专利名称：双对比增强的单碱基替换型突变的寡核苷酸微阵列检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于寡核苷酸微阵列检测单碱基替换型突变的探针设计以及检测方法，该方法命名为信号增强双对比法。该方法使用四条长度为8-50nt的寡核苷酸探针检测一个单碱基替换型突变，四条探针为野生型序列完全匹配探针(Pw1)；突变型序列完全匹配探针(Pt1)；Pw1探针序列中引入一个人工错配碱基探针(Pw2)。Pt1探针序列中引入一个人工错配碱基(Pt2)。上述四条探针在寡核苷酸微阵列上与相应的PCR标记产物杂交后，产生四个强度不等的杂交信号，与Pw1，Pt1，Pw2，Pt2相对应的杂交信号强度表示为Sw1，St1，Sw2，St2。通过公式运算得出信号差异值(Z)Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]。当Z值＞0时，表示检测物为野生型纯合子；当Z值＝0，或非常接近于0时，表示突变型和野生型各占一半，即检测物为杂合子；当Z＜0时，表明检测物为野生型纯合子。
随着人类基因组计划的完成，产生了大量的人类基因序列的相关数字资料，下一步的艰巨任务之一是对这些资料进行分析比对，发现和检测不同种族，人群以及个体间的基因序列的多态性，以及这些多态性与疾病的遗传，发生，转归，药物治疗反应等之间的关系。基因变异最重要的表现为单碱基多态性(Single nucleotide polymorphismes，SNPs)，据统计人类基因序列中的30亿个碱基对中，每1千个碱基对中就有一个单碱基突变发生，因此SNPs的检测在生物医学研究和疾病诊断中有重要意义。
寡核苷酸微阵列法以其高通量，多靶位的并行检测模式，具有所有传统的检测方法不可比拟的优越性，寡核苷酸微阵列检测SNPs的策略包括1基于DNA杂交反应原理的检测方法；2基于3’端突变位点错配的连接酶反应的检测方法；3基于突变位点前一个碱基的延伸反应。第一种方法采用两条分别与野生型和突变性序列相匹配的两条探针(相当于本发明中的Pw1和Pt1)来区分突变性和野生型，特点是操作简单，省时，廉价；但该方法的严重缺陷在于，两条探针之间只有一个碱基错配，信号差异较小，对探针设计长度和杂交温度的范围要求较高，很难同时检测大量的单碱基替换型突变。第二种和第三种方法虽然能够特异性地区分野生型和突变型信号，但操作繁琐，耗时，费用昂贵。
本发明所采用的用于寡核苷酸微阵列的信号增强双对比法是基于DNA杂交反应原理所设计的，与普通的寡核苷酸微阵列杂交检测不同的是，该方法在原来的两条探针Pw1和Pt1的基础上，引入了两条带有一个人工错配Pw2和Pt2探针，根据同一检测原理，普通的寡核苷酸微阵列杂交检测信号差异可表示为Z＝log(Sw1/St1)，根据文献报道，两条探针之间两个碱基错配与同等条件下一个碱基错配的差异要大于两条探针之间一个碱基错配与完全匹配的差异。在检测野生型序列时Sw1为完全匹配信号，Sw2和St1为单碱基错配信号，Sw2为双碱基错配信号，信号强度大小排列顺序应为Sw1＞Sw2≈St1＞St2，根据信号增强双对比法信号差异值运算公式Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]＝log(Sw1/St1)+log(Sw2/St2)。上式中log(Sw2/St2)，即为引入Pw2和Pt2两条探针所增加的信号值。本发明的方法操作简便，省时，节省费用，同时具有分辨率高，对杂合子的检测远比普通的寡核苷酸微阵列杂交检测准确可靠。
为进一步解释用于寡核苷酸微阵列，信号增强双对比的单碱基替换型突变的检测方法，参照下列实施例进行说明，本实施例是为了解释而不是为了以任何方式限制本发明。
实施例本实施例以检测人类药物代谢酶CYP3A4基因的两个替换型突变等位基因CYP3A4*4，CYP3A4*8为例，这两个突变位点均位于CYP3A4基因第五外显子(
图1药物代谢酶CYP3A4的第五外显子上的两个突变型突变位点)。
1 PCR引物及杂交探针设计设计一对特异性扩增包含CYP3A4*4和CYP3A4*8两个突变位点的引物如下L5’-GCCTTTTGGTCCAGTGGGATTTATG；R*5’-TGGTGAAGGTTGGAGACAGCAATGA。其中右侧下游引物的5’端带有CY3荧光标记物。扩增片段长度为97bp。四条检测CYP3A4*4突变的探针序列如下Pw1*45’gaaaagtgccatctctatagPt2*45’gaaaagtgcgGtctctatagPw2*45’gaaaagtgcgatctctatagPt1*45’gaaaagtgccGtctctatag四条检测CYP3A4*8突变的探针序列如下Pw1*85’agagattacgatcattgctgPt2*85’agagattacAgtcattgctgPw2*85’agagattacggtcattgctgPt1*85’agagattacAatcattgctg上述探针序列中，大写字母表示与替换后突变碱基相匹配碱基，黑体字母表示引入的错配碱基。在探针的5’端有一由NH2-(CH2)6-O-(PO)2-组成的氨基修饰的臂，可与醛基化玻片结合。
2 寡核苷酸微阵列的制备将探针用点样缓冲液稀释至30uM/L，通过点样仪，将上述两组探针按图2(检测两个突变位点的8条探针的微阵列模式)的排列矩阵点至醛基化玻片上，室温70％湿度条件下结合2小时，2％SDS水溶液票洗1min.。室温干燥保存。
