利用电流将核酸和其他生物活性分子注射进高等真核细胞细胞核电路布局的制作方法

专利名称：利用电流将核酸和其他生物活性分子注射进高等真核细胞细胞核电路布局的制作方法
一种依靠电流将核酸、肽、蛋白质和/或其他各种生物活性物质引入真核细胞细胞核；或者利用电流处理细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡的电路布局；其中包括至少两个贮存装置以供进行电荷定量，每一个装置都输入高压电流，并且每一个都至少设置一个功率半导体元件，用以将储存装置内的定量电荷输送入一个小试管的悬浮液中，并且至少有一个监控装置，用以控制功率半导体元件。
背景技术：
由于真核细胞的DNA发生作用的部位是在细胞核内，为了对其过程进行阅读，就必须将经外界提供的DNA输入细胞核内。一些常规的转染方法只能通过细胞膜将DNA输送入细胞质内。因为真核细胞的细胞核膜只是在细胞分裂过程才会短暂地溶解，使DNA能够被动地进入细胞核内，而表达对蛋白质的编码。只有很少数的DNA分子(寡核苷酸)才能够通过细胞核膜上的小孔而自由地扩散。为了能够有效地对静止期或弱分裂过程的细胞有效地进行转染，就必须为使足够量的大型的DNA分子能够通过细胞核膜进入细胞核内创造一种条件。本文所述的一种电流，就具备了在高等真核细胞中实现这种可能性。
技术现状早些时候就已经知道，经过缓冲处理的DNA能够在电流的作用下，引入动物的细胞内。然而，至今所描述的电穿孔技术，都只是将DNA输送入高等真核细胞的细胞质内，所以关于被转染的DNA的表达，仍然有赖于在细胞分裂过程中对于细胞核膜的溶解作用。迄今所知的电穿孔技术采用的电路布局方案，还没有一项涉及能够明确地以电学的方式将DNA带入高等真核细胞细胞核的技术。因而，对于以电力作用对细胞核输送材料的最优化的电转染技术的电路布局方案，更是一无所知。
由美国里士满的Bio-Rad实验院(1986)提出的美国专利号4,750,100中，论述了一种特殊的装置，其结构能够由电容器放电作用，提供最大125安培、最大达3000伏的电力。
美国专利号5,869,326(Genetronics公司，圣地亚哥，美国，1996)论述了一种装置结构，其中设置两个独立的电源，可发放两个、三个或更多个电脉冲。不过，其中除了对于这类电脉冲能够将DNA输送入细胞质的作用之外，并未提出其他权利要求或表示。
美国专利号6,008,038以及欧洲专利申请EP 0 866 123 1(Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH，汉堡，1998)论述了一种器械，能够释放出最大1.5千伏的可持续10-500微秒的短时电脉冲，但是，仍然没有叙明该种装置具有能够将DNA传送入细胞核的某些情况。
总之，至今还未知有哪一种有可能将DNA和/或其他生物活性分子有效地传输入细胞核内，而且细胞死亡率很低的最优化的电路布局方案。
本发明的目的就是，提出一套有可能将DNA和/或其他生物活性分子有效地传输入细胞核内，而且细胞死亡率很低的电路布局方案。
发明论述本发明的目的中提出，在第一个贮存装置载荷一个预设电压(U1)作为参数，在第二个贮存装置载荷一个电压U2＝R×I2×K2，其中，R是试管及其内含悬浮液的电阻值，I2是预定电流值，和K2是与试管的特性相关的修正值。其特征在于，至少带着贮存装置的电容器电压(U1)的第一个脉冲，能够在功率半导体元件的控制下，在预定的时间(T1)内，传入细胞中。
在本发明的研制过程中提出了，在不间断的条件下，至少带有贮存装置的电容器电压(U2)的第二个脉冲，也能够在功率半导体元件的控制下，传入小试管中。其特征在于，在至少一个选定的时间间隔内，能够利用监控装置测定输入的电荷量。其特征在于，预设的所需电荷量与实际输入的电荷量相当；并且当达到或超过预定的电荷量时，功率半导体元件就会阻断。
除了有可能利用贮存装置发出的电流，来测定输入的电荷量之外，还可以使预设的所需电荷量，在一定的时间间隔与实际输入的电荷量相当，并且当达到或超过所需的电荷量时，其功率半导体元件就会阻断。在这种情况下，根据所用的脉冲的形状和数量，对于进行测定而选择的时间间隔能够按顺序分别进行预先确定。例如，可对第一个或其后每一个脉冲测定其输入的电荷量。对于输入的电荷量，可以通过确定至少一个贮存装置的原始电荷量与残存电荷量之差来测定。此时，就有可能按照所采用的脉冲的数量，在一套电路模式中使用至少两个贮存装置中至少一个以上，其中每一个贮存装置至少设置一条高压供电线路、一个监控装置、和一个功率半导体元件，用以对含有细胞悬浮液的试管输送电荷量。对于电脉冲的输送，其第一个功率半导体元件，以持续时间10-100微秒和至少2安培·厘米-2电流密度，输送一个2-10千伏/厘米的脉冲；紧接着其第二个功率半导体元件不间断地输送一个电流密度为2-14安培·厘米2以及最大持续时间为100毫秒的脉冲。从而就可根据输送第一个和/或最好是第二个或每下一个脉冲的情况，来确定输送电荷量的时间间隔。
