编码淀粉降解酶的核酸分子的制作方法

专利名称：编码淀粉降解酶的核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码淀粉降解酶的核酸分子。此外，本发明涉及载体、用此处描述的核酸分子转化的宿主细胞和植物细胞及含有该细胞的植物。此外，描述了制备用所述核酸分子转化的转基因植物的方法。
植物器官中淀粉的降解是在若干方面影响植物产品的可用性的过程。依赖于植物物种和器官类型，人们可能想要抑制淀粉降解或相反地增加淀粉降解。淀粉降解的减少在如饲料植物中可能有益，特别是在那些通过青贮饲料或干燥来保存的植物中。淀粉含量的增加将导致干物质相当大的增加，它也将扩大C∶N比例，从而解决由狭窄的C∶N比例所导致的问题。这些问题包括发酵过程，该过程可因由于窄的C∶N比例导致的植物器官过高的pH值而发生，并可损坏青贮饲料。此外，反刍动物瘤胃中的气体聚积，尤其是那些发生于春天的，同样由在该生长期生长并给动物喂食的草中窄的C∶N比例所导致。
淀粉的减少在水果中也可能有益。在多数水果中，淀粉短暂聚积并在水果熟化中被调动，即转变为糖。如果可能抑制该淀粉降解过程，将有可能增加水果中干物质的含量。这在用于生产调味蕃茄酱的番茄的情况中特别有益，因为这将减少蒸发过度的水所另外必需的能量用量。
同样对于葡萄，淀粉降解的减少可能有益，因为增加的淀粉含量将对葡萄的糖含量产生正影响。
此外，淀粉降解的减少或抑制在马铃薯块茎中可能有益，特别是对于所谓的“冷甜化(cold-sweetening)”，其发生于块茎的贮藏低温时以抑制发芽。冷甜化归因于淀粉向葡萄糖和果糖，即所谓的还原糖的转化，后者将在油炸过程中导致不利的褐变反应。
此外，淀粉降解的减少对用于生产杂交种子而生成雄性不育植物也有益。具体地，可能通过抑制起作用的基因而特定地抑制花粉中的淀粉降解而生产雄性不育植物，这是因为花粉管的生长和卵细胞的受精在大多数植物中是由淀粉降解供能的能量依赖性过程。
另一方面，存在一些情况，其中增加植物器官中的淀粉降解有益，如当植物器官用于生产乙醇时。然而，这些情况下淀粉的降解应该仅发生于某些时间段内，即在实际的生产过程中。
因而，在某些植物或植物器官中能够修饰淀粉降解具有重要性。
然而，为了能够以正的或负的方式影响淀粉在植物中的降解，特别是通过基因工程，必需得到编码在淀粉降解中起作用的蛋白质的DNA序列，特别是在那些想要修饰其中淀粉降解的器官中。
因此，本发明根本的技术问题是提供编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子。
该问题通过提供由权利要求表征的实施方案而解决。
因此，本发明涉及编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子，该核酸分子选自(a) 编码至少蛋白质的成熟形式的核酸分子，该蛋白质包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列；(b) 包含在SEQ ID NO1、3、5或7中所示的核苷酸序列或相应的核糖核苷酸序列的核酸序列；(c) 编码蛋白质的核酸分子，其氨基酸序列与在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性；(d) 互补链与如在(a)或(b)中所限定的核酸分子杂交的核酸分子；(e) 包含编码蛋白质的生物活性片段的核苷酸序列的核酸分子，该蛋白质由如在(a)、(b)、(c)或(d)中任何一项所限定的核酸分子编码；及(f) 其核苷酸序列由于遗传密码的简并性而从如在(b)、(c)、(d)或(e)中任何一项所限定的核酸分子的序列衍生的核酸分子。
因此，本发明涉及编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子，该分子优选编码包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示氨基酸序列的蛋白质。
上述的核酸分子SEQ ID NOs1、3、5或7编码参与并强烈影响淀粉降解的蛋白质。它们是用功能性筛选试验进行鉴定和分离的，该试验采用聚积直链α-1，4-葡聚糖的大肠杆菌(E.coli)品系(参见实施例1)。利用这些分子的帮助，现在可能在植物细胞内修饰淀粉降解(正或负地)。
迄今为止，对于大多数植物器官尚未描述过编码参与淀粉降解或起始淀粉降解的酶的序列。在这点上，谷粒的胚乳是唯一得到充分理解的植物系统。对于所有其他的植物器官，迄今为止尚不知道哪个蛋白质负责淀粉降解。其中主要的原因是植物器官中主要的淀粉水解活性位于没有淀粉存在的亚细胞区室中。淀粉在质体中合成和降解。然后由淀粉水解释放的产物从质体中输出以在细胞中进一步利用。在这一点上，胚乳组织是例外，因为在熟化中它失去了其细胞和亚细胞的完整性。结果，质体外的酶可接近淀粉颗粒并可降解淀粉。
术语“参与淀粉降解”指单独的酶在淀粉分解中起作用。这种分解可以不同途径发生，如通过从淀粉中多糖链的非还原性或还原性末端去除葡萄糖残基、麦芽糖或麦芽糖寡糖。
该去除可通过如水解，即将去除的基团转移到水分子上(如内切水解酶(endohydrolase)、外切水解酶(exohydrolase))、或通过磷酸解(phosphorylysis)，即将去除的基团转移到磷酸分子上(如磷酸化酶，如从葡聚糖链的非还原性末端释放葡萄糖-1-磷酸分子的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶)而实现。
或者，该去除可通过由葡聚糖裂解酶所利用的反应机制来实现，通过该机制，优选来自葡聚糖链的非还原性末端的葡萄糖残基转变为被释放的1，5-脱水-果糖。
优选，术语“参与淀粉降解”指可在实施例1所描述的功能性试验中鉴定为具有淀粉降解活性的蛋白质。这种试验具体包含下面的步骤(a) 将编码蛋白质的核酸分子转化入大肠杆菌品系中，后者在含有葡萄糖的培养基中生长后聚积大量的α-1，4-葡聚糖，优选转化入大肠杆菌品系KV832(Kiel等人，Molecular & General Genetics 207(1987)，294-301)中，该品系是在编码糖原分支酶的glgB基因中含有插入物的突变体，并用表达具有改变的别构性质的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(pACAG；Koβmann等人，Planta 208(1999)，503-511)的质粒所转化(Creuzat-Sigal等人，在Biochemistry of the glycosidelinkage，Ed.Piras，Pontis；Academic Press，New York(1972)，647-680)；(b) 将转化的细菌涂布在含有葡萄糖的培养基并生长；(c) 用碘蒸气对细菌菌落进行染色；(d) 确定用在步骤(a)中提到的核酸分子转化的细菌菌落是否显示比未转化的对照菌落较浅的蓝色着色，或者是否它们根本不显示着色，对照菌落由于存在直链α-1，4-葡聚糖而显示用碘蒸气染色时深的蓝色着色，较浅的蓝色着色或缺乏着色指示蛋白质的淀粉或葡聚糖降解活性。
本发明特别涉及含有在SEQ ID NOs1、3、5或7中的任何一项所示的核苷酸序列或其部分的核酸分子，并优选涉及包含在SEQ IDNOs1、3、5或7中的任何一项所示的编码区或相应的核糖核苷酸序列的分子。
此外，本发明涉及编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子，且其互补链与上述分子之一杂交。
本发明也涉及编码下述蛋白质的分子，该蛋白质与在SEQ IDNO2、4、6或8中任何一项所示的完整氨基酸序列具有同源性，即具有至少40％的一致性，优选至少60％，优选至少70％，尤其优选至少80％且特别地为至少90％的一致性，该蛋白质参与淀粉降解。
本发明也涉及编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子，且其序列由遗传密码的简并性而衍生自上述核酸分子的核苷酸序列。
本发明也涉及具有与上述序列的全部或部分互补的序列的核酸分子。
描述于SEQ ID NO1的核酸序列(此处也称为CSD12)是来自马铃薯的全长cDNA序列，其具有编码277个氨基酸的多肽的831个碱基对的可读框。对氨基酸序列的计算机分析(Emanuelsson等人，Protein Science 8(1999)，978-984；http//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)鉴定了质体转运肽(plastidic transit peptide)并显示转运肽和成熟蛋白质之间的切割位点位于残基56和57之间。因而，成熟蛋白质包含221个氨基酸。预测的未加工蛋白质的分子量为31.9kDa，且预测的成熟蛋白质分子量为25.5kDa。
描述于SEQ ID NO3中的核酸序列(此处也称为CSD23)是来自马铃薯的全长cDNA克隆，包含有编码294个氨基酸的多肽的882个核苷酸的可读框。该多肽的预测的分子量为34.1kDa。
序列比较揭示除不具有任何被鉴定功能的拟南芥(Arabidopsis)EST之外与数据库中的其他已知序列不具有显著的同源性。
描述于SEQ ID NO5中的核酸序列(此处也称为SHI)是来自马铃薯的全长cDNA克隆，包含编码790个氨基酸残基的多肽的2370bp的可读框。编码的蛋白质具有86.6kDa的预测分子量。通过表达含有SHI蛋白质的前100个氨基酸和GFP蛋白质的嵌合蛋白质可显示向质体进行转位的转运肽存在于前100个氨基酸中，因为嵌合蛋白质被转运到叶绿体中了。SEQ ID NO5的核苷酸序列在核苷酸水平上显示与未鉴定的ESTs，来自番茄的(AW 093761、AW 928571、AW038351)、棉花(AW 727818)、白杨(AI 164445)、大豆(AI 988543)和玉米(AW 566133)具有一些同源性。
含有SEQ ID NO5的反义构建体的转基因马铃薯植物不再动员其叶片上过渡淀粉，导致所谓的“淀粉过剩”表型。当在大肠杆菌中表达时，当支链淀粉溶解并与表达SHI的大肠杆菌细胞提取物温育时，SHI序列(SEQ ID NO5)导致支链淀粉的快速降解。薄层层析揭示SHI活性导致不同长度的麦芽糖寡糖的释放，如麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖。
描述于SEQ ID NO7中的核酸分子显示与编码质体β-淀粉酶的序列具有同源性(Lao等人，Plant J.20(1999)，519-527)。
SEQ ID NO7是包含编码545个氨基酸残基的多肽的1635bp长的可读框的全长cDNA克隆。预测的分子量为61kD。尽管通过计算机分析不能鉴定质体转运肽，但是用来自豌豆的分离的叶绿体的输入实验显示该蛋白质事实上被输入到叶绿体中。因此，将该蛋白质称为马铃薯的质体靶向的β-淀粉酶(ppt-β-淀粉酶)。
含有SEQ ID NO7的反义构建体的转基因马铃薯植物显示所谓的“淀粉过剩”表型，这意味着它们不再能够动员在其叶片中生产的过渡淀粉。
在本发明中，术语“杂交”指在常规杂交条件(也称为“低严紧性条件”)的杂交，优选为在严紧性条件(也称为“高度严紧性条件”)下，例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中的。在一个尤其优选的含意中，术语“杂交”指在下述条件下发生的杂交杂交缓冲液2×SSC；10×Denhardt试剂(Fikoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱鱼精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液，pH7.2；1mM EDTA7％SDS杂交温度T ＝60℃洗涤缓冲液2×SSC；0.1％SDS洗涤温度T ＝60℃与本发明的核酸分子杂交的核酸分子原则上编码参与淀粉降解的来自任何表达这种蛋白质的生物的蛋白质。
与本发明的分子杂交的核酸分子可例如从植物的基因组文库或cDNA文库进行分离。或者，它们可通过基因工程或化学合成来制备。
这种核酸分子可利用本发明的分子或这种分子的部分或这种分子的反向互补物来鉴定和分离，如通过根据标准方法的杂交(参见如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)。
具有与在SEQ ID NOs1、3、5或7中所示核苷酸序列或其部分相同或基本相同的核酸分子可例如用作杂交探针。用作杂交探针的片段也可为由通常的合成技术制备的合成片段，且其序列基本上与根据本发明的核酸分子的序列一致。
与本发明的核酸分子杂交的分子也包含上述编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在此处，将片段理解为指长度足以编码所述的蛋白质之一的核酸分子的部分，其中的蛋白质优选参与淀粉降解。关于这一点，术语衍生物指与上述核酸分子在一个或多个位置有区别且显示与这种序列具有高度同源性的分子的序列。在这种情况下，同源性指至少40％的序列一致性，特别是至少60％的一致性，优选为至少65％，更优选为至少70％，更加优选为至少80％，特别为至少85％，进一步优选为至少90％，且特别优选为至少95％。最优选的同源性指至少n％的序列一致性，其中n是40和100间的整数，即40≤n≤100。上述核酸分子的衍生物，如通过缺失、替代、插入和/或重组产生。
优选，同源性的程度通过将各个序列与SEQ ID NO1、3、5或7的编码区的核苷酸序列进行比较而确定。当进行比较的序列不具有相同的长度时，同源性程度优选指与较长序列中的核苷酸残基相同的较短的序列中核苷酸残基的百分数。同源性程度可常规使用已知的计算机程序来确定，如由[在European Molecular Biology Laboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德国]Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)发布的ClustalW程序(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)。ClustalW也可从几个网址下载，包括IGBMC(Institut de Génétique et de BiologieMoléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，法国；ftp//ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和所有与EBI(European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，英国)镜像的站点。
当利用ClustalW程序版本1.8来确定一个特定的序列是否与根据本发明的参考序列具有如90％的一致性时，对于DNA比对的设置以如下的方式进行设置KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIXIUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未加权的。
对于用ClustalW程序版本1.8进行蛋白质序列比对，设置如下KTUPLE＝1，TOPDIAGS＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
此外，同源性优选地指编码的蛋白质与在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列显示至少40％的序列一致性，更优选至少60％，更加优选至少80％，特别至少90％，且特别优选至少95％序列一致性。最优选的同源性指至少n％的序列一致性，其中n是40和100间的整数，即40≤n≤100。
至于SEQ ID NO1(CSD12)，同源性优选指编码的蛋白质与SEQID NO2的氨基酸序列具有至少62.5％的序列一致性，更优选至少65％，更加优选至少70％，且特别优选至少95％。
至于SEQ ID NO3(CSD23)，同源性优选指编码的蛋白质与SEQID NO4的氨基酸序列具有至少87％的序列一致性，更优选至少90％，更加优选至少95％，且特别优选至少97％。
至于SEQ ID NO5(SHI)，同源性优选指编码的蛋白质与SEQID NO6的氨基酸序列具有至少65％的序列一致性，更优选至少75％，更加优选至少86％，进一步优选至少95％，且特别优选至少99％。
至于SEQ ID NO7，同源性优选指当与SEQ ID NO8的序列比较时，编码的蛋白质具有至少81％的序列一致性，更优选至少85％，更加优选至少95％，且特别优选至少97％。
此外，同源性指在相应的核酸分子或因而编码的蛋白质之间有功能和/或结构的同等性。与上述分子之一同源的及代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些代表具有相同生物学功能的修饰的分子的变异。它们或者是天然存在的变异，例如来自其他微生物的序列，或者是突变，且该突变可天然形成或可由专门的诱变而产生。此外，该变异可为合成生产的序列。等位基因变体可为如天然发生的变体或合成生产的变体或由重组DNA技术生产的变体。
由本发明的核酸分子之一的不同变体编码的蛋白质具有某些它们共有的特征。这些特征包括如酶活性、分子量、免疫反应性、构象等，及物理性质如在凝胶电泳中的迁移行为、层析行为、沉降系数、溶解性、光谱性质、稳定性、pH最适值、温度最适值等。
由本发明的核酸分子之一编码的蛋白质的一个特征是它们参与淀粉降解。该活性可由上述的试验进行估计。
或者，淀粉降解活性可通过用聚丙烯酰胺凝胶电泳在含有直链淀粉或支链淀粉的凝胶中于非变性条件下对表达蛋白质的细胞的蛋白质或蛋白质提取物进行分离并随后在鲁戈氏溶液中将凝胶进行染色而检验。具有淀粉降解活性的蛋白质降解存在于凝胶中的直链淀粉和/或支链淀粉，并因而导致凝胶中其位置较浅的着色。
此外，淀粉降解活性可通过将直链淀粉或支链淀粉溶液与源自要检验的表达蛋白质的细胞的提取物进行温育并随后用碘对其进行染色而证实。如果蛋白质不具有淀粉降解活性，那么溶液将显示紫色着色。如果蛋白质具有淀粉降解活性，那么看不到着色或仅可看到弱的紫色着色。
在由SEQ ID NO3(CSD23)编码的蛋白质或其同源物的情况下，编码的蛋白质具有水解活性的性质。此外，这种蛋白质特征在于它仅降解直链的非分支的葡聚糖，但不降解支链淀粉。该性质可如实施例3和7所述进行检验，如通过在不连续的PAGE中分离表达蛋白质的细胞的可溶性蛋白质组分，该PAGE用分别含有直链淀粉和支链淀粉的凝胶作为分离胶，并且用碘对凝胶进行染色。由SEQ ID NO3编码的蛋白质或其同源物仅可降解直链淀粉而不能降解支链淀粉(同样参见

图11)，这可由对凝胶的负染色来检测。
在由SEQ ID NO5(SHI)编码的蛋白质或其同源物的情况下，编码的蛋白质具有水解活性的性质。这可显示于如在实施例10和图14所述的不连续的PAGE中。这种蛋白质进一步表征为其降解支链淀粉的能力(参见图14和15)，且特别是溶解的支链淀粉。该性质可容易地通过将蛋白质与支链淀粉溶液进行温育并随后用碘对其进行染色来检验。蓝色着色的丧失指示支链淀粉的降解。此外，SHI蛋白质具有其活性导致麦芽糖寡糖从淀粉中释放的性质，优选为麦芽糖、麦芽三糖和/或麦芽四糖。这可通过将蛋白质与可溶性淀粉进行温育并用薄层层析(TLC)对淀粉降解产物进行分离来证实，如实施例3和10所述及图16所示。
SHI蛋白质同样优选具有α-淀粉酶活性。该活性可如实施例特别是实施例3和11所述进行检验。优选，通过用在非还原末端进行阻断的对硝基苯基麦芽七糖(p-nitrophenyl-maltoheptaose)作为底物并确定蛋白质是否将其用作底物来检验。
SHI蛋白质进一步优选表征为包含质体导向序列及其被转运到叶绿体中，特别是分离的叶绿体中的能力。后一性质可通过进行于实施例4和12所述的输入实验来检验。
在SEQ ID NO5的情况下，当从氨基酸序列进行计算时，编码的蛋白质(SHI)优选具有80～90kDa的分子量，优选为82～88kDa，更优选为83～87kDa，且更优选为约86kDa。
在由SEQ ID NO7(ppt-β-淀粉酶)编码的蛋白质或其同源物的情况下，编码蛋白质表征为它具有β-淀粉酶活性。该活性可如实施例3所述进行检验。优选通过估计蛋白质是否降解通过糖苷键在还原末端连接到对硝基苯基的麦芽糖寡糖。具体地，β-淀粉酶的特定底物是非阻断的对硝基苯基麦芽五糖(PNPG5)。β-淀粉酶活性也可通过将蛋白质与溶解的淀粉或与未加工的马铃薯淀粉颗粒进行温育并用薄层层析(TLC)对反应产物进行分离来检验。β-淀粉酶活性的产物仅是麦芽糖，而α-淀粉酶产生如一系列的麦芽糖寡糖(参见实施例3和图4)。
此外，根据本发明的β-淀粉酶蛋白质优选表征为包含质体靶序列和其被输入到叶绿体特别是分离的叶绿体中的能力。后一性质可通过进行如实施例4所述的输入实验来检验。
此外，编码的蛋白质，特别是由SEQ ID NO5和SEQ ID NO7编码的那些及其同源物显示如下特征性质，即其活性经过如反义方法而减少的植物显示所谓的“淀粉过剩”的表型，这意味着它们不再能够动员在其叶片中合成的淀粉(过渡淀粉)。这意味着这种植物在其叶片中显示淀粉的积累。该性质可如实施例5和13所述进行检验。具体地，将植物的源叶片在黑暗中放置不同的时间段，然后用碘进行染色以确定其淀粉含量。在黑暗中不能动员过渡淀粉的植物叶片显示蓝色着色，至少与相应的野生型植物中可能发生的相比，这些叶片中的蓝色着色较强，或长时间在黑暗中之后着色明显(参见图8、19、20和21)。
