反应程序与扩增几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段一样。
以质粒Ycp50的DNA为模板用引物5和6扩增出选择标记基因URA3编码DNA。PCR反应体系包括20ng Ycp50，5μM引物5、6各1μl，5μl10倍PCR缓冲液，5μl2mMdNTPs，1U pfu酶，加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟，接着30个温度循环(94℃1分钟，52℃30秒，72℃2分钟)，再72度8分钟，最后保持在4℃。用低熔点琼脂糖电泳回收PCR产物。
将CHS2 5’端片段和选择标记基因URA3编码DNA混合，先在65℃下进行融合，作为模板，用引物1和引物6进行融合扩增。PCR反应体系包括两个DNA片段各20ng，5μM引物1、6各1μl，5μl10倍PCR缓冲液，5μl2mMdNTPs，1U Taq酶，加双蒸水至50μl。反应程序与扩增几丁质合成酶基因CHS2 5’端片段，用低熔点琼脂糖电泳回收PCR产物。
用CHS2 5’端片段和选择标记基因URA3编码DNA PCR融合的方法，将CHS2 3’端片段和选择标记基因URA3编码DNA融合。
用PEG转化法将上述两个融合PCR产物转化感受态酵母细胞。用选择性平板上筛选目的重组子(URA+， CHS2)，即酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS2被阻断，不能合成CHS2。
重组子鉴定采用PCR方法。以重组子的DNA为模板，用引物5和6作为特异性引物进行PCR反应。PCR条件和程序和扩增选择标记基因URA3一样。用琼脂糖电泳检测PCR产物，如果有目的带，就说明是目的重组子。
选择标记基因的重组消除。因为选择标记基因URA3的两端有添加的100bp的同向重复序列，相对容易发生重组(10-4-10-5)，从而丢失选择标记基因URA3。这种重组子(URA-， CHS2)用含有5-FOA的培养基筛选到。
最后获得重组子酵母(URA-， CHS2)。
2.构建酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+
(1).酵母(URA-， CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因的催化域果蝇几丁质合成酶基因的催化域是由其编码序列的第一个外显子编码的。设计引物7(5’端有内切酶SacI酶切位点)和引物8(5’端有内切酶NruI酶切位点)用于扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域。设计引物9和10用于扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域上游的序列，包括部分启动子序列。其中引物10含有与引物7一样的内切酶位点SacI，引物9含有与载体相连的内切酶位点BglII。设计引物11与12用于扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域下游的序列，包括终止子序列。其中引物11含有与引物8一样的内切酶位点NruI，引物12含有与载体相连的内切酶位点SalI。
以果蝇DNA为模板，用引物7和8扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域，PCR反应条件如下PCR反应体系包括模板DNA20ng，5μM引物5、4各1μl，5μl10倍PCR缓冲液，5μl2mM dNTPs，IU Taq酶，加双蒸水至50μl。反应程序为94℃变性4分钟，接着30个温度循环(94℃1分钟，50℃30秒，72℃2分钟)，再72℃8分钟，最后保持在4℃。以酵母DNA为模板，用引物9和10扩增CHS1的催化域上游的序列，用引物11和12扩增CHS1的催化域下游的序列。PCR反应条件与扩增果蝇几丁质合成酶基因的催化域的PCR反应条件一样。用内切酶消化上述PCR产物，然后用T4连接酶连接。以连接产物为模板，用引物9和12扩增杂合DNA。用琼脂糖电泳回收PCR产物。
用BglII和NmI双酶切回收的PCR产物，用T4连接酶连接到酵母质粒pPICaBglII和NruI双酶切的大片段上，转化大肠杆菌DH5α。挑选转化子，培养提取质粒，得到的质粒即为含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体，命名为DmCS-1 Expresion，其结构如图1所示。用内切酶AvaII线性化该表达载体。采用PEG转化法转化感受态酵母细胞( CHS2)。在含有抗生素ZeocinTM的选择性平板上筛选目的重组子。通过PCR方法鉴定重组子。获得重组子酵母( URA-， CHS2，DmCS-1+)。
(2).采用PCR基因阻断技术阻断酵母( CHS2，DmCS-1+)的几丁质合成酶基因设计引物13和14扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端。引物13的5’端20个碱基与选择标记基因URA3的3’端20个碱基互补。设计引物15和16扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端。引物15的5’端与选择标记基因URA3的5’端20个碱基互补。
以上述(1)所得到的酵母(URA-， CHS2，DmCS-1+)的DNA为模板，用引物13和14扩增出几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段。用引物15和16扩增出几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端片段。以酵母穿梭质粒Ycp50或者其他含有选择标记基因的DNA为模板，用引物5和6扩增出选择标记基因URA3编码DNA。用琼脂糖电泳方法回收PCR产物。
将上述回收的PCR产物中的几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段和选择标记基因编码DNA混合，先在65℃下进行融合，作为模板，然后加入引物13和引物6以及其他PCR反应需要的试剂，进行融合PCR反应。PCR产物为几丁质合成酶基因CHS1保守域5’端片段和选择标记基因编码DNA的融合DNA片段。用琼脂糖电泳方法回收PCR产物。采用同样的方法，PCR融合回收的PCR产物几丁质合成酶基因CHS1保守域3’端片段和选择标记基因URA3编码DNA。