最好对输入的第二个脉冲的电荷量进行监控，其特征在于，第二个脉冲的启动时间(T2)，可根据对所需的电荷量与在测量时间实际输入的电荷量进行比较来确定，并在达到所需的电荷量时终止。其特征在于，规定以1毫秒为测定周期来检测实际的电荷量。在间隔时间(T2)内，电容器电压按指数规律地下降，并且当达到预定的电荷量(Q2)时，该功率半导体元件就会阻断。
另外还可能，在激发了第一个和/或第二个电脉冲之后的至少一个预定的时间间隔后，测定其流通的电流量，如果其超过或低于所需值时就可重新调整其脉冲的持续时间，以保持其输入电荷量的恒定。或者还可能，在激发了第一个和/或第二个电脉冲之后的至少一个预定的时间间隔后，测定其流通的电流量，如果其超过或低于所需值时，就会产生一个错误信息，对该装置的用户提出警示。更有一种可能是，在激发了第一个和/或第二个电脉冲之后的至少一个预定的时间间隔后，测定其流通的电流量，如果其超过或低于所需值时，就要重新调整其所需值。
为了测定各项必须的常数值，特别是对于盛有细胞悬浮液的试管，可以首先测定装有细胞悬浮液的试管的电阻值。另外一些必需的电脉冲参数，最好是采用手工方法预先选定，或者在必要时，可输入密码进行确定。这样，也就有可能通过卡片阅读器来使用可获取的数据资料。这种卡片阅读器同时还有可能用于贮存对于试管施加电压的时间分布状况，或者将在一个或多个电脉冲输送过程中通过试管的电流量，记录在一种商品供应的记忆卡片上。同时这种记忆卡片最好同时用于贮存需要设置的电脉冲参数。
作为对于电脉冲输送过程进行电路调节的结果，就可实现如下几点要求以可靠和有利的方式来监控至少一个脉冲的设想的电荷量输送情况，和对预设的电荷量进行有控制的及样本依赖性的输送过程，以及在有控制的监控条件下避免样本中细胞的任何损伤。
在对于用户以及所用样本的安全性方面，还对第一个和其后的每一个电脉冲设置了一个过量电流的保护装置。当发生电流超过预设的限制值时，该种保护装置就可将高压脉冲截断。
所述的2-10千伏/厘米高压脉冲，适用于创造如下条件使DNA不必依赖于细胞分裂过程，就能够进入细胞核内。为了减少细胞受损，该高压电脉冲的持续时间，须限制在10到最大200微秒，最好是10-50微秒之间。这就足以不必依赖于细胞分裂过程，而达到转染条件。例如，已经发现这样一种单一的短时高压电脉冲，最适宜于对人脐带内皮细胞的转染。随后，另一种低电场强度或低电流强度或电流密度但持续期长的电流脉冲，可毫无间断地影响其转染过程的效果。显著降低电流密度的结果，该种脉冲就可显著延长持续时间，而较少引起细胞损伤。第二个电脉冲要获得最适宜的电流密度和持续时间，有赖于细胞的类型以及细胞的敏感性。据发现，这样组合的电脉冲，例如，对于人的原始真皮成纤维细胞或黑色素细胞或各种人的血液细胞等是最适宜的。在利用不同的细胞系和表达系统进行的各项实验方面，显示了如下情况第二脉冲的电流密度越高，其对于转染率的影响就越强。电流密度越低时，则第二脉冲促使纯DNA输送入已经被第一脉冲转染的细胞内的数量就越多。被转染的细胞的表达水平，可随着脉冲持续时间的延长而增长。被转染的细胞的组分则不然。为了对于转染率维持一个精确的细胞特异性控制，就必须对表达水平和细胞的活力，以及对第二脉冲的持续时间和电流密度加以控制。
为了对于实际输送入细胞悬浮液中的脉冲达到精确控制，在一项首选的实施例中，对输入的电荷量是进行控制的。为了通过贮存单元中的可选的电容器电压对电流强度或电流密度加以控制，首先就必须预先确定试管及其内含细胞悬浮液的电阻。据发现，当采用铝电极输入脉冲时，由于发生电化学过程，试管的电阻就会出现变化。这种变化可看作是一种脉冲特异性的预定修正值。于是，第二脉冲的精确的脉冲形状就可采用U2＝R×I2×K2通过对电荷的控制来预先确定。其中，U2是贮存装置荷电时的电容器电压，R是试管及其含有的悬浮液的电压，I2是所需的电流，以及K2是脉冲特异性的修正值。
在本发明的一项实施例中，可在脉冲输入开始之前，采用一个试验电压，直接测定试管的欧姆电阻值R。在计算电压U2时，相应地也可予以考虑。由于在脉冲输入之前测定的电阻，比在脉冲输入过程的电阻，有较大的波动。据推测，这是一种电化学作用过程所造成的。并且发现，这对于固定不变地预先确定电阻值R，来计算作为参数的电容器电压值U2是一个有利因素。在本发明的一项首选的实施例中，试管的电阻值是在脉冲开始输送之前进行测定的，并未顾及这是为了确定这是否处于预定的电阻值范围。如果所测定的电阻值是处于该范围之外，其中必有问题，该脉冲输送就不会发出。
对于每一种细胞类型，对其转染率、转染强度以及细胞活力等项指标，都可确定其最适宜条件。在电路布局方案的一项首选实施例中，关于第一脉冲的电场强度和持续时间，以及第二脉冲的起始电流强度或电流密度和经验持续时间，对于各种细胞类型都可通过密码进行选择，并且能够简单地确定其最适宜条件。
这套电路布局方案能够以一种有利的方式，运用于对静止期或分裂过程的真核生物细胞进行转染。同样道理，这套电路布局方案也可适用于对各种原始型的细胞进行转染，例如，人体血液细胞、人体血液中的多能性母源细胞、原始型的人体成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞或黑色素细胞等；并且还可用于诊断目的，或提供制造供体外基因治疗方法用的医药用制品。