此外，叶片中过渡淀粉的聚积也可通过用酶确定叶片中淀粉的含量来进行检验。这可以如Müller-Rber等人所述(EMBO J.11(1992)，1229-1238)进行。当与相应的野生型植物的叶片相比时，其中根据本发明的SHI蛋白质或β-淀粉酶的活性减少的植物叶片优选显示淀粉含量中至少50％的增加，更优选至少100％，更加优选至少200％，甚至更优选至少400％，且特别优选至少600％(参见如图9和23)。此外，具有减少的根据本发明的SHI蛋白质或β-淀粉酶活性的植物叶片比相应的野生型植物的相应叶片可存活更长的黑暗期(参见图22)。
本发明的核酸分子可为DNA分子，如基因组DNA或cDNA。此外，本发明的核酸可为RNA分子。本发明的核酸分子可例如从天然来源获得或者可合成或通过重组技术进行生产。
本发明的核酸分子使得能够制备宿主细胞，该宿主细胞产生高纯度和/或足够量的参与淀粉降解的蛋白质，且使得可制备基因工程处理的植物，该植物具有这些蛋白质修饰的活性。在本发明的框架中，术语“高纯度”指根据本发明的蛋白质显示至少80％的纯度程度，优选至少90％，更优选至少95％。
在优选的实施方案中，本发明的核酸分子源自植物，优选源自淀粉贮藏型植物，更优选源自茄科(Solanaceae)植物，且特别优选源自马铃薯(Solanum tuberosum)。
本发明也涉及与本发明的核酸分子特异杂交的寡核苷酸。这种寡核苷酸优选具有至少10个核苷酸的长度，特别为至少15个核苷酸，且特别优选至少50个核苷酸。它们表征为它们与本发明的核酸分子特异杂交，也就是说它们不或者仅在非常小的程度上与编码其他蛋白质的核酸序列进行杂交，特别是其他的淀粉降解酶。本发明的寡核苷酸可例如用作扩增技术如PCR反应的引物，或者用作杂交探针以分离相关的基因。
此外，本发明涉及载体，特别是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其他基因技术中常用的载体，该载体含有一个本发明上述的核酸分子。在本发明优选的实施方案中，本发明的载体适合于转化植物细胞。特别优选，这种载体允许本发明的核酸分子，可能连同侧翼相接的调节区一起整合入植物细胞的基因组中。其例子为可用于土壤杆菌(Agrobacteria)介导的基因转移的二元(binary)载体，且一些该载体已商业可购得。
在另一个优选的实施方案中，将载体中含有的核酸分子连接到调节元件中以确保在原核或真核细胞中可翻译的或不可翻译的(如反义的或核酶)RNA的转录和合成。
本发明的核酸分子在原核或真核细胞中，如大肠杆菌中的表达是引起关注的，因为该表达允许对由这些分子编码的酶的生物学和/或酶学活性进行更精确的表征。此外，可能在没有干扰酶的那些原核或真核细胞中表达该蛋白质。此外，可能用分子生物学常用的方法将不同的突变插入到核酸分子中(参见如Sambrook等人，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，从而导致可能具有修饰的生物学性质的蛋白质的合成。在一方面，就此而论可能生产缺失突变体，其中核酸分子通过从编码DNA序列的5’或3’末端进行渐进的缺失而生产，且该核酸分子导致相应缩短的蛋白质的合成。例如这种核苷酸序列5’末端的缺失使得能够鉴定氨基酸序列，该氨基酸序列是可能存在并负责蛋白质的分泌或在质体、液泡、线粒体或质外体中的定位。
这允许蛋白质的专门制备，通过去除相应的序列而不再分泌而保持于相应的宿主生物的细胞内或由于其他信号序列的添加而定位于其他区室，如质体、线粒体、液泡。
另一方面，在某些位置上点突变的引入也可以考虑，在该位置上氨基酸序列的修饰可例如影响蛋白质/酶的生物学和/或酶学活性或控制。如此，例如可能生产下面的突变体，该突变体具有修饰的立体和区域选择性或修饰的Km值，或者该突变体不再受通常存在于细胞内且由别构调节或共价修饰来实现的控制机制的控制。
此外，可制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。此外，可能制备具有修饰的活性-温度特性的突变体。
此外，在植物中表达的情况下，本发明的核酸分子中的插入突变使得由本发明的核酸分子编码的蛋白质的基因表达速率和/或活性能够增加。
对于在原核细胞中的基因工程，可将本发明的核酸分子或这种分子的部分引入到质粒中，该质粒允许通过DNA序列重组进行诱变或序列修饰。标准方法(参见如Sambrook等人，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，USA)使得能够进行碱基交换或添加天然或合成的序列。DNA片段可通过向片段中应用连接物和连接体而相互连接。此外，可使用遗传工程措施提供适当的限制位点或去除多余的DNA或限制位点。在那些其中插入、缺失或替代是可能的情况下，可使用体外诱变、“引物修补”、限制或连接。通常，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
本发明的另一个实施方案涉及宿主细胞，特别是用本发明的上述核酸分子或本发明的载体转化的原核或真核细胞，且涉及从这种转化的细胞传代下来并含有本发明的核酸分子或载体的细胞。根据另一个优选的实施方案，宿主细胞是微生物细胞。在本发明的范围内，术语“微生物”包含细菌和所有如定义于Schlegel的“AllemeineMikrobiologie”(Georg Thieme Verlag，1985，1-2)的原生生物(如真菌、特别是酵母、藻类)。本发明优选的实施方案涉及藻类细胞和属于曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、糖酵母菌属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)的宿主细胞(Rodriguez，Journal of Biotechnology 33(1994)，135-146，Romanos，Vaccine，Vol.9(1991)，901以及下列等等)。本发明特别优选的实施方案涉及大肠杆菌细胞。用于生产重组蛋白质的这种宿主细胞的构建可用本领域技术人员公知的方法来实施。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的宿主细胞不显示干扰性的酶活性，如那些多糖形成和/或多糖降解酶的活性。
对不同表达系统的总的概述包含于如Methods in Enzymology153(1987)，385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456-463)，Griffiths等人(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)中。对酵母表达系统的总的概述由如Hensing等人(Antonievan Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人(Developmentsin Biological Standardization 83(1994)，13-19)，Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992)，79-93)，Fleer(Current Opinionin Biotechnology 3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion inBiotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)提供。
表达载体已广泛描述于文献中。通常，它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，而且含有细菌或病毒启动子，及大多数情况下转录的终止信号。在启动子和终止信号之间有至少一个使得编码DNA序列能够插入的限制位点或多位点接头。可将天然控制相应基因转录的DNA序列用作启动子序列，如果它在选择的宿主生物中有活性。然而，该序列也可换为其他的启动子序列。可能使用产生基因的组成型表达的启动子和允许对下游基因的表达进行专门控制的诱导型启动子。具有这些性质的细菌和病毒启动子序列详细描述于文献中。用于在微生物(例如大肠杆菌、啤酒糖酵母(S.cerevisiae))中表达的调节序列充分描述于文献中。允许下游基因特别高表达的启动子是如T7启动子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(Deboer等人，in Rodriguezand Chamberlin(Eds)，Promoters，Structure and Function；Praeger，New York，(1982)，462-481；Deboer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等人，Gene 42(1986)，97-100)。通常，蛋白质的量在微生物生长周期的从中期向上到大约对数期的结束期间最大。因此，诱导型启动子优选地用于蛋白质的合成。这些启动子经常比组成型启动子导致更高的蛋白质产量。高度组成型启动子的使用导致克隆的基因的连续转录和翻译，并因而经常导致其他基本细胞功能的能量丧失，其影响为细胞生长减慢(Bernard R.Glick/JackJ.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995)，SpektrumAkademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，Oxford，p.342)。因此，为了获得最适量的蛋白质，经常使用两个阶段的过程。首先，将宿主细胞在最适条件下培养到相对高的细胞密度。在第二个步骤中，然后依赖于所用的启动子的类型而诱导转录。关于这一点，可由乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导的tac启动子特别适合(deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)，21-25)。转录的终止信号也描述于文献中。
用编码参与淀粉降解的蛋白质的DNA的转化宿主通常可用标准方法实施，如描述于Sambrook等人(Molecular CloningALaboratory Course Manual，2ndedition(1989)Cold Spring HarborPress，New York；Methods in Yeast Genetics，A Laboratory CourseManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990)。宿主细胞在满足所用的特定宿主细胞需要的营养培养基上培养，特别是关于pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、痕量元素等。
此外，本发明涉及由本发明的核酸分子编码的蛋白质及其生物活性片段，以及其制备方法，其中根据本发明的宿主细胞在允许蛋白质合成的条件下培养，且蛋白质随后从培养的细胞和/或培养基中分离。
根据优选的实施方案，本发明的蛋白质是重组生产的蛋白质。在本发明的范围内，这是通过将编码蛋白质的DNA序列插入到宿主细胞内并在那里进行表达而制备的蛋白质。然后该蛋白质可从宿主细胞和/或培养基中分离。
本发明的核酸分子现在使得能够制备宿主细胞，该宿主细胞生产高纯度和/或足够量的本发明的重组蛋白质。在本发明的框架中，术语“高纯度”指根据本发明的蛋白质显示至少80％的纯度，优选至少90％，更优选至少95％。
由宿主细胞生产的蛋白质可用常规纯化方法进行纯化，如沉淀、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤、HPLC反相层析等。
在宿主细胞中表达的本发明的核酸分子的修饰使得能够在宿主细胞内生产多肽，该多肽由于特别的性质而较容易从培养基中分离。因而，要表达的蛋白质可作为与额外的多肽序列的融合蛋白质而表达，其特定的结合性质允许用亲和层析对融合蛋白质进行分离(如Hopp等人，Bio/Technology 6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，TrendsBiotechnol.8(1990)，88-93)。
此外，本发明也涉及特异性识别根据本发明的蛋白质的抗体。该抗体可为单克隆或多克隆抗体，且可根据本领域众所周知的方法制备。术语“抗体”也包含仍然保持了结合特异性的抗体的片段。
本发明的核酸分子的提供使得可能通过基因工程制备含有并表达本发明的核酸分子的植物细胞。
因此，本发明也涉及用本发明的核酸分子或本发明的载体转化的转基因植物细胞，或从这些细胞传代下来的转基因植物细胞，该核酸分子在允许植物细胞中可翻译的mRNA的转录的调节元件的控制之下。
本发明的蛋白质活性通过如相应核酸分子表达的引入打开了生产具有增加的淀粉降解的植物细胞的能力。因此，通过植物细胞中本发明的核酸分子的表达，可能的是表达以前不存在于野生型细胞中的淀粉降解活性，或者通过额外的表达增加已经存在于野生型细胞中的淀粉降解活性。在这点上，特别引起关注的是增加谷类的胚乳中的淀粉降解活性，特别是用于生产乙醇如啤酒的谷类中。特别地一个例子为大麦。此外，可能根据技术人员公知的方法修饰本发明的核酸分子以获得本发明的酶，该酶具有如修饰的温度依赖性或底物或产物特异性。这种方法已更详细地描述于上述不同的内容中。
将DNA插入到植物宿主细胞中可用多种技术。这些技术包括用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根病农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、注射、DNA电穿孔、用生物弹射击(biolistic)方法插入DNA和其他可能的方法。
农杆菌属介导的植物细胞转化的应用已被广泛研究，并充分描述于EP 120 516；Hoekema，InThe Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4(1993)，1-46和An等人，EMBOJ.4(1985)，277-287。关于马铃薯的转化，参见如Rocha-Sosa等人(EMBO J.8(1989)，29-33)。
单子叶植物依靠基于农杆菌属的载体的转化也已有所描述(Chan等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，491-506；Hiei等人，Plant J.6(1994)271-282；Deng等人，Science in China 33(1990)，28-34；Wilmink等人，Plant Cell Reports 11(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology13(1995)，486-492；Conner和Dormisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2(1993)，252-265)。转化单子叶植物的另一种系统为用生物弹射击方法的转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等人，Plant Mol.Biol.24(1994)317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79(1990)，625-631)、原生质体转化、部分透化的细胞的电穿孔、DNA经由玻璃纤维的插入。特别地，玉米的转化已重复描述于文献中(参见如WO 95/06128，EP 0 513 849，EP 0465 875，EP 292435；Fromm等人，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
其他类型谷类成功的转化也已有所描述，如大麦(Wan和Lemaux，如上；Ritala等人，如上；Krens等人，Nature 296(1982)，72-74)和小麦(Nehra等人，Plant J.5(1994)，285-297)。通常，植物细胞中有活性的任何启动子都适合于在植物细胞中表达核酸分子。该启动子可以以下方式进行选择，即在本发明的植物中的表达组成型发生或仅于特定的组织中、在植物发育的特定的时间或在由外部影响确定的时间发生。该启动子对于该植物可为同源或异源的。
适当的启动子为如花椰菜花叶病毒的35S RNA的启动子(参见如US-A-5,352,605)和导致其自身组成型表达的泛素-启动子(参见如US-A-5,614,399)、导致其自身在马铃薯的块茎中特异性表达的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)或确保仅在光合活性组织中表达的启动子，如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)2445-2451)、Ca/b-启动子(参见如US-A-5,656,496，US-A-5,639,952，Bansal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，3654-3658)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)SSU启动子(参见如US-A-5,034,322；US-A-4,962,028)或确保胚乳特异性表达的启动子，如来自小麦的谷蛋白启动子(HMW启动子)(Anderson，Theoretical and Applied Genetics 96，(1998)，568-576，Thomas，Plant Cell 2(12)，(1990)，1171-1180)、来自水稻的谷蛋白启动子(Takaiwa，Plant Mol.Biol.30(6)(1996)，1207-1221，Yoshihara，FEBS Lett.383(1996)，213-218，Yoshihara，Plant andCell Physiology 37(1996)，107-111)、来自玉米的shrunken启动子(Maas，EMBO J.8(11)(1990)，3447-3452，Werr，Mol.Gen.Genet.202(3)(1986)，471-475，Werr，Mol.Gen.Genet.212(2)，(1988)，342-350)、USP启动子、菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)，3320-3324，Bustos，Plant Cell 1(9)(1989)，839-853)或来自玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen等人，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)。然而，也可使用仅在通过外部影响确定的一个时间点活化的启动子(参见如WO 93/07279)。就此而论，允许简单诱导的热休克蛋白的启动子可具有特别的重要性。此外，可使用种子特异性启动子如来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，该USP启动子确保在蚕豆和其他植物中的种子特异性表达(Fiedler等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；Bumlein等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。此外，也可使用果实特异性的启动子，如WO91/01373中所述的。
此外，可存在终止序列，该终止序列用于正确地终止转录并向转录物添加聚腺苷酸尾巴，该尾巴据信具有使转录物稳定的功能。这种元件描述于文献中(参见如Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)并可随意替代。
本发明的转基因植物细胞与其他的天然存在的植物细胞可通过它们含有本发明的核酸分子的事实而区别开来，该核酸分子或者不天然存在于这些细胞中，或者如果天然存在于这些细胞中时，通过它们含有这种核酸分子的一个额外拷贝或多数额外拷贝而区别开来，这些拷贝在它/它们天然存在/不存在的位点整合入基因组。这可通过如DNA印迹分析来证实。此外，本发明的这种转基因植物细胞与天然存在的植物细胞区别在于它们含有至少一个稳定整合入其基因组的本发明的核酸分子的拷贝。
此外，本发明的植物细胞优选与天然存在的植物细胞区别在于至少一个下述性质如果插入的本发明的核酸分子对于植物细胞是异源的，那么转基因植物细胞就具有所插入的本发明的核酸分子的转录物。后者可通过如RNA印迹分析来检测。本发明的植物细胞优选地含有由所插入的本发明的核酸分子编码的蛋白质。这可通过如免疫方法来显示，特别是通过蛋白质印迹分析。
当与相应的野生型细胞相比时，根据本发明的植物细胞优选显示来自本发明的核酸分子的转录物至少10％的量增加，优选至少20％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％且甚至更优选至少100％的。
而且，当与相应的野生型细胞相比时，根据本发明的蛋白质的量在该植物细胞中显示至少10％，优选至少20％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％且甚至更优选至少100％的增加。
在优选的实施方案中，当与相应的野生型细胞相比时，根据本发明的植物细胞进一步表征为它们显示根据本发明的蛋白质的活性中至少10％，优选至少20％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％且甚至更优选至少100％的增加。淀粉降解活性可如上所述进行确定。
