专利名称：一种基因定点突变方法和以此方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体和转化子的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因定点突变方法和通过该方法获得的重组细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶基因(aroA)、以及含有此基因的表达载体和转化子。
背景技术：
草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，杂草难以对它产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。
5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶(E.C.2.5.1.19)，催化植物和微生物中的莽草酸代谢途径倒数第二个反应，使PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)与3-磷酸莽草酸反应生成EPSP(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸)和无机磷。由于草甘膦具有与PEP相似的结构，可形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦复合物，阻遏PEP与酶的结合，阻断芳香族氨基酸的的合成，从而杀灭绝大多数的植物，杂草和农作物皆不例外。
由于草甘膦可无选择地杀死杂草和作物，因此而制约了它在农业上的应用，使之不能被大规模用于作物的田间除草。然而草甘膦价格便宜，是目前农民最喜用的除草剂。为了适应市场的需要，从二十世纪八十年代中期开始，人们为培育抗草甘膦农作物作了大量的工作。其中最成功的例子是将改良过的草甘膦靶标酶EPSP合成酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。
过去采用定点突变法改良EPSP合成酶来降低酶对草甘膦亲和力。由于对酶的三维结构和氨基酸位点的作用并不完全清楚，所以使用定点突变法取得的效果十分有限。以往的定点突变方法遇到的问题是，突变后酶降低了对草甘膦的亲和力的同时对酶原底物的亲和力也下降，因而影响了酶的催化活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因定点突变方法，采用此方法，可以人为加大发生基因突变的准确性；并运用该方法，把通过基因优化法获得的突变基因作进一步改良，获得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因并将之用于转基因植物。
本发明的基因定点突变方法是选用具有如下结构特点的DNA序列作源模板需突变的位点与一单酶切位点相距10-20个碱基；根据该源模板的序列特点，设计出与源模板序列相对应的一个5’-端引物和两个3’-端引物，并采用两步PCR扩增反应，从而得到引入点突变的基因片段。
首先，选定要进行定点突变的序列作为源模板，根据该源模板序列设计一个5′端引物和两个3′端引物；重点在两个3’-端引物的设计上。5’-端引物与源模板的5’-端序列相对应，而两个3′端引物问有10-20个碱基的重叠序列，并且其一带有需要在扩增产物中引入的突变序列，另一带有需要在扩增产物中引入的酶切位点序列。由5′端引物和带有突变序列的3′端引物进行第一轮PCR扩增反应，得到引入突变位点的扩增产物；再以此扩增产物为模板，利用原5′端引物和带有酶切位点的3′端引物进行第二轮扩增，把酶切位点引入到前述带突变位点的序列的3′端；最终，获得既带有突变序列，又带有酶切位点的DNA片段。再通过将该片段与源模板上的相应片段进行酶切片段互换，实现基因序列的定点突变。
通常，上述本发明的基因定点突变方法所用PCR扩增方法的具体条件和操作步骤如下第一步扩增反应反应系统以约102-104拷贝源模板DNA、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、根据源模板设计的5’-端引物和带有需引入的突变序列的3’-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。
反应条件为[1]94℃ 5分钟[2]循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次[3]72℃ 10分钟通过琼脂糖凝胶电泳，分离第一步PCR扩增的产物，用作第二步扩增的模板。
第二步扩增反应反应系统以约102-104拷贝第一步PCR扩增的产物DNA、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、根据源模板设计的5’-端引物和带有带有酶切位点的3’-端引物各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。
反应条件为[1]94℃ 5分钟[2]循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次[3]72℃ 10分钟反应完毕，再通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化扩增产物，与源模板分别进行酶切，把带突变序列的新片段，连接到源模板上的相应位置，从而实现定点突变。
发明人的研究发现，基因优化法能克服定点突变的局限性，增大了发生突变的速度和幅度。若在基因优化法获得的突变基因的基础上，再有目的地进行定点突变，两者相结合，则能减少单纯使用定点突变法的盲目性。因此，上述本发明的基因定点突变方法所用的源模板优选通过基因优化方法(参见CN1358858A专利申请)获得的突变基因序列，或者是携带有通过基因优化方法获得的突变基因序列的质粒。