本发明的这套电路布局方案，还可适用于，例如，电融合技术，即利用电流将细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡等材料进行融合处理的一套方法。其特征在于，首先将细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡等材料，用水溶液制成适宜密度悬浮液，再将该悬浮液移入试管内，最后对试管内的电极施加一个电压，使悬浮液产生电流。或者，例如，对于黏附的细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡等材料，或还有与细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡等材料黏附的细胞，也都可进行融合处理。
本文所论述的这套电路布局方案能够产生十分高的2-10千伏/厘米的电场强度，具有能够使DNA或各种生物学活性材料不依赖于细胞分裂过程，而进入细胞核内的作用。这种电场强度远远高于在电穿孔技术方面常规使用的，以及远远超过足以有效地在细胞膜上打孔的那种电场强度(平均1千伏/厘米，据Luquin，1997，分子生物学技术7，5)。
本发明的目标内容是，采用电流的一套电路布局方案，实施将核酸、肽、蛋白质和/或其他各种生物学活性物质等，引入高等真核生物细胞的细胞核内。其特征在于，以比足以有效地在细胞膜上打孔的技术高出2-8倍的电场强度，和至少10微秒的持续时间，以及至少2安培·厘米-2的电流密度，实现对细胞核内的导引过程。
采用2-10千伏/厘米，最好是3-8千伏/厘米的脉冲就可实现将核酸、肽、蛋白质和/或其他各种生物学活性物质等，引入高等真核生物细胞的细胞核内。其特征在于，该脉冲最大可持续长达200微秒之久。
这套电路布局方案的设计意图在于，在第一脉冲之后，紧接着不间断地继以具有电场强度为2安培·厘米-2到最大14安培·厘米-2，最好是5安培·厘米-2，并可持续1毫秒到最大100毫秒，最好是50毫秒的一个电流。
由于这套电路布局方案不必通过细胞分裂过程，就能够实施转染作用，因而，除了对于在分裂过程的细胞之外，还可对静止期的或弱相分裂的细胞进行转染。
在另一些首悬的实施例中，高等真核生物细胞包括，原始型的人体成纤维细胞、内皮细胞以及黑色素细胞等。
采用本发明的这套电路布局方案进行转染的真核生物细胞，也可用于诊断以及分析目的，并且还可供生产用于体外基因治疗用的药用制品。
由于本发明的这套电路布局方案有可能不依赖于细胞分裂过程，而实现转染作用，因而就可大大提高转染技术实验的速度。在采用表达媒体的各项转染技术实验中，在采用促催化剂的分析过程中，在转染之后，甚至只要数小时，就可表达出蛋白质。
“生物学活性物质”这一概念，是指凡是能够在细胞内产生生物亲和力的各种肽、蛋白质、多糖、脂质或这类物质的组合物或衍生物，都属于此范围。
具有高度电离强度以及高度缓冲能力的各种电穿孔处理用缓冲液，都特别适用于本发明的这套电路布局方案。
如下方案能够用于导引核酸进入真核生物细胞核内将的1×105-1×107的细胞和10微克DNA放入具有2毫米电极间隙的试管内，加入100微升电穿孔处理缓冲液，在室温中进行10分钟培育。然后按本发明的条件进行转染。随后立即用微升细胞培养基将细胞从试管中洗出，再在37℃培育10分钟。并用温细胞培养基浇注平板进行培育。
举例而言，商品供应的供原核生物细胞施行电穿孔技术处理用的，具有2毫米或1毫米电极间隙的试管，都是适用的试管。
对于在转染与分析过程之间未曾分裂的细胞进行分析，就可证实核酸不依赖于细胞分裂过程而进入细胞核内的情况。这一措施，一方面可通过对未曾分裂的细胞例如人外周血细胞进行转染来实现，另一方面，可对经转染之后数小时的分裂细胞进行分析，此时大部分细胞都已经能够进行分裂。
除了一般使用之外在此使用的缩略词如下FACS荧光活化的细胞分类法FCS 胎牛血清PBMC外周血单核细胞PE 藻红蛋白实施例本发明在此列举了如下一些实施例，但不可认为这是一个限定范围。
实施例1人血液中的细胞毒性T细胞的转染新鲜制备取自人外周血的未经刺激的(未分裂的)单核细胞(PBMC)，用一种可对小鼠1级MHC蛋白质H-2KK·5×106细胞的重链编码的一种媒体，与5微克媒体DNA一起，放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(48毫克分子量×pH-1)和高电离强度(280毫克分子量)的一种缓冲液调制，在室温下以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有电流密度5安培·厘米-2和40毫秒持续时间的电流处理。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温细胞培养基的培养皿内。经24小时培育之后，再对细胞顺次用洋地黄苷-结合的抗-H-2KK-抗体和Cy5-结合的抗-洋地黄苷-抗体，以及与PerCP-结合的抗-CD8-抗体一起培育，以鉴定人体细胞毒性T细胞，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如