可根据本领域技术人员公知的方法将转基因植物细胞再生为完整植物。
本发明也涉及通过再生本发明的转基因植物细胞可获得的植物。此外，它涉及含有上述转基因植物细胞的植物。
转基因植物原则上可为任何植物物种的植物，也就是说，它们可为单子叶和双子叶植物。该植物优选为人们为了经济目的、特别是为了营养或技术、特别为了工业目的而培养的有用植物，例如用于生产乙醇的植物。它们优选为贮藏淀粉的植物，例如谷类物种(黑麦、大麦、燕麦、小麦、谷子、西米等)、水稻、豌豆、marrow pea、木薯(cassava)和马铃薯；番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆或木薯(arrowroot)、纤维形成植物(如亚麻、大麻、棉花)、贮藏油的植物(如油菜、向日葵、大豆)和贮藏蛋白质的植物(如豆科植物、谷类、大豆)。本发明也涉及水果植物或树和棕榈，如葡萄。此外，本发明涉及饲料植物(如饲料和牧场植物如草、苜蓿、三叶草、黑麦草(ryegrass))和蔬菜植物(如马铃薯、莴苣、菊苣)和装饰植物(如郁金香、风信子)。优选贮藏淀粉的植物。特别优选甘蔗和甜菜及马铃薯植物、玉米、水稻、小麦和番茄植物。
在植物中表达核酸分子，原则上存在如下可能性，即合成的蛋白质可定位于植物细胞的任何区室(如细胞质、质体、液泡、线粒体)或植物的任何区室(如质外体)中。为了实现在特别的区室的定位，编码区在需要时必须连接确保在相应区室定位的DNA序列。所用的信号序列必须各自以与编码酶的DNA序列相同的读框安排。
为了确保在质体中的定位，可能使用下面的转运肽之一在Jansen等人(Current Genetics 13(1988)，517-522)中包含的菠菜的质体铁氧化还原蛋白NADP+氧化还原酶(FNR)的转运肽。特别地，可使用在此处公开的cDNA序列的核苷酸-171～165范围的序列，该序列包含5’非翻译区及编码转运肽的序列。另一个例子是玉米蜡质蛋白质的转运肽，该转运肽包括成熟蜡质蛋白质的前34个氨基酸残基(Klsgen等人，Mol.Gen.Genet.217(1988)，155-161)。也可能使用不具有成熟蛋白质的前34个氨基酸的该转运肽。此外，可使用核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(Wolter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Nawrath等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，12760-12764)的、NADP苹果酸脱氢酶的(Gallardo等人，Planta 197(1995)，324-332)的、谷光甘肽还原酶的(Creissen等人，Plant J.8(1995)，167-175)的或R1蛋白质(Lorberth等人，NatureBiotechnology 16，(1988)，473-477)的信号肽。
为了确保在液泡中的定位，可考虑使用下面的转运肽之一patatin蛋白质的N-末端序列(146个氨基酸)(Sonnewald等人，Plant J.1(1991)，95-106)或由Matsuoka und Neuhaus，Journal ofExperimental Botany 50(1999)，165-174；Chrispeels und Raikhel，Cell 68(1992)，613-616；Matsuoka und Nakamura，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 88(1991)，834-838；Bednarek und Raikhel，Plant Cell 3(1991)，1195-1206；Nakamura und Matsuoka，Plant Phys.101(1993)，1-5所描述的信号序列。
为了确保在线粒体中的定位，可以例如考虑使用由Braun等人(EMBO J.11，(1992)，3219-3227)描述的转运肽。
为了确保在质外体中的定位，可以考虑使用下面的转运肽之一蛋白酶抑制剂II-基因(Keil等人，Nucleic Acid Res.14(1986)，5641-5650；von Schaewen等人，EMBO J.9(1990)，30-33)的、来自解淀粉欧文氏杆菌(Erwinia amylovora)的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(Geier和Geider，Phys.Mol.Plant Pathol.42(1993)，387-404)的、来自马铃薯(Solanum tuberosum)的编码前33个氨基酸的patatin基因B33片段(Rosahl等人，Mol Gen.Genet.203(1986)，214-220)的或一个由Oshima等人(Nucleic Acid Res.18(1990)，181)描述的信号序列。
在SEQ ID Nos1、5和7中显示的核酸序列编码质体蛋白质。
本发明的进一步的主题是生产用本发明的核酸分子进行基因工程改造的转基因植物细胞和转基因植物的方法，且与非转化的野生型细胞/非转化的野生型植物相比，该细胞和植物显示增加的淀粉降解活性。在该方法中，由本发明的核酸分子编码的蛋白质的表达和/或活性与相应的野生型细胞/野生型植物相比是增加的。特别地，这种方法包含根据本发明的核酸分子在植物细胞中的表达。根据本发明的核酸分子优选连接确保其在植物细胞中的表达的启动子。在特别优选的实施方案中，该方法包含将根据本发明的核酸分子引入到植物细胞中并从该细胞再生植物。
表达的增加可如通过RNA印迹分析或蛋白质印迹分析来检测。活性的增加可通过检验源自植物细胞的蛋白质提取物的淀粉降解活性来检测。淀粉降解活性例如可如上所述或如本申请的实施所述例进行测量。
本发明也涉及本发明植物的繁殖材料。术语“繁殖材料”包含那些适用于无性或有性繁殖地产生后代的植物成分。无性繁殖的适当方法为如扦插、愈伤组织培养、根状茎或块茎。其他的繁殖材料包括如果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。优选的繁殖材料是块茎和种子。本发明也涉及本发明的植物的可收获部分，如果实、种子、块茎或根状茎。
此外，在根据本发明的核酸分子的协助下，目前也可能生产具有减少的根据本发明的蛋白质的活性的植物细胞和植物，并从而导致淀粉降解的减少。该活性的减少可例如通过本发明的核酸分子的反义表达、适当的核酶的表达、共抑制作用、RNA干涉、通过所谓的“体内诱变”、抗体表达或通过显性失活突变体的表达来实现。优选地，活性的减少通过抑制编码本发明的淀粉降解酶的内源基因的表达而实现。
术语“淀粉降解的减少”优选指与相应的野生型细胞相比时，至少一种本发明的核酸分子的转录物的数量减少至少10％，更优选至少20％，更加优选至少50％，甚至更加优选至少70％，且特别优选至少90％。
在另一个优选的实施方案中，术语“淀粉降解的减少”指与相应的野生型细胞相比时，至少一种本发明的蛋白质的量减少至少10％，更优选至少20％，更加优选至少50％，甚至更加优选至少70％，且特别优选至少90％。
此外，“淀粉降解的减少”优选指与相应的野生型植物相比时，淀粉降解在基本所有的细胞、器官、组织或植物部分中减少了或仅在某些细胞、器官、组织或植物部分中减少。减少最优选指与相应的野生型细胞相比时，至少一种本发明的淀粉降解酶的活性减少至少10％，更优选至少20％，更加优选至少50％，特别为至少70％，且最优选至少90％。在特别优选的实施方案中，植物细胞或植物中的淀粉降解被完全抑制。本发明的蛋白质的淀粉降解活性可如实施例所述进行确定。
关于由SEQ ID NO7或其同源物编码的根据本发明的蛋白质，显示这种蛋白质活性减少，优选低于在低于相应野生型植物中可检测水平的约50％的水平的转基因植物展示至少一种下面的特征(i) 源叶片当在黑暗中保存不同时间间隔时，与在相同条件下培养的相应野生型植物的叶片相比具有较高的淀粉含量(即淀粉降解减少了)；(ii) 植物的源叶片当生长于光照中时，与在相同条件下生长的相应野生型植物的叶片相比具有较高的淀粉含量，特别是它们具有野生型植物的至少150％，更优选至少180％，且更加优选至少240％的淀粉含量。
关于由SEQ ID NO5或其同源物编码的根据本发明的蛋白质，与相应野生型植物相比显示减少这种蛋白质活性的转基因植物展示至少一种下面的特征(i) 源叶片当在黑暗中保存不同时间间隔时，与在相同条件下培养的相应野生型植物的叶片相比具有较高的淀粉含量(即淀粉降解减少了)；(ii) 植物的源叶片当生长于光照中时，与在相同条件下生长的相应野生型植物的叶片相比具有较高的淀粉含量，特别是它们具有野生型植物的至少300％，优选至少350％，更优选至少400％，更加优选至少600％，且特别优选至少800％的淀粉含量；(iii) 这些植物的叶片与来自相应的野生型植物的叶片相比在黑暗中可存活更长时间。
编码反义RNA的DNA分子以及这些反义分子也是本发明的目的，该反义RNA与本发明的DNA分子的转录物或相应基因组序列的内含子序列互补。为了在植物细胞转录中导致反义作用，这种DNA分子具有至少15bp的长度，优选长度超过100bp且最优选长度超过500bp，但通常短于5000bp，优选短于2500bp。
本发明进一步涉及在植物细胞表达中导致RNA合成的DNA分子，该RNA由于共抑制作用减少编码所述蛋白质的本发明的核酸分子的表达。这种DNA分子可包含本发明核酸分子的编码区或其部分和/或相应基因组序列的内含子序列。本发明也涉及由此编码的RNA分子。共抑制的一般原则和相应方法为本领域技术人员众所周知，并描述于如Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990)，340-344)、Niebel等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103)、Flavell等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-56)、Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159)、Vaucheret等人(Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317)和de Borne等人(Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)、Smith(Curr.Biol.7(1997)，R793-R795)和Taylor(Plant Cell 9(1997)，1245-1249)。
为了以上述的反义方法或用共抑制方法在植物细胞中抑制根据本发明的核酸分子的表达，优选使用显示与编码根据本发明的蛋白质的相应内源存在的基因的核苷酸序列具有至少90％的同源性程度的DNA分子，更优选至少93％，更加优选至少95％，且最优选至少98％。
本发明另外涉及编码RNA的DNA分子，该RNA当在植物细胞中表达后导致本发明的编码所述蛋白质的核酸分子的表达由于RNA干涉(RNAi)而减少。编码的RNA同样属于本发明的范围。
与用反义技术相似的作用可通过生产表达适当的以介导RNA干涉(RNAi)作用的构建体的植物转基因植物而实现。因而，双链RNA的形成导致以序列特异方式抑制基因表达。更具体地，在RNAi构建体中，包含要失活的基因编码区的有义部分(或其具有或不具有非翻译区的部分)由相应的反义序列部分相继。在两个部分之间，可插入不必源自相同基因的内含子。在转录后，RNAi构建体形成了典型的发夹结构。与本发明的方法一致，RNAi技术可如由Smith(Nature 407(2000)，319-320)或Marx(Science 288(2000)，1370-1372)所述进行实施。
在进一步的实施方案中，本发明涉及编码具有核酶活性的RNA分子的DNA分子以及这些编码的RNA分子，该RNA分子特定地切割本发明的DNA分子的转录物。
核酶是能够切割RNA分子和特定的目标序列的催化活性的RNA分子。依靠重组DNA技术，可能改变核酶的特异性。有多种类型的核酶。对于目标在于对某些基因的转录物的进行特定切割的实践应用，优选使用两种不同类型的核酶的代表物。第一类由属于I组内含子核酶类型的核酶组成。第二组由展示作为特有的结构特征，所谓的“锤头”基元的核酶组成。对目标RNA分子的特异性识别可通过改变该基元侧翼的序列而修饰。通过与目标分子中序列的碱基配对，这些序列确定发生催化反应并因而切割目标分子的位置。由于对于有效切割的序列要求低，所以原则上可能对实际上每一种所需RNA分子开发特定的核酶。
为了生产编码特异性切割本发明DNA分子转录物的核酶的DNA分子，可例如将编码核酶催化结构域的DNA序列在两侧与目标酶序列的同源DNA序列进行连接。例如编码催化结构域的序列可为SCMo病毒的卫星DNA的催化结构域(Davies等人，Virology 177(1990)，216-224)或TobR病毒的卫星DNA的催化结构域(Steinecke等人，EMBO J.11(1992)，1525-1530；Haseloff和Gerlach，Nature 334(1988)，585-591)。催化结构域侧翼的DNA序列优选源自本发明上述的DNA分子。核酶表达的一般原则和方法描述于如EP-B1 0 321 201中。植物细胞中核酶的表达描述于如Feyter等人(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338)中。
植物细胞中根据本发明的蛋白质活性的减少也可通过所谓的“体内诱变”(也已知为“杂合体(chimeraplasty)”)来实现。在该方法中，将杂交的RNA/DNA寡核苷酸杂合体引入到细胞中(Kipp等人，PosterSession at the 5th International Congress of Plant Molecular Biology，1997年9月21日-27日，新加坡；Dixon和Arntzen，“转基因植物中的代谢工程(Metabolic Engineering in Transgenic Plants)”Keystone研讨会上的会议报告，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15(1997)，441-447；国际专利申请WO 95/15972；Kren等人，Hepatology25(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等人，Science 273(1996)，1386-1389；Zhu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)，8768-8773)。RNA/DNA寡核苷酸的DNA成分的一部分与在植物细胞中内源存在的且编码根据本发明的蛋白质的核苷酸序列同源，但展示突变或在同源区内包含异源部分。由于与内源序列同源的RNA/DNA寡核苷酸区域与这些序列的碱基配对，并伴随着同源重组，所以在寡核苷酸的DNA成分中含有的突变可引入到植物细胞基因组中。这导致根据本发明的蛋白质的活性的减少。
此外，编码特异性识别植物细胞中根据本发明的蛋白质，即这种蛋白质的特定片段或抗原决定部位的抗体的核酸分子可用于抑制该蛋白质的活性。这些抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。单克隆抗体可通过如最初在Khler和Milstein(Nature 256(1975)，495)和Galfré(Meth.Enzymol.73(1981)3)中描述的技术来制备，该方法包含将小鼠骨髓瘤细胞与源自被免疫的哺乳动物的脾细胞融合。此外，针对前述肽的抗体或其片段可通过用描述于如Harlow和Lane“Antibodies，A LaboratoryManual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中的方法获得。抗体或抗体样分子的在植物中的表达可通过本领域众所周知的方法实现，如全长的抗体(Düring，Plant.Mol.Biol.15(1990)，281-293；Hiatt，Nature 342(1989)，469-470；Voss，Mol.Breeding 1(1995)，39-50)、Fab-片段(De Neve，Transgenic Res.2(1993)，227-237)、scFvs(Owen，Bio/Technology 10(1992)，790-794；Zimmermann，Mol.Breeding 4(1998)，369-379；Tavladoraki，Nature 366(1993)，469-472)和dAbs(Benvenuto，Plant Mol.Biol.17(1991)，865-874)已成功地表达于烟草、马铃薯(Schouten，FEBS Lett.415(1997)，235-241)或拟南芥(Arabidopsis)中，达到了高达总蛋白质6.8％的表达水平(Fiedler，Immunotechnology 3(1997)，205-216)。
此外，编码根据本发明的蛋白质的突变型的核酸分子可用于干扰野生型蛋白质的活性。这种突变型优选丧失其淀粉降解活性并可通过在蛋白质的氨基酸序列中缺失、替换和/或添加氨基酸的途径衍生自相应的野生型蛋白质。这种蛋白质的突变型除丧失激酶活性之外，可显示增加的底物亲和力和/或升高的细胞内稳定性，例如归因于插入了在细胞环境中使蛋白质稳定的氨基酸。这些突变型可为天然存在的，或优选为遗传改造的突变体。
此外，对于本领域技术人员显而易见的是上述的反义、核酶、RNA干涉、共抑制、体内诱变、抗体表达和显性突变作用也可用于减少如下基因的表达编码调节蛋白质如控制本发明的蛋白质表达的转录因子或如对于本发明蛋白质的活化所必需的蛋白质的基因。
由本发明的公开内容同样显而易见的是上述策略的任何组合都可用于生成转基因植物，该转基因植物由于在其细胞中有一和多种上述外源核酸分子而显示与相应的源植物相比减少的淀粉降解活性。这种组合可通过例如使转基因植物进行杂交而将相应的核酸分子(共)转化入植物细胞、植物组织或植物中而完成，该转基因植物已通过本发明的上述方法的不同实施方案而生成。同样地，用本发明的方法可获得的植物可与其他转基因植物进行杂交，从而获得增加的淀粉积累和其他遗传改造的性状的组合，如逆境耐受性或修饰的淀粉生物合成。
在进一步的实施方案中，本发明涉及含有上述DNA分子的载体，该DNA分子在植物中的表达导致本发明的蛋白质活性的减少，具体涉及其中所述DNA分子与确保其在植物细胞中转录的调节元件连接的载体。
此外，本发明涉及含有所述的DNA分子或载体的宿主细胞。该宿主细胞可为原核细胞如细菌细胞，或真核细胞。真核宿主细胞优选为植物细胞。
此外，本发明涉及转基因植物细胞，其中外源核酸分子的存在或表达导致编码根据本发明的蛋白质的内源基因表达的减少或完全抑制。
在优选的实施方案中，外源核酸分子选自(a) 编码可导致编码根据本发明的蛋白质的内源基因表达减少的反义-RNA或RNAi构建体的DNA分子；(b) 可经由共抑制作用而导致编码根据本发明的蛋白质的内源基因表达减少的DNA分子；(c) 编码核酶的DNA分子，该核酶可特异性切割编码根据本发明的蛋白质的内源基因的转录物；和(d) 经由体内诱变而引入的核酸分子，其导致在编码根据本发明的蛋白质的内源基因中的突变或异源序列的插入，从而导致根据本发明的蛋白质表达的减少或导致无活性蛋白质的合成。
这些转基因植物细胞可根据众所周知的技术再生为完整的植物。因而，本发明也涉及可通过从所述的转基因植物细胞再生而获得的植物以及含有所述的转基因植物细胞的植物。
此外，本发明涉及由所述DNA分子编码的反义RNA分子以及具有核酶活性的RNA分子和导致共抑制作用或RNA干涉的RNA分子，这些RNA分子可通过如转录而获得。
本发明进一步的主题是生产转基因植物细胞的方法，该细胞与非转化的细胞相比显示减少的淀粉降解。在该方法中，由本发明的核酸分子编码的蛋白质的量或活性在植物细胞中是减少的，该蛋白质在细胞中以内生形式存在。
在优选的实施方案中，该减少依靠反义作用实现。为此目的，本发明的DNA分子或其部分以反义的方向与确保在植物细胞中转录的启动子和可能与确保转录终止以及转录物的聚腺苷酸化的终止信号相连接。也可能使用相应的基因组序列的内含子序列。为了确保在植物中起有效反义作用，合成的反义RNA应展示最小长度为15个核苷酸，优选为至少100个核苷酸，且最优选为至少500个核苷酸。此外，编码反义RNA的DNA序列应该关于要转化的植物物种同源。
在进一步的实施方案中，由本发明的DNA分子编码的蛋白质的量减少通过核酶作用实现。核酶的基本作用以及编码这种RNA分子的DNA分子构建体已经描述如上。为了在转基因植物中表达具有核酶活性的RNA，使编码核酶的上述DNA分子与确保在植物中转录的DNA元件连接，具体而言为启动子和终止信号。在植物细胞中合成的核酶导致本发明的DNA分子转录物的切割，该转录物以内生形式存在于植物细胞中。
减少本发明核酸分子编码的蛋白质量的进一步的可能操作是共抑制。因此，通过本发明的该方法可获得的植物细胞是进一步的主题。这些植物细胞表征为其由本发明DNA分子编码的蛋白质量减少，且与野生型细胞相比它们显示减少的淀粉降解。
同样，淀粉降解的这种减少可通过在植物细胞中实施RNA干涉作用而实现。为此目的，可将编码RNAi构建体的DNA分子克隆入含有在植物细胞中表达所必需的控制元件的适当表达载体中，该RNAi构建体对于本发明核酸分子的转录物具有特异性且可根据上述RNA干涉工作原理来制备。