采用PEG转化法，将上述两个融合片段转化感受态酵母细胞(URA3+， CHS2，DmCS-1+)。在选择性平板上筛选目的重组子(URA+)，即酵母的几丁质合成酶基因CHS1保守域编码区大部分被选择标记基因取代的重组子。这些重组子CHS1保守域被阻断，不能合成有功能的CHS1。通过PCR方法鉴定重组子。获得重组子酵母(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
本实施例中所用到的各引物如下引物1AGGACTCTCCCTTGGGATG引物2CTGGACCTTGAACGACAAT引物3ATCATTACGACCGAGATTCC引物4GGGTTTCAATTCAATTCATCA引物5TTGTTACTGGGCTGTTGCT引物6GGAATCTCGGTCGTAGTAATGATGCTAACAGCAACTCTCGGT引物7TGATGAATTGAATTGAAACCCGCTGGGGTGATAGATGGTA引物8AGCAACAGCCCAGTAACAATCTCATTGCTCTCCACCTAT引物9AGATCTTCAGTAAGACGCTATTGGAC引物10GGATCCCCATCTTCTGTAGTATTAATCTTA引物11GCTAACAGCAACTCTCGGT引物12TTGTTACTGGGCTGTTGCT引物13ACCGAGAGTTGCTGTTAGCCTTAGTAATGCTAGCGAGCG引物14AGCAACAGCCCAGTAACAAGTCCGTCATATTCCTGTGGC引物15AGATCTCGGGGGAGCGCATACTTTAA引物16GAGCTCCATTGTATAGTTTTTTTGGT本实施例中所用PEG转化法的具体操作步骤及条件如下接种5ml液体YPAD，30℃下振荡过夜。计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种YPAD培养液。置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml。2500r/min离心5min，收获细胞。弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，同上离心。弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。高速离心沉淀细胞，吸出醋酸锂。悬浮细胞到最终500μl。将1ml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却。振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，除去醋酸锂。小心按下列顺序加入下列转化混合液240μl PEG(50％w/v)，36μl 1.0mol/L醋酸锂，25μl 单链载体DNA(2.0mg/ml)，50μl 水和质粒DNA(0.1-10μg)；剧烈振荡反应管直到细胞完全混匀，置30℃保温30min。置42℃水浴中热激20-25min。8000r/min离心15秒，除去转化混合液。吸0.2-1.0ml无菌水加到每个反应管中，悬浮沉淀，用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
YPAD培养基酵母粉10g蛋白胨20g
葡萄糖20g硫酸腺嘌呤40mg蒸馏水1000ml121℃灭菌15min。
3.将上述获得的重组子酵母(URA-， CHS2)和酵母(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)与现有野生型酵母(W303)一起作为指示菌，构成酵母模型，用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂。实施例2用酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物(1).用96孔板微量培养供试微生物，培养基(LP)成分为淀粉1％、蛋白胨1％、牛肉膏0.3％。30℃振荡培养72小时，8000r/min离心10分钟。
(2).培养指示菌酵母A(W303)、酵母B(URA-， CHS2)和酵母C(URA+， CHS2， CHS1，DmCS-1+)。培养基(YNP)为1％硫酸铵、1％硫酸钾、0.5硫酸镁、0.05硫酸钙、0.5％磷酸氢二钾、0.8％磷酸二氢钾和0.02％YPN溶液。30℃振荡培养至OD610为2-4时，加入96孔板，每个孔加100μl。
(3).在有指示酵母的96孔板中加微量(每个孔30μl)上述(1)培养的供试微生物上清液(供试物质)，以10uM尼可霉素作正对照，培养12小时，用酶标仪测定OD610。如果供试物质和尼可霉素一样只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性，即供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质；如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长，对酵母A没有抑制作用，说明供试物质(供试微生物产生的活性物质)可能不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性。整个流程如图2所示。实施例3用酵母模型筛选抑制昆虫几丁质合成酶的化合物(1).用培养基(YNP)培养指示菌酵母A、酵母B和酵母C。方法和条件与实施例2步骤(2)相同。
(2).在有指示酵母的96孔板中加50ppm对硫磷、10uM尼可霉素(每个孔30μl)，培养12小时，用酶标仪测定OD610。尼可霉素只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明尼可霉素抑制昆虫的几丁质合成酶的活性。酵母C、酵母A和酵母B都不受对硫磷抑制，说明对硫磷杀虫的活性是作用在其他的靶标。
权利要求
1.用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型，由指示菌酵母A(W303)、酵母B( CHS2)和酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)三种不同基因型的酵母组成。
2.根据权利要求1所述的酵母模型，其特征是其中所说的指示菌酵母A(W303)A是现有酵母(W303)；指示菌酵母B( CHS2)是阻断酵母几丁质合成酶CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2)；指示菌酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)是整合表达昆虫几丁质合成酶催化域和阻断酵母几丁质合成酶CHS1和CHS2基因的基因工程菌酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