按照上述本发明的基因定点突变方法，以通过CN1358858A专利申请公开的基因优化方法获得的细菌EPSP合成酶基因aroA-M1(序列表中<210>1序列)作为源模板，并设计出三个与该源模板和点突变要求相对应的引物
引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′经两步PCR扩增，最终获得发生了点突变的新基因，命名为aroA-M142。aroA-M142的表达蛋白与aroA-M1基因编码的氨基酸序列相比，在位点42上，发生由蛋氨酸替代苏氨酸的变化。
aroA-M1的DNA序列及其表达蛋白的氨基酸序列分别见序列表<210>1和<210>2序列所示；aroA-M142的DNA序列及其表达蛋白的氨基酸序列分别见序列表<210>3和<210>4序列所示。
将aroA-M142基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroA-M142基因序列的质粒pET-aroA-M142。
将aroA-M1基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroA-M1基因序列的质粒pET-aroA-M1(该质粒结构参见附图4)。若直接以质粒pET-aroA-M1为源模板，按照与上述以aroA-M1为源模板相同的步骤和条件进行定点突变，则可直接得到带有发生了定点突变的新基因aroA-M142的质粒pET-aroA-M142。
将质粒pET-aroA-M142转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即可获得命名为BL21(aroA-M142)的转化子。
下面通过实施例和附图进一步详细叙述本发明
图1pET-aroA-M142质粒结构图；图2aroA-M1基因定点突变为aroA-M142的原理示意图；图3各转化子的蛋白电泳图；图4pET-aroA-M142质粒构建路线示意图；图5转化子在含30mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线；图6转化子在含60mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线。
具体实施例方式
实施例1突变EPSP合成酶基因aroAM142及其表达载体pET-aroA-M142的获得利用前面所述的基因定点突变法，使aroAM1基因序列124-126位置发生ACC→ATG的变化，使其表达的EPSP合成酶蛋白的第42位氨基酸残基发生Thr→Met的置换。
定点突变原理如图2所示。图2中primer1、primer2和primer3分别代表引物A、引物B和引物C；ACC代表源模板上原有序列，ATG代表突变后序列；NcoI和NdeI分别代表酶切位点。
具体操作方法如下直接以质粒pET-aroA-M1为源摸板。
由于aroAM1基因上距离编码酶蛋白的第42位氨基酸残基的124-126核苷酸序列约20个bp处，有一NdeI酶切位点。通过两轮引物重叠的PCR扩增反应，把点突变序列和酶切位点引入扩增产物中，再通过扩增产物与pET-aroA-M1质粒DNA之间酶切片段的互换，完成定点突变的操作。根据aroAM1基因的结构特点，我们设计了下列三个引物引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′其中，引物A根据aroA-M1的5′端序列设计，引物B和引物C根据aroAM1基因DNA序列118-150bp而设计，引物B、C之间有19个碱基的重叠；引物A、C的下划线处，分别代表NcoI和NdeI酶切位点，引物B中的加黑斜体(CAT)处，表示在PCR扩增产物中引入的突变序列。
需要通过两次PCR扩增反应才能完成突变。
第一次PCR反应以约102-104拷贝pET-aroA-M1质粒模板DNA、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、引物A和B各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。
反应条件为[1]94℃ 5分钟[2]循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次[3]72℃ 10分钟扩增反应完毕，走1％琼脂糖凝胶电泳并使用“QIAquick Gel Extration Kit＂分离纯化大小约为130bp的PCR扩增产物，该扩增产物应含有点突变序列。
取约102-104拷贝上述扩增产物作为第二轮PCR反应的模板，并以1×TaqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200μmol/L，引物A和C各20pmol，TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。反应条件同上。反应完毕，经1％琼脂糖凝胶电泳检验证明获得大小约为150bp的片段，该片段既带有突变序列，又带上NdeI酶切位点序列。
表达载体pET-aroA-M142的构建路线如图4所示。图中所标A片段，代表经上述两步PCR扩增而获得的片段，其上带有NcoI和NdeI酶切位点；B片段代表pET-aroA-M1上的NcoI和NdeI酶切位点间的片段。将PCR扩增而获得的A片段用“QIAquick Gel Extration Kit＂分离纯化，用NcoI和NdeI双酶切处理，并用“QIAquick Gel Extration Kit＂分离纯化酶切产物。同时，用NcoI和NdeI双酶切pET-aroA-M1质粒DNA，走1％琼脂糖凝胶电泳并使用“QIAquick Gel Extration Kit＂分离纯化载体大片段，弃B片段。按载体∶插入片段＝1∶3的比例混合上述PCR扩增后的酶切片段和载体，用T4连接酶在16℃连接12小时，获得的表达载体命名为pET-aroA-M142，其结构如图1所示。pET-aroA-M142上携带的突变的aroA基因命名为aroA-M142。