优选，转基因细胞与相应的非转化细胞相比显示编码根据本发明蛋白质的转录物的量减少至少10％，更优选至少20％，更加优选至少50％，甚至更加优选至少70％，且最优选至少90％。该转录物的量可通过如RNA印迹分析进行确定。此外，该细胞优选地显示根据本发明的蛋白质量的相应减少。这可通过如免疫学方法如蛋白质印迹分析来确定。
或者，植物细胞当与相应的非转化细胞相比时，显示根据本发明蛋白质活性减少至少10％，更优选为至少20％，更加优选至少50％，甚至更加优选至少70％，且最优选至少90％。本发明的蛋白质的活性可通过如在实施例中描述的进行确定。
通过减少细胞中本发明蛋白质的量，该细胞显示淀粉降解的减少，这在如背景部分中描述的某些情况为有益。通过利用适当的启动子，淀粉降解活性的减少可在所有或基本所有的植物细胞中发生，或可限制于植物的某些器官、细胞类型或组织中，可由外部因子诱导或仅发生于植物的某些发育阶段。
此外，本发明涉及通过再生所述植物细胞而可获得的植物以及含有根据本发明的所述的细胞的植物。
原则上，转基因植物可为任何植物物种的植物，即它们可为单子叶和双子叶植物。优选，该植物为人们为商业目的培养的有用植物，特别是为营养目的或技术的，特别为工业目的，例如用于生产酒精的植物。它们优选为淀粉贮藏植物，例如谷类物种(黑麦、大麦、燕麦、小麦、谷子、西米等)、水稻、豌豆、marrow pea、木薯和马铃薯；番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆或竹芋、纤维形成植物(如亚麻、大麻、棉花)、贮藏油的植物(如油菜、向日葵、大豆)和贮藏蛋白质的植物(如豆科植物、谷类、大豆)。本发明也涉及水果植物或树和棕榈，如葡萄。此外，本发明涉及饲料植物(如饲料和牧场植物如草、苜蓿、三叶草、黑麦草(ryegrass))和蔬菜植物(如马铃薯、莴苣、菊苣)和装饰植物(如郁金香、风信子)。优选贮藏淀粉植物。特别优选甘蔗和甜菜及马铃薯植物、玉米、水稻、小麦和番茄植物。
本发明也涉及含有根据本发明的转基因植物的本发明植物的繁殖材料。对于术语“繁殖材料”的定义见上。
最后，本发明也涉及根据本发明的蛋白质在洗涤剂或冲洗剂中作为淀粉降解剂的用途以及涉及包含根据本发明蛋白质的洗涤剂或冲洗剂。衣服的变脏经常由食品导致。该食品可含有淀粉，该淀粉处于相互粘着的状态。含有淀粉降解酶的洗涤剂应能够降解淀粉，然后该淀粉可从脏的纤维中去除。该机制支持清洁程序。相同的机制也支持对脏的碟碗的清洁，尤其当使用洗碗机时。在洗碗机中，器皿不是机械地以将干燥的食品从器皿上刮去而清洁的。当使用水池替代洗碗机时，冲洗中的淀粉降解酶也应该能够支持对碟碗的清洁。
这些和其他的实施方案已被公开并对技术人员显而易见，并包含于本发明的说明和实施例中。关于上述方法、手段和应用之一的额外的文献可从现有技术获得，如从公共图书馆中通过用如电子方法获得。该目的等可由公共数据库满足，如可经由英特网在如地址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html获得的“medline”。其他数据库和地址对于技术人员是已知的且可从英特网获得，如在地址http//www.lycos.com之下。关于生物技术中的专利和专利申请的原始资料和信息的总结包含于Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中。
此外，在此处无论那里出现的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由该术语相联的全部或任何其他的元件组合”的意思。
所有上述提及的专利公开内容、出版物和数据库条目均特定地在此处整体引用作为参考，如同每一个单独的专利、出版物或条目具体单独引用作为参考。
图1表示在用碘蒸气染色之后的表达ppt-β-淀粉酶序列或空的pSK载体的大肠杆菌菌株KV832。尽管含有空载体的细胞染为蓝色，但表达ppt-β-淀粉酶的细胞不染色，显示细胞中的直链葡聚糖被ppt-β-淀粉酶所降解。
图2表示通过用含有支链淀粉的分离胶的不连续PAGE对ppt-β-淀粉酶水解活性的确定。作为负对照，将总的可溶性蛋白质从表达空的pET28a载体的大肠杆菌菌株BL21-CodonPlusTMRIL中分离(泳道1和2和7和8)。在后面的4个泳道中，总的可溶性蛋白质从表达pHIS-ppt-β-淀粉酶的大肠杆菌菌株BL21-CodonPlusTMRIL中分离(泳道3～6)。ppt-β-淀粉酶的水解活性可通过在用碘溶液染色之后的凝胶的负染色来检测，显示支链淀粉是降解的。箭头显示ppt-β-淀粉酶的活性。
图3表示pHIS-BMY融合蛋白质的pHIS-ppt-β-淀粉酶活性。
来自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白质的诱导细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分的水解活性以PNPG5作为β-淀粉酶的底物，以PNPG7作为α-淀粉酶的底物，且以对硝基苯基糖苷作为α-葡萄糖苷酶的底物。作为对照，使用来自含有空载体pET28a的诱导细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分。
图4表示将未加工的可溶性马铃薯淀粉与pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白质温育之后的水解产物。
使来自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白质的诱导细胞和来自含有空载体pET28a的诱导细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分与10g L-1未加工的或者可溶性的马铃薯淀粉温育12小时。形成的产物通过TLC进行分离并通过用硫酸碳化而染色。标准化合物；G1，Glc；G2-G7，链长为2～7个Glc残基的麦芽糖寡糖。泳道1；pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白质加未加工的淀粉，泳道2；含有空载体的细胞加未加工的淀粉，泳道3；pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白质加可溶性淀粉，泳道4；含有空载体加可溶性淀粉。
图5表示PPT-BMYI的质体导向。
使豌豆叶绿体与35S-标记的PPT-BMYI蛋白质进行温育。泳道1含有用于输入试验的体外翻译的前体蛋白(pre-protein)。泳道2含有从与放射性标记的体外翻译产物进行温育之后回收的叶绿体分离的蛋白质。泳道3含有来自与标记的前体蛋白进行温育并用蛋白酶嗜热芽孢杆菌蛋白酶进行后处理的叶绿体蛋白质。泳道4如泳道3所给出的，只是叶绿体用嗜热芽孢杆菌蛋白酶和去污剂Triton X-100进行后处理。千道尔顿(kilodalton)的蛋白质分子量标记在右边给出。pre，前体蛋白；m，成熟蛋白质。α-ppt-β-淀粉酶的叶片显示淀粉过剩表型。
图6表示PPT-BMYI反义品系显示mRNA量和β-淀粉酶活性的减少。
(a) 对于4℃贮藏了1日的PPT-BMYI反义品系的源叶片中mRNA的量进行了RNA凝胶印迹分析。使20μg从不同组织分离的总RNA在凝胶分离及随后将RNA转移到尼龙膜上之后用PPT-BMYcDNA探针进行杂交。
(b) 在黑暗期开始后2个小时确定马铃薯源叶片中的β-淀粉酶活性。来自PPT-BMYI反义品系的源叶片中的植物材料用PNPG5测定β-淀粉酶活性。结果为5个单独的酶提取物的平均数±SE。*指不同转基因品系(#8、#10、#11和#28)与相应的野生型(wt)值在5％的水平上的显著差异(Students t-检验)。
图7表示与未转化的对照相比在PPT-BMYI反义品系中的β-淀粉酶活性百分比。
图8表示α-ppt-β-淀粉酶品系#8、#10、#11、#28的叶片和未转化的对照的叶片，这些叶片用铝箔覆盖72小时以使其处于黑暗中。之后，将叶片用碘溶液对淀粉进行染色。72小时之后，野生型叶片和品系#28的叶片中的淀粉被降解了，而品系#8、#10和#11中的叶片仍然含有淀粉。
图9表示在黑暗/光照期结束时PPT-BMYI反义品系#8、#10、#11、#28和野生型的15周龄源叶片中淀粉含量。实心的柱(closed bar)代表在光照期结束时的淀粉含量；空心的柱(open bar)代表在光照期结束时的淀粉含量。淀粉含量为每m2己糖当量mmol。
图10表示在用碘蒸气染色之后表达CSD23序列或空的pSK载体的大肠杆菌菌株KV832。尽管含有空载体的细胞染为蓝色，但表达CSD23蛋白质的细胞不染色，这显示CSD23蛋白质在细胞中降解直链葡聚糖。
图11表示通过用含有直链淀粉的分离胶的不连续PAGE对CSD23蛋白质水解活性的确定。作为负对照，将总的可溶性蛋白质从表达空的pSK载体的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道1～3)。在后面的4个泳道中，总的可溶性蛋白质从表达CSD23蛋白质的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道3～7)。作为正对照，总的可溶性蛋白质从表达马铃薯的另一个β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道8～10)。SHI蛋白质和β-淀粉酶的水解活性可通过在用碘溶液染色之后的凝胶的负染色来检测，显示直链淀粉被降解。
图12表示在用碘蒸气染色之后表达CSD12序列或空的pSK载体的大肠杆菌菌株KV832。尽管含有空载体的细胞染为蓝色，但表达CSD12的细胞染为较浅的蓝色，这显示CSD12蛋白质在细胞中降解直链葡聚糖。
图13表示在用碘蒸气染色之后表达SHI序列或空的pSK载体的大肠杆菌菌株KV832。尽管含有空载体的细胞染为蓝色，但表达SHI蛋白质的细胞不染色，这显示SHI蛋白质在其中降解直链葡聚糖。
图14表示通过用含有支链淀粉的分离胶的不连续PAGE对SHI蛋白质水解活性的确定。作为负对照，总的可溶性蛋白质从表达空的pSK载体的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道1～3)。在后面的4个泳道中，总的可溶性蛋白质从表达SHI蛋白质的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道3～7)。作为正对照，总的可溶性蛋白质从表达马铃薯的另一个β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大肠杆菌菌株DH5α中分离(泳道8～10)。SHI蛋白质和β-淀粉酶的水解活性可通过在用碘溶液染色之后的凝胶的负染色来检测，这显示支链淀粉被降解。
图15使200μl表达SHI蛋白质或空的pSK载体的大肠杆菌DH5α细胞的总可溶性蛋白质与200μl支链淀粉溶液温育24小时。随后将溶液用碘染色以显示支链淀粉的降解。左边为负对照(表达空载体的大肠杆菌DH5α细胞的总可溶性蛋白质+支链淀粉)，右边为表达SHI蛋白质的大肠杆菌DH5α细胞的总可溶性蛋白质+支链淀粉。尽管在负对照中支链淀粉被碘染色，但与SHI蛋白质温育的支链淀粉被降解了且不被碘染色。
图16表示可溶性马铃薯淀粉与SHI蛋白质温育之后的水解产物。
将来自含有SHI蛋白质的诱导细胞的和来自含有空载体pSK的细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分各自与10g L-1的可溶性马铃薯淀粉进行温育。形成的产物通过TLC进行分离并通过用硫酸碳化来染色。标准化合物；G1，Glc；G2-G7，链长为2～7个Glc残基的麦芽糖寡糖。作为正对照，总的可溶性蛋白质从表达马铃薯的另一个β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大肠杆菌菌株DH5α中分离并如上所述与可溶性淀粉进行温育。
1.标准2.，5.和8.表达空载体pSK的大肠杆菌DH5α细胞的可溶性蛋白质组分+可溶性淀粉3.，6.和9.表达SHI蛋白质的大肠杆菌DH5α细胞的可溶性蛋白质组分+可溶性淀粉4.，7.和10.表达CF-β蛋白质的大肠杆菌DH5α细胞的可溶性蛋白质组分+可溶性淀粉11.标准2、3和4的温育时间为室温4小时，5、6和7为6小时，且8、9和10为8小时。
图17表示SHI蛋白质具有α-淀粉酶活性。
来自含有SHI蛋白质的诱导细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分的水解活性以PNPG5作为β-淀粉酶的底物，以PNPG7作为α-淀粉酶的底物，且以对硝基苯基糖苷作为α-葡萄糖苷酶的底物。作为对照，使用了来自含有空载体pSK的诱导细胞的大肠杆菌可溶性蛋白质组分。
图18表示SHI的质体导向。
将豌豆叶绿体与35S-标记的SHI 100GFP蛋白质进行温育。泳道1含有用于输入试验的体外翻译的前体蛋白。泳道2含有在与放射性标记的体外翻译产物温育之后回收的叶绿体中分离的蛋白质。泳道3含有来自与标记的前体蛋白和用蛋白酶嗜热芽孢杆菌蛋白酶后处理的叶绿体中的蛋白质。泳道4同泳道3，只是叶绿体用嗜热芽孢杆菌蛋白酶和去污剂Triton X-100进行后处理。千道尔顿的蛋白质分子量标记在右边给出。pre，前体蛋白；m，成熟蛋白质。
图19表示对α-SHI短马铃薯植物叶片中过渡淀粉降解的确定。与野生型相比，3个品系在调动过渡叶淀粉的能力中显示有差异。将α-SHI短品系#46、#51、#56、#58和野生型的叶片用铝箔覆盖64小时以使其处于黑暗中。之后将叶片用碘溶液对淀粉进行染色。64小时之后，野生型和品系#46叶片的淀粉被降解，而品系#51、#56和#58的叶片中仍含有淀粉。
图20表示对α-SHI短烟草植物叶片中过渡淀粉降解的确定。与野生型相比，3个品系在调动过渡叶淀粉的能力中显示有差异。将α-SHI短品系#18、#31、#37、#46、#47和野生型的叶片用铝箔覆盖12小时以使其处于黑暗中。之后将叶片用碘溶液对淀粉进行染色。12小时之后，野生型叶片中的淀粉被降解，而品系#18、#31、#37、#46和#47的叶片中仍含有淀粉。
图21表示对α-SHIL700马铃薯植物叶片中过渡淀粉降解的确定。与野生型相比，4个品系在调动过渡叶淀粉的能力中显示有差异。将α-SHIL700品系#16、#41、#46、#53和野生型的叶片用铝箔覆盖72小时以使其处于黑暗中。之后将叶片用碘溶液对淀粉进行染色。72小时之后，野生型叶片中的淀粉被降解，而品系#16、#41、#46和#53的叶片中仍含有淀粉。
图22表示α-SHI短的反义的叶片在置于黑暗中14天之后有生活力。
将SHI短的反义植物(品系#51、#56和#58)的源叶片和未转化的对照的源叶片用铝箔覆盖14天。尽管未转化的叶片死亡，但反义品系#51、#56和#58(从左到右)的叶片仍然有生活力。
图23表示在黑暗/光照期结束时α-SHI短的反义品系#46、#51、#56、#58和野生型的15周龄源叶片中的淀粉含量。空心的柱(openbar)代表在光照期结束时的淀粉含量；实心的柱(closed bar)代表在黑暗期结束时的淀粉含量。淀粉含量为每m2己糖当量mmol。
图24示意性地表示ppt-β-淀粉酶的反义构建体。
图25示意性地表示含有全长SHI cDNA的2.3kb片段的SHI蛋白质的反义构建体。
图26示意性地表示含有SHI cDNA的1.2 kb片段的SHI蛋白质的反义构建体。
图27示意性地表示CSD12蛋白质的反义构建体。
图28示意性地表示CSD23蛋白质的反义构建体。
下面的实施例阐明了本发明。
实施例1编码淀粉降解酶的cDNA的克隆对于分离编码淀粉降解酶的cDNA，使用了功能性筛选方法。创建2个马铃薯λZapII cDNA文库。一个从马铃薯源叶片mRNA制备(在光照结束前2小时和之后额外的2小时，每30分钟收获一次叶片)，另一个通过用λZapII cDNA合成试剂盒(Stratagene)从于4℃贮藏10天的马铃薯块茎制备。然后根据生产商的流程通过体内大量切除而将λZapII cDNA文库转变为质粒文库。
对于功能性筛选，使用不具有糖原分支酶活性的突变的大肠杆菌品系(KV832)。将该品系用含有大肠杆菌glgC16基因的质粒pACYC-184(New England Biolabs)进行转化，该glgC16基因编码酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的非调节的形式(Creuzat-Sigal等人，在Biochemistry of the glycoside linkage，Eds.Piras和Pontis；New York，USA，Academic Press(1972)，647-680)。该质粒命名为pACAG且其构建体描述于Kossmann等人(Planta 208/1999，503-511)中。当表达glgC16时，KV832积聚大量的直链葡聚糖，且因此当生长于补充了1％(w/v)葡萄糖的YT培养基上时，菌落暴露于碘蒸气时染为蓝色。
将含有pACAG的KV832细胞用质粒文库转化以获得35000cfu，并于37℃生长于含有1％(w/v)的葡萄糖、1mM IPTG和适当的抗生素的固体YT培养基上过夜。然后将细胞用碘蒸气进行染色。将显示浅蓝色染色或根本没有染色的菌落(参见如图1)分离并提取其中的质粒。该表型通过用KV832∷pACAG的再转化进行证实。鉴定了许多质粒并在用限制性内切酶消化后分为不同的类型。来自各个类型的不同质粒的插入物的DNA序列用商业上可购得的服务进行了确定。
实施例2从马铃薯分离编码ppt-β-淀粉酶的cDNA对根据实施例1分离的质粒之一的插入物的序列分析显示它编码β-淀粉酶，并对其进行了进一步的分析。该质粒含有1635bp的可读框，编码具有61 kD预测分子量的蛋白质(参见SEQ ID Nos7和8)。认为该序列是全长，因为在5’非翻译区中紧靠在预测的起始密码子前发现了终止密码子。该蛋白质与植物叶绿体外β-淀粉酶有高的氨基酸相似性，然而与这些β-淀粉酶相比它也具有N-末端的延长。最近鉴定的来自拟南芥的β-淀粉酶也含有N-末端的延长(Lao等人，Plant J.20(1999)，519-527)。该研究的作者可显示该β-淀粉酶导向于叶绿体，并指定为蛋白质CT-BMY，即叶绿体导向的β-淀粉酶。
实施例3功能性分析显示ppt-β-淀粉酶是活性的β-淀粉酶为了证实在实施例2中描述的ppt-β-淀粉酶是否具有β-淀粉酶活性，使融合到提供His-标签的序列的全长cDNA在大肠杆菌中进行表达。为了分离重组ppt-β-淀粉酶蛋白质，将ppt-β-淀粉酶cDNA克隆入pET表达系统中。编码ppt-β-淀粉酶蛋白质的序列通过PCR(5’引物5’-gtccgcggatccATGACTTTAACACTTCAATC-3’；小写的核苷酸添加以形成BamHI位点；将T7引物用作3’引物)用Pfu-TurboDNA聚合酶(Stratagene)进行扩增。将结果所得的PCR产物用BamHI和XhoI进行消化，并连接入表达载体pET28a(Novagen)中以生成pHIS-ppt-β-淀粉酶，该淀粉酶在N-末端含有6×His-标签。
编码的pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白质的表达于37℃由IPTG诱导在大肠杆菌BL21-CodonPlusTMRIL感受态细胞(Stratagene)中进行。总的可溶性蛋白质从诱导的细胞中制备，该诱导的细胞仅含有空的表达载体，或者含有载体pHIS-ppt-β-淀粉酶。来自100ml细胞培养物的大肠杆菌细胞在离心后收集，并重悬于400μL缓冲液中，该缓冲液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇。加入约400μL的玻璃珠(直径为0.25-0.5mm)，并在冰上有停顿地将细胞在30秒内漩涡振荡4次以裂解细胞。在20000g于4℃离心15分钟之后，对含有可溶性蛋白质组分的大肠杆菌裂解产物进行测定。β-淀粉酶和α-淀粉酶的活性通过用来自Megazyme(Sydney，澳大利亚)的测定试剂盒检测麦芽糖寡糖的降解而确定，该麦芽糖寡糖在还原端通过糖苷键连接对硝基苯基基团。为了确定α-葡糖苷酶的活性，将对硝基苯基糖苷用作底物。为了确定大肠杆菌裂解产物中的β-淀粉酶活性，将50μL裂解产物与225μL 100mM的Mes-KOH，pH6.2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇混合。测定通过加入25μL底物和偶联酶(终浓度为0.4mM寡糖和2.5单位α-葡糖苷酶)而开始，并在40℃进行10分钟之后通过加入2.5体积的1％(w/v)Trizma-碱(Sigma)而终止。活性作是以为在410nm分光光度测定的释放的p-nitrophenolate而确定。
对于植物材料中β-淀粉酶活性的确定，将冰冻的叶片(leaf disc)在150μL缓冲液中进行提取，该缓冲液含有50mM的Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇，3％(w/v)PEG-8000和2％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮。将样品于4℃和20000g离心10分钟，并将上清夜用于β-淀粉酶活性的测量。将25μL植物提取物与250μL含有100mM的Mes-KOH，pH6.2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的缓冲液进行混合。β-淀粉酶活性通过检测麦芽糖寡糖的降解而确定，该麦芽糖寡糖在还原端通过糖苷键连接对硝基苯基基团。β-淀粉酶的特定底物是非阻断的对硝基苯基麦芽五糖(PNPG5)。结果显示来自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶的诱导细胞的可溶性蛋白质组分与PNPG5反应，而那些来自含有空的pET28a载体的对照的不反应。为了进一步研究催化活性，同样将PNPG7和对硝基苯基糖苷用作底物。PNPG7是在非还原端化学阻断的对硝基苯基麦芽七糖，用于检测α-淀粉酶的活性，对硝基苯基糖苷是可用于确定α-葡糖苷酶活性的底物。结果表示于图3中。对于两种底物，在含有pHIS-ppt-β-淀粉酶和空载体的诱导细胞之间未检测到差异。这证实ppt-β-淀粉酶仅有β-淀粉酶，且不具有其他的淀粉分解活性。