图1所示，有74.3％的活细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例2人造血干细胞(CD34)的转染利用磁力细胞分类法对如实施例1所述的新鲜制备的人体单核细胞(PBMC)，进行预先富集处理，取得CD34-阳性细胞。分别将1×106CD34-阳性细胞与1×106人体单核细胞混合，与5微克H-2KK-表达的媒体DNA一起，在室温下放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(54毫克分子量×pH-1)和高电离强度(260毫克分子量)的一种缓冲液调制，以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有电流密度4安培·厘米-2和20毫秒持续时间的电流处理。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温热的细胞培养基的培养皿内。经16小时培育之后，再对细胞顺次用藻红蛋白-结合的抗-H-2KK-抗体，以及与APC-结合的抗-CD34-抗体一起培育，以鉴定人体造血干细胞，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如图2所示，有66.7％的细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例3
人新生儿真皮成纤维细胞(NHDF-Neo)的转染将人新生儿真皮成纤维细胞与5微克H-2KK-表达的媒体DNA一起，在室温下放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(67毫克分子量×pH-1)和高电离强度(380毫克分子量)的一种缓冲液调制，以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有电流密度6安培·厘米-2和33毫秒持续时间的电流处理。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温热的细胞培养基的培养皿内。经5小时培育之后，再对细胞用Cy5-结合的抗-H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如图3所示，有93％的细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例4人新生儿黑色素细胞的转染将人新生儿黑色素细胞(2.5×105细胞)与5微克H-2KK_表达的媒体DNA一起，在室温下放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(54毫克分子量×pH-1)和高电离强度(260毫克分子量)的缓冲液调制，以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有电流密度6安培·厘米-2和33毫秒持续时间的电流处理。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温热的细胞培养基的培养皿内。经5小时培育之后，再对细胞用Cy5-结合的抗-H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如图4所示，有75.1％的细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例5人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染将人脐静脉内皮细胞(1×106细胞)与5微克H-2KK-表达的媒体DNA一起，在室温下放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(67毫克分子量×pH-1)和高电离强度(378毫克分子量)的缓冲液调制，以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温热的细胞培养基的培养皿内。经5小时培育之后，再将细胞用Cy5-结合的抗-H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪(FACScalibur，BectonDickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如图5所示，有49.7％的细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例6人细胞系K562的转染将人细胞系K562(1×106细胞)与5微克H-2KK-表达的媒体DNA一起，在室温下放入具有2毫米电极间隙的试管内，用具有高缓冲性能(24毫克分子量×pH-1)和高电离强度(254毫克分子量)的缓冲液调制，以100微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有电流密度8安培·厘米-2和10毫秒持续时间的电流处理。随后立即用400微升的培养基将细胞从试管中洗出，在37℃培育10分钟。然后移入盛有温热的细胞培养基的培养皿内。经4小时培育之后，再对细胞用Cy5-结合的抗-H-2KK_抗体一起培育，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。用碘化propidium进行染色以测定死亡细胞数。如图6所示，有69.5％的细胞表达H-2KK抗原，相应地表明非常高的转染效率。