本实施例中，若以aroA-M1基因片段代替pET-aroA-M1质粒(作为源摸板)，其余步骤和条件相同，则最终得到的是发生了定点突变的基因片段aroA-M142。再将aroA-M142基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroA-M142基因序列的质粒(表达载体)pET-aroA-M142。实施例2转化子BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroAM142)的获得分别取质粒pET-aroA-M1、pET-EcaroA(参见CN1358858A专利申请)和pET-aroA-M142用标准氯化钙转化法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的转化子分别命名为BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroA-M142)。实施例3转化子BL21(aroAM1)、BL21(EcaroA)和BL21(aroAM142)的草甘膦抗性检验将转化子BL21(aroAM1)、BL21(aroAM142)和BL21(EcaroA)分别接种到含有1mM IPTG、50μg/ml氨卞青霉素以及30mM和60mM草甘膦的M9液体培养基中，以200rpm、37℃空气浴的条件培养。每隔2小时测定一次培养液OD600，记录其生长情况，测定结果如图5、图6所示。从图中的生长曲线可以看出，携带突变基因的转化子在含有60mM草甘膦的M9基本培养基上仍能生存，并且BL21(aroAM142)比BL21(aroAM1)生长速度更快，滞后期更短，显示出对草甘膦抗性的提高(图6)；携带有野生型基因的转化子BL21(EcaroA)在含有30mM的草甘膦的M9基本培养基上的生长已受到严重的抑制(图5)。由此可见，突变子的抗草甘膦能力比野生型有了明显提高，而定点突变可使转化子的抗性进一步增强。实施例4突变EPSP合成酶基因DNA序列的测定和比较本发明使用ABI 377型测序仪，测定了aroA-M1和aroA-M142的完整DNA序列并作比较，具体序列见序列表。其中，序列<210>1和<210>2代表aroA-M1的DNA序列和表达蛋白的氨基酸序列，序列<210>3和<210>4代表aroA-M142的DNA序列和表达蛋白的氨基酸序列。
aroA-M142所编码的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶与aroA-M1基因所编码的EPSP合成酶的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置换苏氨酸42→蛋氨酸。
从测序结果亦可见，酶蛋白的突变，是由于氨基酸的置换而非由于氨基酸的增加或缺失而引起的。并且，发生置换的氨基酸，并不包含在前人报导的与酶的活性中心或酶与底物(包括PEP，S-3-P和草甘膦)的结合位点相关的氨基酸中。根据前人的研究推测，K22，R27，G96，R100和P101等氨基酸是酶与底物S-3-P结合的相关位点；而H385，C408和K411等氨基酸则和酶与PEP的结合有关。并且，本发明所涉及的氨基酸置换，也未见有关其在草甘膦抗性中起重要作用的报导。实施例5转化子蛋白质表达情况的分析和EPSP合成酶粗提物的制备分别用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基培养转化子BL21(aroA-M1)、BL21(aroA-M142)及BL21(EcaroA)，以200rpm、37℃空气浴的条件至细胞浓度达108/ml，以1％的接种量，转接到新鲜的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基中，200rpm、37℃继续培养至OD600＝0.75时，加入IPTG至1mM以诱导重组蛋白的合成。200rpm、30℃继续培养三小时。离心收取菌体。用缓冲液A(50mM Tris-Cl，0.1mM DTT，pH7.2)重悬菌体。细胞悬液置-70℃冻结，再在室温中重融。然后用Fluko公司的乳化机处理细胞悬液使其破壁。以12000rpm离心30分钟，弃去细胞碎片。上清液即为EPSP合成酶粗提物，可用于有关该酶的各项指标的测定。各转化子蛋白表达情况见图3所示，标示M道为蛋白标准物，1、2、3道，分别代表BL21(EcaroA)诱导前、诱导表达后和蛋白粗提物的情况；4、5、6代表BL21(aroA-M1)的相应情况；7、8、9代表BL21(aroA-M142)的相应情况。从蛋白图谱可见，经IPTG诱导之后，在所有转化子的蛋白样品中均检测到了EPSP合成酶42KD的特异性蛋白带(如图中箭头所指位置)，并且，在相同培养条件下，各转化子对EPSP合成酶的表达水平没有明显不同。该结果显示，对草甘膦抗性的差异，不是由于EPSP合成酶的表达水平的差异而引起的。实施例6EPSP合成酶活力及米氏常数的测定EPSP合成酶活力的测定采用Lanzetta所述的孔雀绿显色定量测定无机磷的方法。反应系统含有50mM Hepes/NaOH，pH7.2，1mM PEP，1mM S-3-P，0.1mM(NH4)Mo7O24·4H2O。各组分按量加好后，先在30℃预热5分钟，然后加入适量上述粗提酶液，酶反应持续20分钟，即加入孔雀绿溶液终止反应。精确反应60秒，立刻加入34％柠檬酸钠溶液，混匀后静置15分钟，测定OD660，所用的空白对照管的成分与反应管起始成分相同，区别在于没有酶作用的时间，即加入酶液后，立刻加入孔雀绿溶液，其它各步操作与酶反应管相同。