同样可能通过用含有支链淀粉的分离胶经不连续的PAGE来显示pHIS-ppt-β-淀粉酶的水解活性。为此目的，将酶用含有支链淀粉的分离胶经不连续的PAGE进行分离，如Hill等人(Plant Cell Environ.19(1996)，1223-1237)所描述。分离胶(0.75mm)含有7.5％(w/v)的聚丙烯酰胺(30∶0.8)(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)、0.6％(w/v)的马铃薯支链淀粉或直链淀粉(Sigma)和375mM Tris-HCl(pH8.8)。积层胶含有3％(w/v)的聚丙烯酰胺和63mM Tris-HCl(pH6.8)。将凝胶于4℃在30mA的恒定电流(两个凝胶)中电泳1.5小时(MiniProtean 2 system，Bio-Rad)。电泳后，将凝胶在水中洗涤两次，并于20℃在含有0.1mM的Mes-KOH(pH6.2)、2mM CaCl2和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的缓冲液中温育1.5小时。然后将凝胶在水中洗涤10分钟，并用碘染色以检测支链淀粉或直链淀粉的降解。这些实验的结果显示于图2中。
β-淀粉酶活性的产物仅为麦芽糖，而α-淀粉酶产生例如一系列麦芽糖寡糖。为了显示对于pHIS-ppt-β-淀粉酶也是如此，将可溶性蛋白质组分与溶解的淀粉或与未加工的马铃薯淀粉颗粒进行温育，且产物在TLC-平板上分离。为此目的，使50μL大肠杆菌裂解产物在含有100mM的Mes-KOH，pH6.2、1mM EDTA、0.1％(v/v)β-巯基乙醇的缓冲液中与1％(w/v)可溶性未加工的马铃薯淀粉或支链淀粉(Sigma)进行温育。将反应混合物加入到TLC平板上(Silicagel F60，Merck)。将平板用含有异丙醇∶丁醇∶水(12∶3∶4)的洗脱液显影两次。将葡萄糖和麦芽糖寡糖(2～7个葡萄糖残基)的混合物用作标准。形成的产物通过用10％(v/v)的H2SO4湿润平板的碳化来显现。或者，对反应混合物用碘溶液进行染色以显示可溶性淀粉或支链淀粉的降解。结果显示于图4中。在两种情况下，水解产物均为麦芽糖，证明pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白质能够降解溶解的淀粉和马铃薯淀粉颗粒。
实施例4将ppt-β-淀粉酶输入到分离的叶绿体中为了确定ppt-β-淀粉酶蛋白质是否含有质体导向序列，进行了体外蛋白质输入实验。根据生产商的说明书(Promega)，将ppt-β-淀粉酶cDNA在体外进行转录并将产物在TNT网织红细胞裂解产物体系中进行翻译，在其中使用35S甲硫氨酸以产生35S-标记的ppt-β-淀粉酶前体。如所预测的，ppt-β-淀粉酶的前体蛋白具有约61 kD的分子量。将叶绿体从豌豆叶片中分离，如Bartlett等人(Methods in ChloroplastsMolecular Biology；Eds.Edelmann，Hallick和Chua；Amsterdam，荷兰；Elsevier Biochemical Press(1982)，1081-1091)所描述。蛋白质输入试验在输入缓冲液(250mM山梨糖醇、10mM甲硫氨酸、25mM葡糖酸钾、2mM MgSO4、50mM Hepes-KOH，pH8.0和0.2％(w/v)的BSA)中于25℃光照30分钟而进行，该缓冲液在300μL终体积中含有放射性标记的体外合成的前体蛋白质，及与200μg叶绿素相当的纯化的细胞器。
将一种组分用2.5μL嗜热芽孢杆菌蛋白酶(1mg/mL)和10μL 0.1M的CaCl2在冰上处理20分钟。第二个组分的处理额外地含有1％(v/v)Triton X-100。蛋白酶处理通过加入10μL 0.5M的EDTA来终止。未破裂的叶绿体通过在4500g离心8分钟而经过45％(v/v)的珀可垫(Percoll cushion)再次分离，在50mM Hepes和0.33M山梨糖醇pH8.0中洗涤，并重悬于2×SDS样品缓冲液中。该蛋白质是通过电泳(Laemmli，Nature 227(1970)，680-685)和随后通过放射自显影来分析。结果显示于图5中。
当分离的完整豌豆叶绿体与35S-标记的PCT-BMYI在ATP和适当的输入条件存在时下温育时，发现几乎所有添加的前体蛋白都被加工成约55kD的蛋白质了。蛋白酶嗜热芽孢杆菌蛋白酶向反应混合物中的加入消化了上清夜中的前体蛋白，而已输入到叶绿体中并被加工的成熟蛋白质则被保护并得以保持。当去污剂与嗜热芽孢杆菌蛋白酶一起加入时，所有标记的蛋白质都被消化了，该去污剂破坏质体膜的完整性并使免受蛋白水解的输入蛋白质终止。
实施例5具有减少的ppt-β-淀粉酶活性的转基因植物显示淀粉过剩表型为了研究ppt-β-淀粉酶的生理学作用，尤其在关于过渡淀粉降解中，用反义构建体(α-ppt-β-淀粉酶)生成了具有减少的ppt-β-淀粉酶活性的转基因马铃薯植物；参见图24。为此目的，将2.1kb长的ppt-β-淀粉酶BamHI/XhoI片段从pSK载体中切出。将该片段的末端用T4 DNA连接酶填充以生成平头末端。然后将该片段以关于花椰菜花叶病毒35S启动子相反的方向经SmaI限制位点克隆到植物表达载体pBinAR中(Hfgen和Willmitzer，Plant Sci.66(1990)，221-230)，并用农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移转化入马铃薯植物变种Désirée中(Rocha-Sosa等人，EMBO J.66(1989)，23-29)。马铃薯载培种Désirée从Saatzucht Fritz Lange KG(Bad Schwartau，德国)获得。将组织培养中的植物以16小时光照/8小时黑暗的模式于22℃置于补充了2％(w/v)的蔗糖的MS培养基上(Murashige和Skoog，Physiol.Plant 15(1962)，473-497)。将马铃薯植物从组织培养物中转移出并在温室中以16小时白天和8小时黑夜的模式生长于土壤中。在于4℃放置了一天的源叶片中，筛选70个植物在ppt-β-淀粉酶mRNA水平的减少。在这70个植物中，3个品系(#8、#10、#11)与未转化的对照相比显示mRNA水平的强减少，而品系#27和#28在这一点上不显示差异(参见图6a)。将品系#8、#10、#11和#28被选择来进行进一步的研究。为了显示ppt-β-淀粉酶mRNA水平的减少导致ppt-β-淀粉酶活性的减少，将PNPG5得到用作特定的β-淀粉酶底物。用PNPG5的结果显示在光照期后两小时收获的品系#8、#10、#11中的源叶片中的β-淀粉酶活性约为未转化的对照的30-50％，而#28的活性与对照无显著差异(参见图6b和图7)。
为了估计在过渡淀粉降解中的差异，将15周龄的温室生长的植物的源叶片用铝箔覆盖以使其处于黑暗中。在不同的时间点，将叶片用碘染色以确定淀粉含量。具体地，将叶片于80℃在80％的乙醇中脱色并随后用鲁戈氏溶液进行染色以显现淀粉含量。在野生型叶片和那些来自品系#28的叶片中，在36小时之后淀粉完全降解，而来自品系#8、#10、#11的叶片仍然含有足够的淀粉，从而它们在碘存在时染为蓝色。即使在在黑暗中经过72小时延长的时间之后，具有最强的ppt-β-淀粉酶活性减少的品系(#10和#11)仍含有显著量的淀粉(参见图8)。
叶片中的淀粉含量也经酶学确定。α-ppt-β-淀粉酶植物(品系#8、#10、#11)中的叶片淀粉含量与未转化的对照相比非常高。在光照期的结束，与未转化的对照相比，品系#8的植物在其源叶片中含有多180％的淀粉，品系#10和#11的植物含有约多240％的淀粉。淀粉含量如由Müller-Rber等人(EMBO J.11(1992)，1229-1238)所描述的来确定。结果显示于图9中。
实施例6从马铃薯分离编码淀粉降解酶的cDNA(CSD23)对于CSD23 cDNA的分离，使用如在实施例1中描述的程序。当该cDNA在大肠杆菌菌株KV832中于适当的条件下表达时，该细胞不再被碘蒸气染为蓝色(参见图10)。
对CSD 23 cDNA插入物的序列分析显示它编码迄今为止未知的蛋白质。该质粒含有882bp的可读框(参见SEQ ID NO3)，编码具有预测分子量为34.1kD的蛋白质。据认为该序列是全长，因为在5’非翻译区中紧靠在预测的起始密码子前发现了一个终止密码子。该蛋白质与拟南芥的未知蛋白质T05165(登录号T05165)享有高的氨基酸相似性(85.6％)。
实施例7CSD23具有水解活性为了证实CSD23蛋白质是否具有水解活性，使CSD23蛋白质在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。蛋白质的表达于37℃在大肠杆菌DH5α菌株(Bethesda Research Laboratories)中进行，以IPTG诱导。总的可溶性蛋白质从诱导的细胞中制备，该诱导的细胞仅含有空的pSK载体，或者含有包含编码蛋白质序列的pSK载体。来自100ml细胞培养物的大肠杆菌细胞在离心后收集，并重悬于400μL缓冲液中，该缓冲液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mMCaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇。加入约400μL的玻璃珠(直径为0.25-0.5mm)，并在冰上有停顿地将细胞在30秒内漩涡振荡4次以裂解细胞。在20000g于4℃离心15分钟之后，对含有可溶性蛋白质组分的大肠杆菌裂解产物进行测定。在用IPTG对在pSK载体中含有CSD23序列的细胞培养物进行诱导之后，将可溶性蛋白质组分进行分离。作为对照，将可溶性蛋白质从仅表达空pSK载体的细胞中分离(如对ppt-β-淀粉酶所述分离可溶性蛋白质组分)。将蛋白质组分用含有直链淀粉的分离胶以不连续的PAGE来检测水解性CSD23的活性。结果显示于图11中。与对照的可溶性蛋白质组分相反，表达CSD23细胞的可溶性蛋白质组分能够降解凝胶中的直链淀粉。此外，使用了含有支链淀粉的分离胶，但在这些凝胶中未检测到水解活性，这显示CSD23仅降解直链葡聚糖，而不降解分支的葡聚糖。
对于植物转化载体α-CSD23的构建，将1kb长的CSD23的XbaI/Asp718片段从pSK载体中切除。然后将该片段以关于花椰菜花叶病毒35S启动子相反的方向在植物表达载体pBinAR中进行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；参见图28。
再生成显示CSD23转录物水平减少的转基因植物。
实施例8从马铃薯分离编码淀粉降解酶的cDNA(CSD12)对于CSD12 cDNA的分离，使用如实施例1中所描述的程序。当CSD12在大肠杆菌菌株KV832中于适当的条件下表达时，该细胞不再被碘蒸气染蓝色(参见图12)。CSD12 cDNA测定序列显示于SEQ IDNO1中。
该蛋白质与拟南芥的未知蛋白质(登录号.AAF01527)共享高的氨基酸相似性(83％)。
对于植物转化载体α-CSD12的构建，将900bp长的CSD12的EcoRI/Asp718片段从pSK载体中切出。然后将该片段以关于花椰菜花叶病毒35S启动子相反的方向在植物表达载体pBinAR中进行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；参见图27。
实施例9从马铃薯分离编码淀粉降解酶的cDNA(SHI)对于SHI cDNA的分离，使用如实施例1中所描述的程序。当SHI在大肠杆菌菌株KV832中于适当的条件下表达时，该细胞不再被碘蒸气染蓝色(参见图13)。分离的cDNA不包含全长的cDNA。将指定为SHI短型的该片段用于植物转化载体α-SHI短型的构建。然后将SHI短型序列用作探针以标准筛选方法分离全长的cDNA SHI。对生成的马铃薯，使用叶片λZapII cDNA文库进行筛选(文库如上所述)。全长的SHI cDNA含有2370bp长的可读框，该可读框编码790个氨基酸的多肽(参见SEQ ID NO5)。编码的蛋白质具有86.6kD的预测分子量。该预测的蛋白质与未知的拟南芥蛋白质F14O13.17(登录号BAB03016)共享高的氨基酸相似性(53％)。
实施例10SHI具有水解活性为了证实SHI蛋白质是否具有水解活性，使SHI蛋白质在大肠杆菌菌株DH5α中进行表达。蛋白质的表达于37℃在大肠杆菌DH5α菌株(Bethesda Research Laboratories)中进行，以IPTG诱导。总的可溶性蛋白质从诱导的细胞中制备，该诱导的细胞仅含有空的pSK载体，或者含有包含编码蛋白质序列的pSK载体。来自100ml细胞培养物的大肠杆菌细胞在离心后收集，并重悬于400μL缓冲液中，该缓冲液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巯基乙醇。加入约400μL的玻璃珠(直径为0.25-0.5mm)，并在冰上有停顿地将细胞在30秒内漩涡振荡4次以裂解细胞。在20000g于4℃离心15分钟之后，对含有可溶性蛋白质组分的大肠杆菌裂解产物进行测定。将蛋白质组分用于检测水解性SHI活性。
可以用含有支链淀粉的分离胶以不连续的PAGE来显示SHI蛋白质的水解活性。结果显示于图14中。与对照相反，表达SHI的细胞的可溶性蛋白质组分能够降解凝胶中的支链淀粉。此外，可显示重组SHI蛋白质能够降解溶解的支链淀粉。为了显示该结果，使支链淀粉溶液与表达SHI的细胞的可溶性蛋白质组分进行温育。作为对照，使用表达空载体的细胞的蛋白质组分。在室温温育6个小时之后，使溶液用碘溶液进行染色以显示支链淀粉的降解。该实验的结果显示于图15中。
当可溶性蛋白质组分与可溶性马铃薯淀粉进行温育时，重组SHI蛋白质产生了一系列的麦芽糖寡糖(参见图16)。这是通过在TLC-平板上分离产物而显示的。由α-淀粉酶产生了相同系列的麦芽糖寡糖，这显示SHI蛋白质具有α-淀粉酶活性。薄层层析如对于ppt-β-淀粉酶所述进行。
实施例11SHI具有α-淀粉酶活性如对所述的ppt-β-淀粉酶所述，对SHI蛋白质的水解活性进行了研究。结果显示于图17中。结果显示来自含有SHI蛋白质的诱导细胞的可溶性蛋白质组分与PNPG7反应，而来自含有空pSK载体的对照的不反应。为了进一步研究催化活性，同样将PNPG5和对硝基苯基糖苷用作底物。对于两种底物，在含有SHI蛋白质和空载体的诱导细胞之间未检测到差异。这证实SHI蛋白质仅有α-淀粉酶活性，且不具有其他的淀粉分解活性。
实施例12SHI蛋白质被输入到分离的叶绿体中为了确定SHI蛋白质是否含有质体导向序列，如实施例4所述进行体外蛋白质输入实验。对于该实验使用了其中编码SHI前100个氨基酸的SHI序列以符合读框的方式融合绿色荧光蛋白的构建体。当该构建体转录并在体外翻译时，可能显示放射性标记的蛋白质产物被输入到叶绿体中(参见图18)。这些数据证明SHI蛋白质的前100个氨基酸能够介导转运过程。
输入实验如上所述进行。
实施例13具有减少的SHI活性的转基因植物显示淀粉过剩表型为了研究SHI蛋白质的生理学作用，尤其是关于过渡淀粉的降解，用两个不同的反义构建体生成了具有减少的SHI活性的转基因马铃薯和转基因烟草植物。一个构建体包含在35S-启动子控制之下的SHI短序列(α-SHI短型)。对于该载体的构建，将1.2kb长的SHIBamHI/XhoI片段从含有初级分离的SHI序列的pSK载体中切除。将该片段的末端用T4 DNA连接酶填充以生成平头末端。然后将该片段以关于花椰菜花叶病毒35S启动子相反的方向经SmaI限制位点在植物表达载体pBinAR中进行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；参见图26。第二个构建体包含在叶特异性的L700启动子控制之下的全长SHI cDNA的2.3kb长的片段(α-SHIL700)。对于该载体的构建，将2.3kb长的SHI Asp718/XbaI片段从含有全长SHI序列的pSK载体中切除。然后将该片段以关于L700启动子相反的方向在植物表达载体pBinAR L700中进行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；参见图25。将两个构建体用于如上所述马铃薯植物细胞的转化。烟草仅用α-SHI短型构建体进行转化。
(a) α-SHI短型马铃薯植物为了估计过渡淀粉降解中的差异，将15周龄的温室生长植物的源叶片用铝箔覆盖以使其处于黑暗中。在不同的时间点，对叶片用碘进行染色以确定淀粉含量。在野生型叶片和那些来自品系#46的叶片中，黑暗64小时之后淀粉完全降解了，而那些来自品系#51、#56和#58的叶片仍然含有足够的淀粉，从而它们在碘存在时染为蓝色(参见图19)。
叶片中的淀粉含量也经酶学确定。与未转化的对照相比，α-SHI短型植物叶片中的淀粉含量(品系#51、#56和#58)非常高。在光照期的结束时，与未转化的对照相比，品系#51的植物在其源叶片中含有多412％的淀粉，品系#56的植物含有多367％的淀粉，且品系#58的含有多约814％的。
(b) 叶片的生活力对于α-SHI短型马铃薯植物品系#51、#56和#58的叶片而言，可显示这些品系的叶片在14天的黑暗期后仍然有生活力。为了显示该情况，将叶片在黑暗中放置所显示的时间段。尽管野生型植物的叶片死亡，但品系#51、#56和#58的叶片仍然有生活力。在品系#58的叶片中可显示最好的结果(参见图22)。
(c) α-SHI短型烟草植物为了估计过渡淀粉降解中的差异，将10周龄的温室生长植物的源叶片用铝箔覆盖以使其处于黑暗中。在12小时的黑暗后，对叶片用碘进行染色以确定淀粉含量。在野生型叶片中，在黑暗中放置12小时之后淀粉完全降解了，而那些来自品系#18、#31、#37、#46和#47的叶片仍然含有足够的淀粉，从而它们在碘存在时染为蓝色(参见图20)。
(d) α-SHI L700烟草植物为了估计过渡淀粉降解中的差异，将15周龄的温室生长植物的源叶片用铝箔覆盖以使其处于黑暗中。在不同的时间点，对叶片用碘进行染色以确定淀粉含量。在野生型叶片中，在黑暗中放置72小时之后淀粉完全降解了，而那些来自品系#16、#41、#46和#53的叶片仍然含有足够的淀粉，从而它们在碘存在时染为蓝色(参见图21)。
序 列 表<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V.
<120> 编码淀粉降解酶的核酸分子<130> E 1994 PCT<140>
<141>
<160> 8<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 834<212> DNA<213> 马铃薯<220>
<221> CDS<222> (1)..(834)<400> 1atg aga gct ctc tgg aac tcc acc tgc ttg tcc cca gtt caa aat aat48Met Arg Ala Leu Trp Asn Ser Thr Cys Leu Ser Pro Val Gln Asn Asn1 5 10 15cca ttg tta ttc tct cgt tca agc aag aaa tat gcg aat tcc tta tgc96Pro Leu Leu Phe Ser Arg Ser Ser Lys Lys Tyr Ala Asn Ser Leu Cys20 25 30aat ttc acc aac aaa tcc ttc cag att tct tgc aaa ctt cca gaa agt 144Asn Phe Thr Asn Lys Ser Phe Gln Ile Ser Cys Lys Leu Pro Glu Ser35 40 45gaa gtt aaa gag aac cat gct aga tcc agt agt aat aag aag atg gag 192Glu Val Lys Glu Asn His Ala Arg Ser Ser Ser Asn Lys Lys Met Glu50 55 60gaa tac aac tta gct atg aag aga atg atg agg aat cct tat gaa tat 240Glu Tyr Asn Leu Ala Met Lys Arg Met Met Arg Asn Pro Tyr Glu Tyr65 70 75 80cac cat gaa ctt gga atg aac tac aca ttg ata aca gaa gat cta att 288His His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Thr Leu Ile Thr Glu Asp Leu Ile85 90 95gtt ggc tcc cag cct cag aaa att gaa gat ata gat tat ttg aag gaa 336Val Gly Ser Gln Pro Gln Lys Ile Glu Asp Ile Asp Tyr Leu Lys Glu100 105 110gag gag aac gta gct ttt ata cta aac ttg cag cag gac aaa gat att 384Glu Glu Asn Val Ala Phe Ile Leu Asn Leu Gln Gln Asp Lys Asp Ile115 120 125gag ttt tgg gga ata gac ctc cag tct atc gtt aca aga tgt tca gag 432Glu Phe Trp Gly Ile Asp Leu Gln Ser Ile Val Thr Arg Cys Ser Glu