实施例7环3-GFP-转染的CHO细胞的转染效率和平均荧光强度为了查明作为在第二脉冲中流动的电荷量的函数的转染细胞的转染效率和平均荧光强度，分别将7×105的CHO细胞与5微克环3-GFP-媒体DNA一起，在室温下，与电穿孔技术用的缓冲液一起，放入具有2毫米电极间隙的试管内，以10微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有不同的电流强度或电流密度和脉冲持续时间变量的若干第二脉冲进行处理。经5小时培育之后，用流式细胞仪进行分析。如图7显示的是，以电流与脉冲时间积分的函数表示的转染效率(电荷量Q)。据发现，随着电流强度的增长，转染效率也会相应地增长(空心圆圈)。在另一方面，对于同一个电流强度，脉冲时间的增加，转染效率就不会有明显的增长(实心圆)。转染的细胞的荧光强度(亮度)可随电荷量Q的增长而增加，并在Q提高时趋向饱和。关于在电流强度增长(空心圆)或脉冲时间延长(实心圆)时，Q是否出现增长则未发现重大的差异。
实施例8环3-GFP-转染的Jurkat细胞的转染效率和平均荧光强度为了查明在第二脉冲中流动的电荷量与转染细胞的转染效率和平均荧光强度之间的函数关系，分别将4×105的Jurkat细胞与5微克环3-GFP-媒体DNA一起，与电穿孔技术用的缓冲液一起，放入具有2毫米电极间隙的试管内，以10微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有不同的电流强度或电流密度和脉冲持续时间变量的若干第二脉冲进行处理。经5小时培育之后，用流式细胞仪对细胞进行分析。如图8显示的是，以电流与脉冲时间积分的函数表示的转染效率(电荷量Q)。如使用CHO细胞时一样，据发现，随着电流强度的增长，转染效率也会相应地增长(空心圆圈)。在另一方面，对于同一个电流强度，脉冲时间的增加，转染效率却不会有明显的增长(实心圆)。转染的细胞的荧光强度(亮度)可随电荷量Q的增长而增加，并在Q提高时趋向饱和状态。关于在电流强度增长(空心圆)或脉冲时间延长(实心圆)时，Q是否出现增长则未发现有何重大的差异。
实施例9H-2KK-转染的Jurkat细胞的转染效率和平均荧光强度为了查明与第二脉冲中流动的电荷量成函数关系的转染细胞的转染效率和平均荧光强度，分别将1×106的Jurkat细胞与2微克的H-2KK_表达的媒体DNA一起，与电穿孔技术用的缓冲液一起，放入具有2毫米电极间隙的试管内，以10微秒持续时间的1000伏脉冲进行转染。再继以具有不同的电流强度或电流密度和脉冲持续时间变量的若干第二脉冲进行处理。经3.5小时培育之后，将细胞与Cy5-结合的抗-H-2KK一起培育，并用流式细胞仪进行分析。如图9显示的是，以电流与脉冲时间积分成函数关系的转染效率(电荷量Q)。据发现，随着电流强度的增长，转染效率也会相应地增长(空心圆圈)。在另一方面，对于同一个电流强度，脉冲时间的增加，转染效率就不会有明显的增长(实心圆)。转染的细胞的荧光强度(亮度)可随电荷量Q的增长而增加，并在Q提高时趋向饱和状态。关于在电流强度增长(空心圆)或脉冲时间延长(实心圆)时，Q是否出现增长则未发现有何重大的差异。
将根据以下附图进一步说明本发明图中图1显示对人体血液细胞毒性T细胞的转染，图2显示对人体多能性母源细胞的转染，图3显示对人新生儿真皮成纤维细胞的转染，图4显示对人新生儿真皮黑色素细胞的转染，图5显示对人脐带内皮细胞的转染，图6显示对细胞系K562的转染(转染之后4小时进行分析)，图7显示利用CHO细胞系进行实验，对于与电流强度、脉冲时间、和电荷量形成函数关系的转染效率，以及与电荷量形成函数关系的表达强度进行的调查研究，图8显示利用Jurkat细胞系进行实验，对于与电流强度、脉冲时间、和电荷量形成函数关系的转染效率，以及与电荷量形成函数关系的表达强度进行的调查研究，图9显示利用Jurkat细胞系和表面标记蛋白质H-2KK进行实验，对于与电流强度、脉冲时间、和电荷量形成函数关系的转染效率，以及与电荷量形成函数关系的表达强度进行的调查研究，图10显示一种电打孔器电路的结构简解，图11显示一种控制仪表盘的电路图解，图12显示一种卡片阅读器的电路图解，图13显示一种供应单元的电路图解，图14显示一种高压电力(HV)供应系统的的电路图解，图15显示一种高压电力(HV)开关的电路图解，图16显示一种电流调节系统的的电路图解，图17显示一种闪光识别系统的电路图解，图18显示一种控制系统的电路图解，以及图19阐明脉冲输送过程序列的一种流程图解。