3 杂交反应操作3.1将一份临床全血样本按标准操作程序提取DNA，用上述引物进行非对称PCR扩增，产生大量带有荧光标记的PCR产物。
3.2将PCR产物用杂交缓冲液以1∶10稀释，加入四孔微阵列中，将玻片微阵列放入杂交盒内，密封。放入58℃水浴锅中，反应1小时后取出，洗液清洗。
3.3用Scanarray3000型激光共聚扫描仪，对玻片进行扫描，得到四个孔的扫描图像(图3重复检测4个孔的扫描图像)3.4用Imagene图像分析软件对所的图像进行分析，得出每个杂交点的荧光强度值。
4 数据分析处理Imagene图像分析软件所得的各探针杂交点的荧光强度均值直方图见图4(四条检测CYP3A4*4突变等位基因探针的平均荧光强度)，图5(四条检测CYP3A4*8突变等位基因探针的平均荧光强度)。表1Imagene图像分析软件所得的各探针杂交点的荧光强度均值Sw1*4 St2*4 Sw2*4 St 1*4 Sw1*8 St2*8 Sw2*8 St1*89402.122663.195 5167.05 4382.1014783.27 4643.7713323.07 11842.064.1根据公式差异值Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]，CYP3A4*4的显示差异为Z＝log[(Sw1*4×Sw2*4)/(St1*4×St2*4)]＝0.62。根据判断原则，该份样本应为CYP3A4*4的野生型。如果不引入两条错配探针，而用普通杂交方法进行检测，差异值Z＝log(Sw1*4/St1*4)＝0.33。新方法检测效率是老方法的1倍。
4.2根据公式差异值Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]，CYP3A4*8的显示差异为Z＝log[(Sw1*8×Sw2*8)/(St1*8×St2*8)]＝0.45。根据判断原则，该份样本应为CYP3A4*8的野生型。如果不引入两条错配探针，而用普通杂交方法进行检测，差异值Z＝log(Sw1*8/St1*8)＝0.04。此结果无法判断样本的基因型。新方法检测效率是老方法的10倍。
5 说明书附图注释图1药物代谢酶CYP3A4的第五外显子上的两个突变型突变位点。
图2检测两个突变位点的8条探针的微阵列模式。
图3重复检测4个孔的扫描图像。
图4四条检测CYP3A4*4突变等位基因探针的平均荧光强度。
图5四条检测CYP3A4*8突变等位基因探针的平均荧光强度。
权利要求
1.一种用于寡核苷酸微阵列，检测替换型单碱基突变的新方法。该方法命名为信号增强双对比法。其特征在于在原有的两条与野生型和突变型完全匹配的探针(Pw1，Pt1)基础上，引入两条等长的、带有一个人工错配碱基的、与野生型和突变型匹配的探针(Pw2，Pt2)。杂交检测结果通过4条探针的显示信号(Sw1，Sw2，St1，St2)，按公式计算差异值(Z)Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]，当Z值＞0时，表示检测物为野生型纯合子；当Z值＝0，或非常接近于0时，表示突变型和野生型各占一半，即检测物为杂合子；当Z＜0时，表明检测物为野生型纯合子。
2.根据权利要求1所述的方法，用该方法进行杂交检测的寡核苷酸微阵列，可以使用所能用到的各种固相载体。
3.根据权利要求1所述的方法，用该方法进行杂交检测的寡核苷酸微阵列，使用的信号包括各种荧光显色信号，放射性信号，各种生物酶催化化学底物产生的颜色信号。
4.根据权利要求1所述的方法，用该方法进行杂交检测的寡核苷酸微阵列，检测一个突变位点，使用的四条检测探针(Pw1，Pw2，Pt1，Pt2)的长度为等长的8-50nt。引入的人工错配和所检测的突变位点之间相间隔的碱基数为0-20nt。
5.根据权利要求1所述的方法，用该方法进行杂交检测的寡核苷酸微阵列，不但用于检测人类DNA的单碱基替换型突变，还可用于检测各种微生物DNA的单碱基替换型突变，并且通过统计学分析，根据显示差异值(Z)，对突变的拷贝数进行半定量推测。
全文摘要
本发明涉及一种用于寡核苷酸微阵列检测单碱基替换型突变的探针设计以及检测方法，该方法命名为信号增强双对比法。该方法使用四条长度为8－50nt的寡核苷酸探针检测一个单碱基替换型突变，四条探针为野生型序列完全匹配探针(Pw1)；突变型序列完全匹配探针(Pt1)；Pw1探针序列中引入一个人工错配碱基探针(Pw2)。Pt1探针序列中引入一个人工错配碱基(Pt2)。上述四条探针在寡核苷酸微阵列上与相应的PCR标记产物杂交后，产生四个强度不等的杂交信号，与Pw1，Pt1，Pw2，Pt2相对应的杂交信号强度表示为Sw1，St1，Sw2，St2。通过公式运算得出信号差异值(Z)Z＝log[(Sw1×Sw2)/(St1×St2)]。当Z值＞0时，表示检测物为野生型纯合子；当Z值＝0，或非常接近于0时，表示突变型和野生型各占一半，即检测物为杂合子；当Z＜0时，表明检测物为野生型纯合子。
文档编号C12Q1/68GK1458286SQ02151950
公开日2003年11月26日 申请日期2002年11月13日 优先权日2002年11月13日
发明者丁亚平, 张文, 曹恒杰, 丁雨, 陈立炎, 耿永尧 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司