米氏常数的测定，采用传统的双倒数作图法。测定结果如表一所示。表一Specific activityaKm(PEP)bKi(Glyphosate)cEnzymes(nkat/mg protein) (μmol/L) (μmol/L)EcaroA0.126±0.0078 22.28±6.26 1.48±0.459aroA-M1 0.961±0.0622.7±0.81 4.9903±1.546aroA-M142 1.102±0.1760.335±0.06 4.04±0.67说明a.酶的比活，是在底物过量的条件下，即在含1.0mMPEP和0.5mM S-3-P的反应系统中测定的酶的比活力。
b.表示底物之一PEP所对应的米氏常数，反应系统中，S-3-P的含量固定在0.5mM，而PEP则取由1μmol/L至50μmol/L的一系列变化值。
c.表示PEP的竞争性抑制剂草甘膦与酶的解离常数。
d.以上各数据均为对两批EPSP合成酶粗提物，各测定三次后获得。
发明人在CN 1358858A专利申请中公开了一种新颖独特而简便高效的基因优化方法；并以此方法获得了多个发生多点突变的，具有较强草甘膦抗性的EPSP合成酶基因。其编码的酶具有比野生型低得多的K[PEP]，而K[Glyphosate]却明显增加；既提高了酶的催化效率，又减低了酶与草甘膦的亲和力，使该酶抵御草甘膦的能力大幅度提高。本发明在此基础上，通过对各突变基因的序列分析，选定突变位点，并建立了独特的定点突变方法，对突变基因作进一步的改造。结果表明，把基因优化法与定点突变法结合使用，可建立起一套行之有效的方法，人为增大正向突变的几率，使对目标基因进行改造的速度和准确度都得到相应的提高。
本发明以利用基因优化的方法(具体方法见CN 1358858A)获得的高抗性的突变子aroA-M1为材料，运用独特的基因定点突变法，对aroA-M1作进一步的改造，使其表达蛋白的第42个氨基酸残基发生苏氨酸→蛋氨酸的突变，产生的突变体命名为aroA-M142。aroA-M142的Ki[Glyphosate]比野生型的提高了2.73倍，而K[PEP]却仅为野生型的1.5％，并且aroA-M142的Ki[Glyphosate]/K[PEP]值比大肠杆菌的增大了183倍。由此可见，EPSP合成酶蛋白的第42个氨基酸残基，是与酶活性及酶与底物相互作用中起重要作用的位点。并且，该氨基酸位点，不包含在前人报导的与酶的活性中心或酶与底物(包括PEP、S-3-P和草甘膦)的结合位点相关的氨基酸中，也未见有关其在草甘膦抗性中起重要作用的报导。这对于研究探索酶蛋白结构与功能的关系及其应用也具有重要意义。
本发明所建立的基因定点突变法，可有效应用于对基因的定点改造，并可成为研究酶蛋白结构与功能关系的有力工具。本发明所提供的突变基因，有望成为构建抗草甘膦农作物新品种的优良材料。
序列表<110>中山大学<120>一种基因定点突变方法和以此方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体和转化子<160>4<210>1<211>1284<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1atg gaa tcc ctg acg tta caa ccc atc gct cgt gtc gat ggc act att 48Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile1 5 10 15aat ctg ccc ggt tcc aag agc gtt tct aac cgc gct tta ttg ctg gcg 96Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala20 25 30gca tta gca cac ggc aaa aca gta tta acc aat ctg ctg gat agc gat 144Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ser Asp35 40 45gac gtg cgc cat atg ctg aat gca tta aca gcg tta ggg gta agc tat 192Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr50 55 60acg ctt tca gcc gat cgt acg cgt tgc gaa att atc ggt aac ggc ggt 240Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly65 70 75 80cca tta cac gca gaa ggt gcc ctg gag ttg ttc ctc ggt aac gcc gga 288Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly85 90 95acg gca atg cgt ccg ctg gcg gca gct ctt tgt ctg ggt agc aat gat 336Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp100 105 110att gtg ctg acc ggt gag ccg cgt atg aaa gaa cgc ccg att ggt cat 384Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His115 120 125ctg gtg gat gcg ctg cgc ctg ggc ggg gcg aag atc act tac ctg gaa 432Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu130 135 140caa gaa aat tat ccg ccg ttg cgt tta cag ggc ggc ttt act ggc ggc 480Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly145 150 155 160aac gtt gac gtt gat ggc tcc gtt tcc agc caa ttc ctc acc gca ctg 528Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu
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1.一种基因定点突变的方法，其特征是选用具有如下结构特点的DNA序列作源模板需突变的位点与一单酶切位点相距10-20个碱基；根据该源模板序列设计一个5′端引物和两个3′端引物；两个3′端引物间有10-20个碱基的重叠序列，并且其一带有需要在扩增产物中引入的突变序列，另一带有需要在扩增产物中引入的酶切位点；由5′端引物和带有突变序列的3′端引物进行第一轮PCR扩增反应，把突变位点引入扩增产物；再以此扩增产物为模板，利用原5′端引物和带有酶切位点的3′端引物进行第二轮扩增，把酶切位点引入到前述带突变位点的序列的3′端；再通过酶切片段的互换，用该序列取代源模板上的相应序列，实现定点突变。
2.按照权利要求1所述的基因定点突变方法，其特征是所用PCR扩增方法的具体反应条件和操作步骤如下第一步扩增反应以源模板DNA 102-104拷贝、1×TaqDNA聚合酶缓冲液、4种dNTP各200μmol/L、5′-端引物A和3′-端引物B各20pmol以及TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统；反应程序及参数为[1]94℃ 5分钟[2]循环94℃ 90秒，55℃ 60秒，72℃ 30秒，循环30次[3]72℃ 10分钟扩增反应完毕，走1％琼脂糖凝胶电泳并用“QIAquick Gel Extration Kit”分离纯化大小约为130bp的PCR扩增产物，该扩增产物含有点突变序列；第二步扩增反应取102-104拷贝上述扩增产物作为第二轮PCR反应的模板，并以1×TaqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200μmol/L，5′-端引物A和3′-端引物C各20pmol，TaqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统；反应程序及参数同第一步扩增反应；反应完毕，再通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化扩增产物，与源模板分别进行酶切，把带突变序列的新片段，连接到源模板上的相应位置，从而实现定点突变。
3.根据权利要求1或2所述的基因定点突变方法，其特征是所用的源模板是通过基因优化方法获得的突变基因序列。
4.根据权利要求1或2所述的基因定点突变方法，其特征是所用的源模板是带有经基因优化法获得的突变基因序列的质粒。
5.根据权利要求3所述的基因定点突变方法，其特征是所用的源模板是通过基因优化方法获得的细菌EPSP合成酶基因aroA-M1；根据该源模板设计的一个5′端引物和两个3′端引物序列如下引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATTAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′最终获得发生定点突变的EPSP合成酶基因。
6.根据权利要求4所述的基因定点突变方法，其特征是所用的源模板是带有经基因优化法获得的细菌EPSP合成酶基因aroA-M1的质粒；根据该源模板设计的一个5′端引物和两个3′端引物序列如下引物A5′-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3′引物B5′-CACGTCATCGCTATCCAGCAGATTCATIAATAC-3′引物C5′-GGAATTCCATATGGCGCACGTCATCGCTATCCAGC-3′最终获得带有发生了定点突变的EPSP合成酶新基因的质粒。
7.由权利要求5所述方法获得的，命名为aroA-M142的DNA序列，其特征是其表达蛋白与aroA-M1基因编码的氨基酸序列相比，在位点42上，发生由蛋氨酸替代苏氨酸的变化。
8.含有权利要求7所述的aroA-M142基因序列的质粒pET-aroA-M142，其特征是aroA-M142基因片段插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间。
9.具有草甘膦抗性的转化子BL21(aroA-M142)，由权利要求8所述质粒pET-aroA-M142转化大肠杆菌BL-21(DE3)而获得。
全文摘要
本发明涉及一种基因定点突变方法和通过该方法获得的重组aroA基因、以及含有此基因的载体和转化子。本方法选用“需突变的位点与一单酶切位点相距10－20个碱基”的DNA序列作源模板，按源模板的序列特点设计出相对应的一个5’－端引物和两个3’－端引物，并采用两步PCR扩增反应，得到引入点突变的基因片段。运用该方法，可以人为加大发生基因突变的准确性。本发明还应用该定点突变法，把通过基因优化法获得的基因aroA－M1作进一步改良，获得活性更高而草甘膦敏感度更低的EPSP合成酶基因aroA－M142；aroAM142编码的酶具有比野生型低得多的K
文档编号C12N15/19GK1405318SQ02151910
公开日2003年3月26日 申请日期2002年11月11日 优先权日2002年11月11日
发明者何鸣, 聂燕芳, 徐培林 申请人:中山大学