图1显示对于经用H-2KK-表达的媒体进行转染的人外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞仪分析情况。
这种细胞用洋地黄苷-结合的抗H-2KK-抗体和Cy5-结合的抗洋地黄苷-抗体，以及PerCP-结合的抗-CD8-抗体一起顺次培育，以鉴定人体细胞毒性系T细胞，并用流式细胞仪进行分析(FACScalibur，Becton Dickinson公司)。(FL-2，FL-3＝荧光通道2，3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射，PerCP＝peridinin叶绿素蛋白质，CD＝鉴别群)。
图2显示从经H-2KK_表达的媒体进行转染的人外周血单核细胞(PBMC)富集的CD34-阳性干细胞的流式细胞仪分析情况。这种细胞用藻红蛋白-结合的抗H-2KK-抗体，以及用APC-结合的抗-CD34-抗体顺次一起培育，以鉴定人体CD34阳性造血干细胞，并用流式细胞仪进行分析(FACScalibur，Becton Dickinson公司)。(FL-1，FL-3＝荧光通道1，3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射，PE＝藻红蛋白，APC＝同种藻青蛋白，CD＝鉴别群)。
图3显示经H-2KK-表达的媒体进行转染的人新生儿真皮成纤维细胞(NHDF-Neo)的流式细胞仪分析情况。这种细胞用Cy5-结合的抗H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪进行分析(FACScalibur，Becton Dickinson公司)。(FL-1，FL-2，FL-3＝荧光通道1、2、3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射)。
图4显示经H-2KK-表达的媒体进行转染的人新生儿黑色素细胞(NHEM-Neo)的流式细胞仪分析情况。这种细胞用Cy5-结合的抗H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪进行分析(FACScalibur，Becton Dickinson公司)。(FL-1，FL2，FL-3＝荧光通道1、2、3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射)。
图5显示经H-2KK-表达的媒体进行转染的人脐带内皮细胞(HUVEC)的流式细胞仪分析情况。这种细胞用Cy5-结合的抗H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪进行分析(FACScal ibur，Becton Dickinson公司)。(FL-1，FL2，FL-3＝荧光通道1、2、3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射)。
图6显示经H-2KK-表达的媒体进行转染的人细胞系K562的流式细胞仪分析情况。这种细胞用Cy5-结合的抗H-2KK-抗体一起培育，并用流式细胞仪进行分析(FACScalibur，Becton Dickinson公司)。(FL-1，FL2，FL-3＝荧光通道1、2、3；SSC＝侧方散射，FSC＝前方散射)。
图7显示与流通的电荷量Q形成函数关系的CHO细胞的转染效率以及阳性细胞的平均荧光强度(亮度)的代表性图解情况。这种CHO细胞用环3-GFP表达的媒体进行转染，经5小时之后，用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。实心圆表示对于同样的电流强度(2安培)或电流密度(4安培·厘米-2)的脉冲时间逐渐增加。空心圆表示电流强度的增长。
图8显示与流通的电荷量Q形成函数关系的Jurkat细胞的转染效率以及阳性细胞的平均荧光强度(亮度)的代表性图解情况。这种Jurkat细胞用环3-GFP表达的媒体进行转染，经5小时之后，用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。实心圆表示对于同样的电流强度(2安培)或电流密度(4安培·厘米-2)的脉冲时间逐渐增加。空心圆表示电流强度的增长。
图9显示与流通的电荷量Q形成函数关系的Jurkat细胞的转染效率以及阳性细胞的平均荧光强度(亮度)的代表性图解情况。这种Jurkat细胞用H-2KK-表达的媒体进行转染，经3.5小时之后，用Cy5-结合的抗H-2KK_进行培育，并用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson公司)进行分析。实心圆表示对于同样的电流强度(2安培)或电流密度(4安培·厘米-2)的脉冲时间逐渐增加。空心圆表示电流强度的增长。