130 135 140ctt gga att cat cac atg aga agg cct gca aga gat ttt gat cca gat480Leu Gly Ile His His Met Arg Arg Pro Ala Arg Asp Phe Asp Pro Asp145 150 155 160tcc ctg agg agt gta tta cct aaa gct gtt tca tca ctg gag tgg gcg528Ser Leu Arg Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Ser Ser Leu Glu Trp Ala165 170 175att tca gaa gga aaa gga aga gtg tat gta cat tgc act gct gga ttg576Ile Ser Glu Gly Lys Gly Arg Val Tyr Val His Cys Thr Ala Gly Leu180 185 190gga agg gcc cct gct gtt tca att gct tat atg ttc tgg ttc tgt ggg624Gly Arg Ala Pro Ala Val Ser Ile Ala Tyr Met Phe Trp Phe Cys Gly195 200 205atg gat cta aat aca gct tat gat aca ctc gtt tca aag aga ccc tgt672Met Asp Leu Asn Thr Ala Tyr Asp Thr Leu Val Ser Lys Arg Pro Cys210 215 220ggg ccc aac aaa agg tca ata cag gga gct act tat gat ttg gct aaa720Gly Pro Asn Lys Arg Ser Ile Gln Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Ala Lys225 230 235 240aat gat cag tgg aag gag ccc ttt gag aat ctg cca gat tat gcc ttt768Asn Asp Gln Trp Lys Glu Pro Phe Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Ala Phe245 250 255gcg gat gta gca gat tgg gag agg aaa ctg att caa gat cgt gtg cga816Ala Asp Val Ala Asp Trp Glu Arg Lys Leu Ile Gln Asp Arg Val Arg260 265 270gcc ctt cgt gac act tga834Ala Leu Arg Asp Thr275<210> 2<211> 277<212> PRT<213> 马铃薯<400> 2Met Arg Ala Leu Trp Asn Ser Thr Cys Leu Ser Pro Val Gln Asn Asn1 5 10 15Pro Leu Leu Phe Ser Arg Ser Ser Lys Lys Tyr Ala Asn Ser Leu Cys20 25 30Asn Phe Thr Asn Lys Ser Phe Gln Ile Ser Cys Lys Leu Pro Glu Ser35 40 45Glu Val Lys Glu Asn His Ala Arg Ser Ser Ser Asn Lys Lys Met Glu50 55 60Glu Tyr Asn Leu Ala Met Lys Arg Met Met Arg Asn Pro Tyr Glu Tyr65 70 75 80His His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Thr Leu Ile Thr Glu Asp Leu Ile85 90 95Val Gly Ser Gln Pro Gln Lys Ile Glu Asp Ile Asp Tyr Leu Lys Glu100 105 110Glu Glu Asn Val Ala Phe Ile Leu Asn Leu Gln Gln Asp Lys Asp Ile
115 120 125Glu Phe Trp Gly Ile Asp Leu Gln Ser Ile Val Thr Arg Cys Ser Glu130 135 140Leu Gly Ile His His Met Arg Arg Pro Ala Arg Asp Phe Asp Pro Asp145 150 155 160Ser Leu Arg Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Ser Ser Leu Glu Trp Ala165 170 175Ile Ser Glu Gly Lys Gly Arg Val Tyr Val His Cys Thr Ala Gly Leu180 185 190Gly Arg Ala Pro Ala Val Ser Ile Ala Tyr Met Phe Trp Phe Cys Gly195 200 205Met Asp Leu Asn Thr Ala Tyr Asp Thr Leu Val Ser Lys Arg Pro Cys210 215 220Gly Pro Asn Lys Arg Ser Ile Gln Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Ala Lys225 230 235 240Asn Asp Gln Trp Lys Glu Pro Phe Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Ala Phe245 250 255Ala Asp Val Ala Asp Trp Glu Arg Lys Leu Ile Gln Asp Arg Val Arg260 265 270Ala Leu Arg Asp Thr275<210> 3<211> 885<212> DNA<213> 马铃薯<220>
<221> CDS<222> (1)..(885)<400> 3atg gac ttc gct agt atg gac cgt gca caa ctc act atg gtg gga tca 48Met Asp Phe Ala Ser Met Asp Arg Ala Gln Leu Thr Met Val Gly Ser1 5 10 15ggg ttt tct gct ttg ctt tca atg cat ttc aca ata cag ctc ttg tca 96Gly Phe Ser Ala Leu Leu Ser Met His Phe Thr Ile Gln Leu Leu Ser20 25 30caa cac ctg ttc ttc tgg aaa aac cca aag gag caa aag gca ata atc144Gln His Leu Phe Phe Trp Lys Asn Pro Lys Glu Gln Lys Ala Ile Ile35 40 45atg att ata tgt atg gct cca ctt tat gcc att gac tcg ttt gtg ggt192Met Ile Ile Cys Met Ala Pro Leu Tyr Ala Ile Asp Ser Phe Val Gly50 55 60ttg tta gat att cgt gga agc aaa aca ttt ttc atg ttt cta gac tca240Leu Leu Asp Ile Arg Gly Ser Lys Thr Phe Phe Met Phe Leu Asp Ser65 70 75 80gtt aaa gaa tgc tac gag gct gtg gca att gcc aaa ttt ttg gct ttg288Val Lys Glu Cys Tyr Glu Ala Val Ala Ile Ala Lys Phe Leu Ala Leu85 90 95atg tat agt aat ttg aat ata tcc atc agc aaa aac att gtg cct gat336Met Tyr Ser Asn Leu Asn Ile Ser Ile Ser Lys Asn Ile Val Pro Asp
100 105 110gaa atc aag ggg agg gaa att cat cat tcc ttt cca atg act cta ttt384Glu Ile Lys Gly Arg Glu Ile His His Ser Phe Pro Met Thr Leu Phe115 120 125cag ccc cgc act gct cgc tta gat cac cgg aca ctg aaa ctt ctc aag432Gln Pro Arg Thr Ala Arg Leu Asp His Arg Thr Leu Lys Leu Leu Lys130 135 140cat tgg aca tgg cag ttt gtc atc atc cgt cca gca tgc tct atc ttg480His Trp Thr Trp Gln Phe Val Ile Ile Arg Pro Ala Cys Ser Ile Leu145 150 155 160atg atc acg tta cag att ctt ggg ttg tat ccg agt tgg ctc agc tgg528Met Ile Thr Leu Gln Ile Leu Gly Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Ser Trp165 170 175acg ttt acc atc att ctc aat att tca ttc tca gtg gcc atg tac tcc576Thr Phe Thr Ile Ile Leu Asn Ile Ser Phe Ser Val Ala Met Tyr Ser180 185 190ttg gtt gtt ttc tac cat gtt ttc tca aag gaa ctg cag cca cac aaa624Leu Val Val Phe Tyr His Val Phe Ser Lys Glu Leu Gln Pro His Lys195 200 205cca ctt tca aag ttc atc tgc atc aaa ggg ata gtt ttc ttc agc ttt672Pro Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ile Lys Gly Ile Val Phe Phe Ser Phe210 215 220tgg cag ggg ttg ctg gtt aaa att cta gtc tcg tgg gga att atc aaa720Trp Gln Gly Leu Leu Val Lys Ile Leu Val Ser Trp Gly Ile Ile Lys225 230 235 240tct cac cat ttt tgg ttg gat gtg gag cac ctt cag gaa gcc att cag768Ser His His Phe Trp Leu Asp Val Glu His Leu Gln Glu Ala Ile Gln245 250 255aat gtt tta att tgt gtg gag atg gtt ttc ttt tct gtt atg cag caa816Asn Val Leu Ile Cys Val Glu Met Val Phe Phe Ser Val Met Gln Gln260 265 270tat gca tac cat gtg gct cct tac agt ggt gat gtc gaa gca aag ttg864Tyr Ala Tyr His Val Ala Pro Tyr Ser Gly Asp Val Glu Ala Lys Leu275 280 285aaa ctg aaa aag gat gac taa885Lys Leu Lys Lys Asp Asp290 295<210> 4<211> 294<212> PRT<213> 马铃薯<400> 4Met Asp Phe Ala Ser Met Asp Arg Ala Gln Leu Thr Met Val Gly Ser1 5 10 15Gly Phe Ser Ala Leu Leu Ser Met His Phe Thr Ile Gln Leu Leu Ser
20 25 30Gln His Leu Phe Phe Trp Lys Asn Pro Lys Glu Gln Lys Ala Ile Ile35 40 45Met Ile Ile Cys Met Ala Pro Leu Tyr AlaIle Asp Ser Phe Val Gly50 55 60Leu Leu Asp Ile Arg Gly Ser Lys Thr Phe Phe Met Phe Leu Asp Ser65 70 75 80Val Lys Glu Cys Tyr Glu Ala Val Ala Ile Ala Lys Phe Leu Ala Leu85 90 95Met Tyr Ser Asn Leu Asn Ile Ser Ile Ser Lys Asn Ile Val Pro Asp100 105 110Glu Ile Lys Gly Arg Glu Ile His His Ser Phe Pro Met Thr Leu Phe115 120 125Gln Pro Arg Thr Ala Arg Leu Asp His Arg Thr Leu Lys Leu Leu Lys130 135 140His Trp Thr Trp Gln Phe Val Ile Ile Arg Pro Ala Cys Ser Ile Leu145 150 155 160Met Ile Thr Leu Gln Ile Leu Gly Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Ser Trp165 170 175Thr Phe Thr Ile Ile Leu Asn Ile Ser Phe Ser Val Ala Met Tyr Ser180 185 190Leu Val Val Phe Tyr His Val Phe Ser Lys Glu Leu Gln Pro His Lys195 200 205Pro Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ile Lys Gly Ile Val Phe Phe Ser Phe210 215 220Trp Gln Gly Leu Leu Val Lys Ile Leu Val Ser Trp Gly Ile Ile Lys225 230 235 240Ser His His Phe Trp Leu Asp Val Glu His Leu Gln Glu Ala Ile Gln245 250 255Asn Val Leu Ile Cys Val Glu Met Val Phe Phe Ser Val Met Gln Gln260 265 270Tyr Ala Tyr His Val Ala Pro Tyr Ser Gly Asp Val Glu Ala Lys Leu275 280 285Lys Leu Lys Lys Asp Asp290<210> 5<211> 2923<212> DNA<213> 马铃薯<220>
<221> CDS<222> (76)..(2445)<400> 5gaattcggca cgagattttt agggtttttg gatgaggatt taagaggaaa gatttgattt 60ttttgaggat tttgg atg gcg tca gct cag gta cta aaa aag caa gag cat 111Met Ala Ser Ala Gln Val Leu Lys Lys Gln Glu His1 5 10ttg caa gct ggg aaa aag aag cta gag gaa ttt cgt aag aag aga gca159Leu Gln Ala Gly Lys Lys Lys Leu Glu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ala15 20 25gca gag aag gct aaa aag aca act tca aat agt caa cag ctt gcc tct207Ala Glu Lys Ala Lys Lys Thr Thr Ser Asn Ser Gln Gln Leu Ala Ser
30 35 40gat gga ggc gtt gat aat caa cat tca gga aat gaa cac act aga act255Asp Gly Gly Val Asp Asn Gln His Ser Gly Asn Glu His Thr Arg Thr45 50 55 60aag gac tcc agt gga gct gct aca tct gat gct gtt ggc aga tct gtt303Lys Asp Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Gly Arg Ser Val65 70 75cta aag cca tct gaa gta cat gct aag cat gat ttt gcg aag cct gat351Leu Lys Pro Ser Glu Val His Ala Lys His Asp Phe Ala Lys Pro Asp80 85 90ctt acc cag aag tct gat tta att ttt cct agt gat gct agt gct ggt399Leu Thr Gln Lys Ser Asp Leu Ile Phe Pro Ser Asp Ala Ser Ala Gly95 100 105gct acg cct agt ttg cac aaa tac tat gat gat gct gtt gtt aaa gcc447Ala Thr Pro Ser Leu His Lys Tyr Tyr Asp Asp Ala Val Val Lys Ala110 115 120aac agt tat gat ttt ggc tct tcc atc tca gca ttg tct cgt tta gaa495Asn Ser Tyr Asp Phe Gly Ser Ser Ile Ser Ala Leu Ser Arg Leu Glu125 130 135 140aat aaa ggg tct aga agt gat gag aat ctt aag gtt tct caa aca gta543Asn Lys Gly Ser Arg Ser Asp Glu Asn Leu Lys Val Ser Gln Thr Val145 150 155agt gat act tat gac aac act ggg aag agg gag agt gat ggg gcc tta591Ser Asp Thr Tyr Asp Asn Thr Gly Lys Arg Glu Ser Asp Gly Ala Leu160 165 170gaa agt gtt cca ttt ggg ttt gcg act aac cac tct aca gcc act ttt639Glu Ser Val Pro Phe Gly Phe Ala Thr Asn His Ser Thr Ala Thr Phe175 180 185cct cca ttc ctc aat aat gac aga act tcc agt cat ttc act tat gat687Pro Pro Phe Leu Asn Asn Asp Arg Thr Ser Ser His Phe Thr Tyr Asp190 195 200gat atg ggt aaa cgc ata tcg gag gag agc cat gca aag gat ctt tct735Asp Met Gly Lys Arg Ile Ser Glu Glu Ser His Ala Lys Asp Leu Ser205 210 215 220gta act aat gat ggt act tct cat gct ttt ccg gct aat gta tca cct783Val Thr Asn Asp Gly Thr Ser His Ala Phe Pro Ala Asn Val Ser Pro225 230 235tca aat cca ttc ggg tct cgt gac gac aaa cca cgt tat aca gat cgc831Ser Asn Pro Phe Gly Ser Arg Asp Asp Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Arg240 245 250tgg gct agt gac atg act tcc gct tca tat ggt gat tat gtt ccc ggt879Trp Ala Ser Asp Met Thr Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Val Pro Gly255 260 265gct acc acg gac cca caa ttt tat cct gaa gtt ggg aga aat gtt gct927Ala Thr Thr Asp Pro Gln Phe Tyr Pro Glu Val Gly Arg Asn Val Ala