3.权利要求1所述酵母模型的构建方法，包括(1).用现有的PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2，获得重组子酵母( CHS2)；(2).在(1)获得的酵母( CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因，得到重组子酵母( CHS2，DmCS-1+)；再采用现有的PCR基因阻断技术阻断该酵母( CHS2，DmCS-1+)的几丁质合成酶基因CHS1，获得重组子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)(3).将现有酵母(W303)与上述获得的重组子酵母( CHS2)和酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)一起作为指示菌，构成用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征是构建酵母( CHS2)的具体方法是用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段，大小为100到500；通过PCR融合或者用酶切连接，将酵母几丁质合成酶基因CHS2 5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合，产生两段融合DNA；将上述两个融合片段转化酵母(W303)感受态细胞；在选择性平板上筛选酵母的几丁质合成酶基因CHS2编码区大部分被选择标记基因取代的重组子；通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子，获得重组子酵母( CHS2)。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征是构建酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)的具体方法是(1).用PCR方法扩增果蝇几丁质合成酶基因DmCS-1的催化域编码序列；用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶CHS1的催化域上游的编码序列和催化域下游的编码序列；通过PCR融合或者用酶切连接方法，将CHS1催化域上游的编码序列、果蝇几丁质合成酶基因的催化域编码序列、CHS1催化域下游的编码序列按顺序连接起来；连接产物克隆到整合型表达载体，得到含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体；用内切酶线性化该含有杂合几丁质合成酶基因的表达载体，转化酵母( CHS2)感受态细胞；在选择性平板上筛选目的重组子；通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子，获得重组子酵母( CHS2，DmCS-1+)(2).用PCR方法扩增酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段，大小为100到500；通过PCR融合或者用酶切连接，将酵母几丁质合成酶基因CHS1保守域的5’端和3’端片段分别与选择标记基因融合，产生两段融合DNA；将上述两个融合片段转化酵母( CHS2，DmCS-1+)感受态细胞；在选择性平板上筛选酵母的几丁质合成酶基因CHS1编码区大部分被选择标记基因取代的重组子；通过PCR或者Northern杂交鉴定重组子，获得重组子酵母( CHS2， CHS1，DmCS-1+)。
6.权利要求1或2的酵母模型用于筛选抑制昆虫几丁质合成酶的物质。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征是同时以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作为指示菌，以已知的昆虫几丁质合成酶抑制剂为正对照；分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板，继续培养一段时间；根据指示菌生长状况，按以下筛选供试物质如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明供试物质能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性，可以用于开发为昆虫生长调节剂；如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长，对酵母A没有抑制作用，说明供试物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性也能抑制酵母几丁质合成酶的活性，可以用于开发为杀菌剂或者杀虫剂。
8.按照权利要求6所述的应用，其特征是用所述的酵母模型筛选产抑制昆虫几丁质合成酶活性物质的微生物。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征是同时以酵母A(W303)、酵母B( CHS2)、酵母C( CHS2， CHS1，DmCS-1+)作为指示菌，以已知的昆虫几丁质合成酶抑制剂为正对照，以供试微生物培养物上清液为供试物质；分别将正对照抑制剂和供试物质加入培养有指示菌的细胞培养板，继续培养一段时间；根据指示菌生长状况，按以下筛选供试物质如果供试物质与正对照抑制剂一样只抑制酵母C的生长，对酵母A和酵母B没有抑制作用，说明供试微生物能产生抑制昆虫的几丁质合成酶的活性物质，可以用于开发生产昆虫生长调节剂；如果供试物质同时抑制酵母C和酵母B的生长，对酵母A没有抑制作用，说明供试微生物产生的活性物质不但能抑制昆虫的几丁质合成酶的活性，也能抑制酵母几丁质合成酶的活性，可以用于开发生产杀菌剂或者杀虫剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于筛选昆虫几丁质合成酶抑制剂的酵母模型及其构建方法和应用。本发明采用PCR基因阻断技术阻断酵母(W303)的几丁质合成酶基因CHS2，获得重组酵母(⊿CHS2)；在酵母(⊿CHS2)中整合表达果蝇几丁质合成酶基因，再阻断该酵母的几丁质合成酶基因CHS1，获得重组酵母(⊿CHS2，⊿CHS1，DmCS－文档编号C12Q1/00GK1428432SQ0215203
公开日2003年7月9日 申请日期2002年11月25日 优先权日2002年11月25日
发明者陈志仕, 刘阳, 杨杏, 徐涛, 张文庆, 钟英长 申请人:中山大学