图10显示带有必要的各种组件的穿孔器1的简明结构图。其中包括，一个调节元件2，一个控制元件3，连接一个电压供应元件4，以及与贮存装置7，8相连的至少两个高电压电力供应器5，6，和供脉冲输送的两个功率半导体元件9，10。其中的功率半导体元件9，10由控制元件3利用高压开关13和调节元件14，通过电势分压台11，12予以控制。贮存装置7，8直接与功率半导体元件9，10相连接，其特征在于，贮存装置7，8可根据电场强度和脉冲持续时间装入一个或多个电容器。功率半导体元件9可包括例如，一个IGBT，而功率半导体元件10可包括一个MOSFET。不过，“功率半导体元件”这一术语应当概括所有电器组件或组件集合，能够用以在本发明范围之内，根据要求的切换时间，进行电压和电流的切换。IGBT的输出端直接与试管接头相连接，MOSFET10的输出端则是通过电阻元件16和二极管17与试管接头15相连接。因而，如果两个功率半导体元件9，10是同时进行控制的，就不会有脉冲经第二个功率半导体元件10反流回去。对此，二极管17就要与试管接头15上的阴极端相连接。试管的第二个接头18则通过电阻器19接地。电阻器19包括一个分流测量器，可用以测量电压下降，并提供一个超电流切换平台20。该过电流切换平台20可依靠转换器21通过电势分流平台11和高压转换器13来截断脉冲输送过程，而第二个过电流切换平台22则可通过转换器23截断调节元件14对于MOSFET10的控制系统。通过电阻器16提供的电压是输入过电流转换平台22，可在超过最大电流是进行截流。由于电阻器16是直接设置在高电压电路内的，转换器23则设置在电势分流平台平台12之后，因而不会有高电压脉冲能够进入控制元件3，足以保障操作人员的安全。在过电流转换平台20方面，有一个低电阻测量电阻器19设置在试管接头15，18的后面，并且与地连接，从而能够消除高电压脉冲向外传导。根据电穿孔器1的设计用途，可使用与相应的贮存装置7，8配合的一个或多个高电压供电器5，6，和必要的电势分流平台11，12和高电压转换器13，或控制功率半导体元件9，10的调节元件14。在贮存装置7，8内设置有按要求电容量和减弱电压的一个或多个电容器，能够适当地贮存并向试管接头输送高电荷量。
下列的图11到18显示的是在结构图内各种组件的电路图。
图11显示用于馈入须设置的参数信号的控制仪表盘的电路图。其特征在于，该仪表盘可通过按钮开关30进行预选，并且可利用显示元件31进行直观校验。各种发光二极管32会显示机件处于准备操作状态的情况。在电路内已设置了各种必要的参数，并可通过连接器33，对图14所示的控制系统传输。
图12显示卡片阅读器34的电路图。通过该种装置可将一些生物材料读入，进行各种参数的预先设置，并且可向图14所示的控制系统传输。
图13显示供应单元的电路图。其中主要包括一个150/230伏的电压转换器35，一个配以初级配线和电压引线的变压器平台36，以及产生必需工作电压的二级调节平台。为此目的，在整流器37之后插入一组多用途的电压调节器组38。
图14显示两个高电压(HV)供电器5，6的电路图。该两个装置可从结构图中看出。两个高电压供电器都能够由来自供电元件发出的电压U1启动，其特征在于，每一个调节平台39都可从控制系统接收到控制信号U3on、U5on，该实用电压U1，可对装有多个电容器的贮存装置7，8充电，并通过传输平台40转换成脉冲形式。达到要求电压时就通过如图15所示的控制系统输出信号U3、U5读出传出。贮存装置7的电压U5是馈入如图15所示的高电压转换器13，而贮存装置8的电压U3是馈入如图16所示的电流调节平台。
图15显示高电压转换器13的电路图。该高电压转换器13接收由如图16所示的脉冲监控平台所发出的信号HIN，以控制第一功率半导体元件9。这样就可将实用电压U5传输于连接试管的高电压电缆的焊接衬垫41，然后通过与低电阻测量电阻器连接的第二焊接衬垫42接地。当发生预设的最大电流升高而超过限度的事件时，过电流截流平台20就会对如图18所示的控制单元，输送一个控制信号，关闭功率半导体元件9。第一焊接衬垫41还与如图所示的电流调节平台的电压输出端U4相连接，以控制输入试管的电流，使之在高电压脉冲作用下可达到指定的电荷量。图16所示的电流调节平台，通过电势分流平台从图18所示的控制单元接收各种控制信号，并且对于应用于贮存装置8的电压U3，和通过焊接衬垫41输送的电压U4进行调节。在这种情况下，根据本发明的要求，应当采用电荷量Q的调节作用或电流的调节作用，以便在预定的时间间隔，例如1毫秒，确定在贮存装置8内的电荷，并且根据原始电荷来确定其电荷量。
图18显示控制单元3的电路图。该单元可通过手工运作的数值，或者由卡片阅读器34馈入的数值进行预先设定，并可根据进一步的监控信号，来控制如图16所示的电流调节单元14。然而，在通过如图17所示的脉冲监控平台43，经手工激发高电压脉冲之后，就可控制如图15所示的高电压转换器13。因此在该高电压脉冲输送之后，就可通过如图16所示的电流调节单元14，对电荷量进行监控。因而，对于各种脉冲参数，在一个方面，可运用手工方法，或者在另一个方面，可通过卡片阅读器操作，进行预先设定。于是，当以手工方法通过各种调节电子元件激发脉冲时，就可通过第二高电压供电器，输送一个其流通电流受到或不受监控的高电压脉冲，或者如果必要时，也可在电荷量受到监控的条件下，连续输送电流信号。