270 275 280ggt gtg gga tct aat aat ttt gta gtg cct gat aaa gga tac atc cag 975Gly Val Gly Ser Asn Asn Phe Val Val Pro Asp Lys Gly Tyr Ile Gln285 290 295 300tta aac agc tct ggt ctt cac tca act aaa act tct tct tgg aca tcg1023Leu Asn Ser Ser Gly Leu His Ser Thr Lys Thr Ser Ser Trp Thr Ser305 310 315gac tcc aag tat gat ggt ttt agt ttt gat gct aga agt tct tct agt1071Asp Ser Lys Tyr Asp Gly Phe Ser Phe Asp Ala Arg Ser Ser Ser Ser320 325 330tac tca cag atg tct aca ctc aca gct ggg gcg act ggg agg aga act1119Tyr Ser Gln Met Ser Thr Leu Thr Ala Gly Ala Thr Gly Arg Arg Thr335 340 345cca tct ttc ctt gat tcc atc aac att tca aaa gtc tct gct gta tcc1167Pro Ser Phe Leu Asp Ser Ile Asn Ile Ser Lys Val Ser Ala Val Ser350 355 360cct ccc tca ata gga tca gtt act aca gac aca tat gac tca atg gct1215Pro Pro Ser Ile Gly Ser Val Thr Thr Asp Thr Tyr Asp Ser Met Ala365 370 375 380tac cct agg gac act ctg ggt tta tca aat tct gag aac ttg aca aat1263Tyr Pro Arg Asp Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ser Glu Asn Leu Thr Asn385 390 395tct tca aaa ttt tct ggt aat ggg tca gat ctg tac aag cat gct gtt1311Ser Ser Lys Phe Ser Gly Asn Gly Ser Asp Leu Tyr Lys His Ala Val400 405 410gag aaa gat atg ggc aac ttg gac aac aga cat cca ttt tat tca cag1359Glu Lys Asp Met Gly Asn Leu Asp Asn Arg His Pro Phe Tyr Ser Gln415 420 425aag caa aat gaa gat ttt gct gca tta gaa cag cat att gaa gat tta1407Lys Gln Asn Glu Asp Phe Ala Ala Leu Glu Gln His Ile Glu Asp Leu430 435 440aca caa gag aag ttc tct cta caa cgt gct ctt gag gct tcg cga act1455Thr Gln Glu Lys Phe Ser Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ala Ser Arg Thr445 450 455 460cta gca gag tct cta gct gct gaa aat tca act ctg aca gat agt tat1503Leu Ala Glu Ser Leu Ala Ala Glu Asn Ser Thr Leu Thr Asp Ser Tyr465 470 475aat caa cag gga agt ttt gtt ggc caa cta aaa gct gag atg gag agg1551Asn Gln Gln Gly Ser Phe Val Gly Gln Leu Lys Ala Glu Met Glu Arg480 485 490ttg caa gag gag att aaa gcc cat ctg ggt gag ctt gaa gct gtg aaa1599Leu Gln Glu Glu Ile Lys Ala His Leu Gly Glu Leu Glu Ala Val Lys495 500 505atg gaa tat gca aat gta caa ttg gaa tgt aat gct gct gat gag cgt1647Met Glu Tyr Ala Asn Val Gln Leu Glu Cys Asn Ala Ala Asp Glu Arg
510 515 520gcc aag tta ttg gct tct gaa gtg att ggc ttg gaa gag aag gca ctt1695Ala Lys Leu Leu Ala Ser Glu Val Ile Gly Leu Glu Glu Lys Ala Leu525 530 535 540cgt cta aga tct aat gag ctt aaa ctg gag aaa gaa ttg gag aag tca1743Arg Leu Arg Ser Asn Glu Leu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Lys Ser545 550 555caa gct gaa atg tct tct tac aag aag aaa att gct agc ctt gaa aaa1791Gln Ala Glu Met Ser Ser Tyr Lys Lys Lys Ile Ala Ser Leu Glu Lys560 565 570gat cgt caa gat ctg caa tca aca atc gat gct tta aag gaa gaa aag1839Asp Arg Gln Asp Leu Gln Ser Thr Ile Asp Ala Leu Lys Glu Glu Lys575 580 585aag ctc ttg caa tcc aaa ttc cta aaa gct tct gct aat gga aag tca1887Lys Leu Leu Gln Ser Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Asn Gly Lys Ser590 595 600gtt gat cct agc agg aat atg cct aca aaa ata gat gta tca act tct1935Val Asp Pro Ser Arg Asn Met Pro Thr Lys Ile Asp Val Ser Thr Ser605 610 615 620aca gag gat ctt cgt gaa gat aat atc gca agt ggt acc ata aat gac1983Thr Glu Asp Leu Arg Glu Asp Asn Ile Ala Ser Gly Thr Ile Asn Asp625 630 635act aat atg gtt ggt att gat ggc ccc acc acc tct tcc cta ccc gat2031Thr Asn Met Val Gly Ile Asp Gly Pro Thr Thr Ser Ser Leu Pro Asp640 645 650ttt ggg cag ttt agt ctc gga agt ttg tca ccg gcc att cct cca gat2079Phe Gly Gln Phe Ser Leu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Ile Pro Pro Asp655 660 665cag att agg atg atc caa aac att aat aca tta att tct gag tta gcc2127Gln Ile Arg Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Ile Ser Glu Leu Ala670 675 680ttg gag aaa gac gaa tta aca aaa gcc ctg tca gtt gaa tca tct cag2175Leu Glu Lys Asp Glu Leu Thr Lys Ala Leu Ser Val Glu Ser Ser Gln685 690 695 700cgc tct aca ttg aag gag tta aac agc gac tta act cgg aag ctt gaa2223Arg Ser Thr Leu Lys Glu Leu Asn Ser Asp Leu Thr Arg Lys Leu Glu705 710 715gtt caa aca caa aga ttg gag ctt tta act gct caa agc atg gca aat2271Val Gln Thr Gln Arg Leu Glu Leu Leu Thr Ala Gln Ser Met Ala Asn720 725 730gaa aac agc caa gca aga caa cca gat gca gtg tct gta cat gac aat2319Glu Asn Ser Gln Ala Arg Gln Pro Asp Ala Val Ser Val His Asp Asn735 740 745atg cca tat gct gat gac aat atg caa tat gct gat gaa gga gat gag2367Met Pro Tyr Ala Asp Asp Asn Met Gln Tyr Ala Asp Glu Gly Asp Glu
750 755 760gtg gtg gaa cgg gta ttg gga tgg atc atg aaa cta ttt cct gga ggg2415Val Val Glu Arg Val Leu Gly Trp Ile Met Lys Leu Phe Pro Gly Gly765 770 775 780cca tca aga cga cga acc agc aag ctt ctt taatctccat ggcaagagta 2465Pro Ser Arg Arg Arg Thr Ser Lys Leu Leu785 790caatgatgag ttatttctgc gaaaagctgg tctttttctc ctctccagcc ctgcattttt 2525ggtagccaaa cggagtccgg attttgtata ttatccatgg tttatacaca cacattgcat 2585tcttttcccc cagaagaagc aaattgtatc taagaggcat tttggaagat ggaattagct 2645gttctcgaca gttttggcaa taaaacatga ccgtgttgtt tacaagagaa tccatttatc 2705aaacgttgta atgaagatca gatgtgttta gttgtcaatc atgagagaaa aaaaacttca 2765aatgtttctt acttttcatg tggaaatgat gtttagatct tttgacattg tattcgttat 2825gttgtatttg ttgaaagctg gggcttaaga aaagcccaat atatcaaaaa gatgattttg 2885gccgtccttt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgag 2923<210> 6<211> 790<212> PRT<213> 马铃薯<400> 6Met Ala Ser Ala Gln Val Leu Lys Lys Gln Glu His Leu Gln Ala Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Leu Glu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ala Ala Glu Lys Ala20 25 30Lys Lys Thr Thr Ser Asn Ser Gln Gln Leu Ala Ser Asp Gly Gly Val35 40 45Asp Asn Gln His Ser Gly Asn Glu His Thr Arg Thr Lys Asp Ser Ser50 55 60Gly Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Gly Arg Ser Val Leu Lys Pro Ser65 70 75 80Glu Val His Ala Lys His Asp Phe Ala Lys Pro Asp Leu Thr Gln Lys85 90 95Ser Asp Leu Ile Phe Pro Ser Asp Ala Ser Ala Gly Ala Thr Pro Ser100 105 110Leu His Lys Tyr Tyr Asp Asp Ala Val Val Lys Ala Asn Ser Tyr Asp115 120 125Phe Gly Ser Ser Ile Ser Ala Leu Ser Arg Leu Glu Asn Lys Gly Ser130 135 140
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Leu Ala Ala Glu Asn Ser Thr Leu Thr Asp Ser Tyr Asn Gln Gln Gly465 470 475 480Ser Phe Val Gly Gln Leu Lys Ala Glu Met Glu Arg Leu Gln Glu Glu485 490 495Ile Lys Ala His Leu Gly Glu Leu Glu Ala Val Lys Met Glu Tyr Ala500 505 510Asn Val Gln Leu Glu Cys Asn Ala Ala Asp Glu Arg Ala Lys Leu Leu515 520 525Ala Ser Glu Val Ile Gly Leu Glu Glu Lys Ala Leu Arg Leu Arg Ser530 535 540Asn Glu Leu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Lys Ser Gln Ala Glu Met545 550 555 560Ser Ser Tyr Lys Lys Lys Ile Ala Ser Leu Glu Lys Asp Arg Gln Asp565 570 575Leu Gln Ser Thr Ile Asp Ala Leu Lys Glu Glu Lys Lys Leu Leu Gln580 585 590Ser Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Asn Gly Lys Ser Val Asp Pro Ser595 600 605Arg Asn Met Pro Thr Lys Ile Asp Val Ser Thr Ser Thr Glu Asp Leu610 615 620Arg Glu Asp Asn Ile Ala Ser Gly Thr Ile Asn Asp Thr Asn Met Val625 630 635 640Gly Ile Asp Gly Pro Thr Thr Ser Ser Leu Pro Asp Phe Gly Gln Phe645 650 655Ser Leu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Ile Pro Pro Asp Gln Ile Arg Met660 665 670Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Ile Ser Glu Leu Ala Leu Glu Lys Asp675 680 685Glu Leu Thr Lys Ala Leu Ser Val Glu Ser Ser Gln Arg Ser Thr Leu690 695 700Lys Glu Leu Asn Ser Asp Leu Thr Arg Lys Leu Glu Val Gln Thr Gln705 710 715 720Arg Leu Glu Leu Leu Thr Ala Gln Ser Met Ala Asn Glu Asn Ser Gln725 730 735Ala Arg Gln Pro Asp Ala Val Ser Val His Asp Asn Met Pro Tyr Ala740 745 750Asp Asp Asn Met Gln Tyr Ala Asp Glu Gly Asp Glu Val Val Glu Arg755 760 765Val Leu Gly Trp Ile Met Lys Leu Phe Pro Gly Gly Pro Ser Arg Arg770 775 780
Arg Thr Ser Lys Leu Leu785 790<210> 7<211> 2102<212> DNA<213> 马铃薯<220>
<221> CDS<222> (65)..(1699)<400> 7ctgcaggcaa aaaaatacac attctgttta tatattttct attatcaaaa aacagaaat60agaa atg act tta aca ctt caa tca tca gct tct ttt atc aat ttc aaa 109Met Thr Leu Thr Leu Gln Ser Ser Ala Ser Phe Ile Asn Phe Lys1 5 10 15gaa acc aaa ggt gtt aaa gca cct gat gag ttc tta gga atg gtt tct157Glu Thr Lys Gly Val Lys Ala Pro Asp Glu Phe Leu Gly Met Val Ser20 25 30ttt gca caa gcc aag cca tca tgc cgg cta gtc gcg aaa agt tcg atg205Phe Ala Gln Ala Lys Pro Ser Cys Arg Leu Val Ala Lys Ser Ser Met35 40 45caa gaa gct caa ctc tcc cat gag aga atc atg gaa gtg aag aaa att253Gln Glu Ala Gln Leu Ser His Glu Arg Ile Met Glu Val Lys Lys Ile50 55 60gag aaa aga gag aag cta cat gag tta cca gct aat cac agc aat aga301Glu Lys Arg Glu Lys Leu His Glu Leu Pro Ala Asn His Ser Asn Arg65 70 75agt aca agg gta cct gtt ttt gtg atg ctt cca ctt gac acc atg act349Ser Thr Arg Val Pro Val Phe Val Met Leu Pro Leu Asp Thr Met Thr80 85 90 95atg gga ggg aac ttg aac agg cca cga gcg atg aat gcg agt ttg atg397Met Gly Gly Asn Leu Asn Arg Pro Arg Ala Met Asn Ala Ser Leu Met100 105 110gcg ttg aaa agt tct gga gct gaa ggg gtg atg gtg gat gct tgg tgg445Ala Leu Lys Ser Ser Gly Ala Glu Gly Val Met Val Asp Ala Trp Trp115 120 125gga ttg gtg gag aaa gat gga cct ttg aag tat aat tgg gaa gga tat493Gly Leu Val Glu Lys Asp Gly Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Glu Gly Tyr130 135 140gct gag ctt gta aag atg tgt caa gaa cat gga ttg aag ctt caa gtt541Ala Glu Leu Val Lys Met Cys Gln Glu His Gly Leu Lys Leu Gln Val145 150 155gtc atg tct ttt cat cag tgt gga gga aat gtt gga gat tct tgc agt589Val Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ser Cys Ser160 165 170 175
att cct cta cct cca tgg gta ctt gaa gaa atc agc aag aat cct gac637Ile Pro Leu Pro Pro Trp Val Leu Glu Glu Ile Ser Lys Asn Pro Asp180 185 190ctt gtc tac aca gat aga tca ggc cgg aga aat cct gag tat cta tcc685Leu Val Tyr Thr Asp Arg Ser Gly Arg Arg Asn Pro Glu Tyr Leu Ser195 200 205tta ggt tgt gat atg tta cca gta ctc aaa gga aga aca cca att caa733Leu Gly Cys Asp Met Leu Pro Val Leu Lys Gly Arg Thr Pro Ile Gln210 215 220gta tac acc gac tat atg agg agc ttc aga gaa aga ttc aac gaa tac781Val Tyr Thr Asp Tyr Met Arg Ser Phe Arg Glu Arg Phe Asn Glu Tyr225 230 235ttg gga aac gtc ata gtg gaa atc caa gtg gga atg ggt cct tgt gga829Leu Gly Asn Val Ile Val Glu Ile Gln Val Gly Met Gly Pro Cys Gly240 245 250 255gag cta aga tat cca gcc tat cca gaa agc aat ggt aca tgg agg ttt877Glu Leu Arg Tyr Pro Ala Tyr Pro Glu Ser Asn Gly Thr Trp Arg Phe260 265 270cct gga att gga gaa ttc caa tgc tat gac aag tac atg gga gct tca925Pro Gly Ile Gly Glu Phe Gln Cys Tyr Asp Lys Tyr Met Gly Ala Ser275 280 285ttg gca gca gtg gcc aag gca gct gga aag gat gac tgg ggc cag gga973Leu Ala Ala Val Ala Lys Ala Ala Gly Lys Asp Asp Trp Gly Gln Gly290 295 300ggg cct cat gat tct ggg aag tac aac cag ttt cct gag gat act gga 1021Gly Pro His Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gln Phe Pro Glu Asp Thr Gly305 310 315ttt ttc cag agg gat gga aca tgg aac agt gaa tat gga cag ttc ttc 1069Phe Phe Gln Arg Asp Gly Thr Trp Asn Ser Glu Tyr Gly Gln Phe Phe320 325 330 335cta gag tgg tat tca gga aag cta ctg gaa cat ggt gac aga ata cta 1117Leu Glu Trp Tyr Ser Gly Lys Leu Leu Glu His Gly Asp Arg Ile Leu340 345 350gca gca gga gaa agt ata tac caa gga act ggg gct aaa cta tct gga 1165Ala Ala Gly Glu Ser Ile Tyr Gln Gly Thr Gly Ala Lys Leu Ser Gly355 360 365aag gta gct ggg att cat tgg cat tac aat act aga tca cat gct gca 1213Lys Val Ala Gly Ile His Trp His Tyr Asn Thr Arg Ser His Ala Ala370 375 380gag tta act tca gga tat tat aat aca aga cac aga gat ggt tat cta 1261Glu Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asn Thr Arg His Arg Asp Gly Tyr Leu385 390 395cct ata gca cgt atg tta gcg aaa cat ggt gct gta ctt aac ttt aca 1309Pro Ile Ala Arg Met Leu Ala Lys His Gly Ala Val Leu Asn Phe Thr400 405 410 415
tgt atg gaa atg agg gat ggt gaa cag ccc cag agt gca aac tgt tca1357Cys Met Glu Met Arg Asp Gly Glu Gln Pro Gln Ser Ala Asn Cys Ser420 425 430cca gaa ggc tta gtt cga caa gtt aaa act gca gct aga act gct gaa1405Pro Glu Gly Leu Val Arg Gln Val Lys Thr Ala Ala Arg Thr Ala Glu435 440 445gta gaa ctt gct gga gaa aat gct cta gaa agg tat gat gga gga gca1453Val Glu Leu Ala Gly Glu Asn Ala Leu Glu Arg Tyr Asp Gly Gly Ala450 455 460ttt tct caa gtt ttg gca aca agc atg tca gat tct gga aat gga ttg1501Phe Ser Gln Val Leu Ala Thr Ser Met Ser Asp Ser Gly Asn Gly Leu465 470 475agt gca ttt aca ttc ttg cga atg aac aaa cgg ttg ttt gag cca gaa1549Ser Ala Phe Thr Phe Leu Arg Met Asn Lys Arg Leu Phe Glu Pro Glu480 485 490 495aat tgg cgg aat cta gtg caa ttt gtg aag agc atg tct gaa gga ggt1597Asn Trp Arg Asn Leu Val Gln Phe Val Lys Ser Met Ser Glu Gly Gly500 505 510cga aat gct agc ctt cca gag tgt gac tca agc agg aca gac ctc tat1645Arg Asn Ala Ser Leu Pro Glu Cys Asp Ser Ser Arg Thr Asp Leu Tyr515 520 525gta aga ttt atc aaa gag agt cat tct aag aaa gct aca gag gtt gca1693Val Arg Phe Ile Lys Glu Ser His Ser Lys Lys Ala Thr Glu Val Ala530 535 540gta gtg taaagatacg gaactgtata catgtaatat agctatccca ttgtaggtta 1749Val Val545gcaaagaaaa gtggcacata gagtactaaa gtgtcatact catagcacct agaagagtcc 1809acaagaattt gagcctgtgt ctgaaattaa actatagaag acaagaaaaa gaagctaagt 1869acgccaatct ttgccaccct ggttcagagg ttgtgaagct ctgggtcatt gggacagtga 1929gaacaatgag acagtatcat acaaagattt ggataagcat attcttttca ttgtacaaaa 1989attttaaaaa aaatctgcct tccacattta ttattgaaga ataaaggagc taataatatt 2049gcttcctaca gaggcatttt cctgttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactc gag 2102<210> 8<211> 545<212> PRT<213> 马铃薯<400> 8Met Thr Leu Thr Leu Gln Ser Ser Ala Ser Phe Ile Asn Phe Lys Glu1 5 10 15Thr Lys Gly Val Lys Ala Pro Asp Glu Phe Leu Gly Met Val Ser Phe
20 25 30Ala Gln Ala Lys Pro Ser Cys Arg Leu Val Ala Lys Ser Ser Met Gln35 40 45Glu Ala Gln Leu Ser His Glu Arg Ile Met Glu Val Lys Lys Ile Glu50 55 60Lys Arg Glu Lys Leu His Glu Leu Pro Ala Asn His Ser Asn Arg Ser65 70 75 80Thr Arg Val Pro Val Phe Val Met Leu Pro Leu Asp Thr Met Thr Met85 90 95Gly Gly Asn Leu Asn Arg Pro Arg Ala Met Asn Ala Ser Leu Met Ala100 105 110Leu Lys Ser Ser Gly Ala Glu Gly Val Met Val Asp Ala Trp Trp Gly115 120 125Leu Val Glu Lys Asp Gly Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Glu Gly Tyr Ala130 135 140Glu Leu Val Lys Met Cys Gln Glu His Gly Leu Lys Leu Gln Val Val145 150 155 160Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ser Cys Ser Ile165 170 175Pro Leu Pro Pro Trp Val Leu Glu Glu Ile Ser Lys Asn Pro Asp Leu180 185 190Val Tyr Thr Asp Arg Ser Gly Arg Arg Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Leu195 200 205Gly Cys Asp Met Leu Pro Val Leu Lys Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val210 215 220Tyr Thr Asp Tyr Met Arg Ser Phe Arg Glu Arg Phe Asn Glu Tyr Leu225 230 235 240Gly Asn Val Ile Val Glu Ile Gln Val Gly Met Gly Pro Cys Gly Glu245 250 255Leu Arg Tyr Pro Ala Tyr Pro Glu Ser Asn Gly Thr Trp Arg Phe Pro260 265 270Gly Ile Gly Glu Phe Gln Cys Tyr Asp Lys Tyr Met Gly Ala Ser Leu275 280 285Ala Ala Val Ala Lys Ala Ala Gly Lys Asp Asp Trp Gly Gln Gly Gly290 295 300Pro His Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gln Phe Pro Glu Asp Thr Gly Phe305 310 315 320Phe Gln Arg Asp Gly Thr Trp Asn Ser Glu Tyr Gly Gln Phe Phe Leu325 330 335Glu Trp Tyr Ser Gly Lys Leu Leu Glu His Gly Asp Arg Ile Leu Ala
340 345 350Ala Gly Glu Ser Ile Tyr Gln Gly Thr Gly Ala Lys Leu Ser Gly Lys355 360 365Val Ala Gly Ile His Trp His Tyr Asn Thr Arg Ser His Ala Ala Glu370 375 380Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asn Thr Arg His Arg Asp Gly Tyr Leu Pro385 390 395 400Ile Ala Arg Met Leu Ala Lys His Gly Ala Val Leu Asn Phe Thr Cys405 410 415Met Glu Met Arg Asp Gly Glu Gln Pro Gln Ser Ala Asn Cys Ser Pro420 425 430Glu Gly Leu Val Arg Gln Val Lys Thr Ala Ala Arg Thr Ala Glu Val435 440 445Glu Leu Ala Gly Glu Asn Ala Leu Glu Arg Tyr Asp Gly Gly Ala Phe450 455 460Ser Gln Val Leu Ala Thr Ser Met Ser Asp Ser Gly Asn Gly Leu Ser465 470 475 480Ala Phe Thr Phe Leu Arg Met Asn Lys Arg Leu Phe Glu Pro Glu Asn485 490 495Trp Arg Asn Leu Val Gln Phe Val Lys Ser Met Ser Glu Gly Gly Arg500 505 510Asn Ala Ser Leu Pro Glu Cys Asp Ser Ser Arg Thr Asp Leu Tyr Val515 520 525Arg Phe Ile Lys Glu Ser His Ser Lys Lys Ala Thr Glu Val Ala Val530 535 540Val54权利要求
1.编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子，该核酸分子选自(a)编码至少蛋白质的成熟形式的核酸分子，该蛋白质包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列；(b)包含在SEQ ID NO1、3、5或7中所示核苷酸序列的核酸分子；(c)编码下述蛋白质的核酸分子，该蛋白质的氨基酸序列与在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性；(d)互补链与如在(a)或(b)中所限定的核酸分子杂交的核酸分子；(e)包含编码蛋白质的生物活性片段的核苷酸序列的核酸分子，该蛋白质由如在(a)、(b)、(c)或(d)中任何一项所限定的核酸分子编码；及(f)其核苷酸序列由于遗传密码的简并性而从如在(b)、(c)、(d)或(e)中任何一项所限定的核酸分子的序列衍生而来的核酸分子。
2.与权利要求1的核酸分子特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
3.含有根据权利要求1的核酸分子的载体。
4.根据权利要求3的载体，其中的核酸分子以有义方向与调节元件连接，从而确保可翻译的RNA在原核或真核细胞中的转录和翻译。
5.用权利要求1的核酸分子或权利要求3或4的载体转化的宿主细胞或从该细胞传代下来的宿主细胞。
6.根据权利要求5的宿主细胞，其为微生物细胞。
7.根据权利要求5的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞。
8.制备参与淀粉降解的蛋白质或其生物活性片段的方法，其中权利要求5～7中任何一项的宿主细胞在允许蛋白质合成的条件下培养，且其中蛋白质从培养的细胞和/或培养基中分离。
9.由权利要求1的核酸分子编码的或根据权利要求8的方法制备的蛋白质或其生物活性片段。
10.用权利要求1的核酸分子或权利要求3或4的载体转化的转基因植物细胞或从该细胞传代下来的转基因植物细胞，其中编码参与淀粉降解的蛋白质的核酸分子处于调节元件控制之下，从而允许可翻译的mRNA在植物细胞中的转录。
11.含有权利要求10的植物细胞的植物。
12.根据权利要求11的植物，其为有用的植物。
13.根据权利要求11或12的植物，其为淀粉贮藏植物。
14.权利要求13的植物，其为马铃薯植物。
15.根据权利要求11～14中任何一项的植物的繁殖材料，其含有权利要求10的植物细胞。
16.编码与权利要求1的DNA分子的转录物互补的反义-RNA的DNA分子。
17.编码具有核酶活性的RNA的DNA分子，该核酶活性特异性切割权利要求1的DNA分子的转录物。
18.编码具有共抑制作用的RNA的DNA分子。
19.编码RNA的DNA分子，该RNA在植物细胞中表达时由于RNA干涉(RNAi)而导致权利要求1的核酸分子的表达减少。
20.含有权利要求16～19中任何一项的DNA分子的载体。
21.权利要求20的载体，其中的DNA分子与调节性DNA元件联合，从而确保在植物细胞中的转录。
22.含有权利要求16～19中任何一项的DNA分子或权利要求20或21的载体的宿主细胞
23.转基因植物细胞，其中外源核酸分子的存在或表达导致权利要求9的蛋白质的减少的内源活性。
24.权利要求23的转基因植物细胞，其中该减少的内源活性归因于编码权利要求9的蛋白质的内源基因的表达被抑制。
25.权利要求24的转基因植物细胞，其中外源核酸分子选自(a)编码可导致编码权利要求9的蛋白质的内源基因表达减少的反义-RNA或RNAi构建体的DNA分子；(b)可经由共抑制作用而导致编码权利要求9的蛋白质的内源基因表达减少的DNA分子；(c)编码核酶的DNA分子，该核酶可特异性切割编码权利要求9的蛋白质的内源基因的转录物；及(d)经由体内诱变被引入的核酸分子，该诱变导致在编码权利要求9的蛋白质的内源基因中突变或插入异源序列，从而导致权利要求9的蛋白质表达的减少或导致无活性蛋白质的合成。
26.含有权利要求23～25中任何一项的植物细胞的转基因植物。
27.通过转录权利要求16～19中任何一项的DNA分子可获得的RNA分子。
28.生产显示淀粉降解减少的转基因植物细胞的方法，该方法特征在于细胞中以内源形式合成的权利要求9的蛋白质的量在细胞中减少。
29.权利要求28的方法，其特征在于细胞中权利要求9的蛋白质的量的减少由反义作用所导致。
30.权利要求28的方法，其特征在于细胞中权利要求9的蛋白质的量的减少由核酶作用所导致。
31.权利要求28的方法，其特征在于细胞中权利要求9的蛋白质的量的减少由共抑制作用所导致。
32.权利要求28的方法，其特征在于细胞中权利要求9的蛋白质的量的减少由编码该蛋白质的内源基因的突变所导致，该突变经由体内诱变引入。
33.权利要求28的方法，其特征在于细胞中权利要求9的蛋白质的量的减少由RNA干涉(RNAi)作用所导致。
34.通过权利要求28～33中任何一项的方法可获得的植物细胞。
35.含有权利要求34的植物细胞的转基因植物。
36.含有权利要求23～25中任何一项或权利要求34的植物细胞的权利要求35的植物的繁殖材料。
37.包含权利要求9的蛋白质的洗涤剂或冲洗剂。
全文摘要
本发明提供编码淀粉降解酶的核酸分子。此外，提供载体和用此处描述的核酸分子转化的宿主细胞和植物细胞及含有这些细胞的植物。此外，描述了制备显示增加的或减少的淀粉降解的转基因植物的方法。
文档编号C12N5/10GK1610739SQ02808843
公开日2005年4月27日 申请日期2002年4月25日 优先权日2001年4月25日
发明者A·施迪格, J·科斯曼, A·弗洛里奇 申请人:马普科技促进协会