图19显示根据本发明的一项首选的实施例(参见图10)由控制元件3所控制的脉冲输送过程操作程序的流程示意图。首先，通过手工方法或从记忆卡片中读取(未显示)，预先设定所需的脉冲参数。当程序启动之后(如，按动相应的激发按钮)，先简单地对试管的连接头15，18通入低电压(如，12伏)，测定试管的欧姆电阻，以后再在步骤44进行电流测定(如，2毫秒)。作为提问的45一部分，要校验这一电阻是否处于预定范围之内。若否，就不再继续以后的程序。在本发明的现有实施例中，测定的电阻并不用于以后对载荷电压U2的计算。如果该电阻正规地处于预定范围之内，在步骤46中就可对贮存装置7，8输入预定电压U1和U2。当达到所要求的载荷电压时，就可将高电压供电器5，6的载荷关闭。在以后的脉冲输送过程，就不必对贮存装置重新充电了。在步骤47关闭功率半导体元件9，就可开始高电压脉冲的脉冲输送。结果，就会有相当高的电流通过细胞体。过电流截止平台20可识别过量电流激增的现象，并会打开转换器9以保证安全，同时中断该程序。在本实施例中，在数微秒的预定时间后，终止该高电压脉冲，而随之而来的第二个脉冲则并无阻拦。为此，在步骤48中，在开启第一功率半导体元件9之前短时内，就已关闭第二功率半导体元件10，于是，在两个脉冲之间就可无阻拦地过渡。在此短时间隔过程，两个高电压转换器9，10都同时关闭，二极管17则可防止任何较高的电压漏网从贮存装置7流入贮存装置8。半导体转换器10则保持开放(若是过电流截止平台22使最大电流不超限)，直至预定的电荷Q流入试管。为此目的，在步骤49中，对于流经试管的电流进行了测定，并将其结合在预设的时间间隔(如，1毫秒)中。当达到预定电荷不久(参见提问50)，转换器就会开启，其程序也就终止。贮存装置8的容量要选定，以便在第二脉冲持续过程电压逐渐缓慢下降。如果出现问题，尽管贮存装置几乎已经完全撤空电荷，预定的电荷仍然不能到达，在超过适当选定的时间限度时，这一过程还是会被阻断的。
参数表1.电穿孔器2.调节校准单元3.控制单元4.电压供应单元5.高电压供电器6.高电压供电器7.贮存装置
8.贮存装置9.功率半导体元件10.功率半导体元件11.电势分流平台12.电势分流平台13.高电压转换器14.调节单元15.试管连接头16.电阻器17.二极管18.试管连接头19.电阻器20.过电流截止平台21.转换器22.过电流截止平台23.转换器30.按钮转换器31.显示元件32.发光二极管33.连接器34.卡片阅读器35.双向转换器36.变压器37.整流器38.电压调整器39.调节平台40.变压器平台41.焊接衬垫42.焊接衬垫43.脉冲监控平台44.至51步骤
权利要求
1.一种依靠电流将核酸、肽、蛋白质和/或其他各种生物活性物质引入真核细胞细胞核；或者利用电流处理细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡的电路布局，其特征在于，所述布局包括至少两个贮存装置(7、8)以供进行电荷定量，每一个都输入高压电流(5、6)，每一个都至少设置一个功率半导体元件(9、10)，用以将储存装置内的定量电荷(7、8)输送入一个小试管的悬浮液中，并且至少有一个控制装置以控制功率半导体元件，其中，第一个贮存装置(7)载荷预设电压(U1)作为参数，第二个储存装置(8)载荷电压为U2＝R×I2×K2，其中，R是小试管及其内含悬浮液的电阻值，I2是预定的电流值，K2是考虑小试管特性的修正值，其中，至少带着贮存装置(7)电容器电压(U1)的第一个脉冲能够在预定时间(T1)内通过控制功率半导体元件(9)传入小试管。
2.如权利要求1所述的电路布局，其特征在于，在不间断的条件下，至少一个带有贮存装置(8)电容器电压(U2)的第二个脉冲也可通过控制功率半导体元件(10)传入小试管。
3.如权利要求1或2所述的电路布局，其特征在于，在至少一个可选定的时间内输入的至少一个脉冲的电荷量能够利用监控装置进行测定，且其中预设的电荷量相当于输入的实际电荷量，并当达到或超过要求的电荷量时功率半导体元件(9、10)就会阻断。
4.如权利要求3所述的电路布局，其特征在于，输入的电荷量，是根据相应的贮存装置(7、8)的原始电荷量与残留电荷量之差，进行测定的。
5.如权利要求1-4中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，所述第一个功率半导体元件(9)，对于小试管，以持续时间为10-100微秒和至少2安培·厘米-2的电流密度，输送一个2-10千伏/厘米的脉冲；紧接着其第二个功率半导体元件(10)不间断地输送一个电流密度为2-14安培·厘米-2、最大持续时间为100毫秒的脉冲。
6.如权利要求1-5中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，所述用于测定输送电荷的时间间隔可被指定与输送第一个和/或最好是第二个或每下一个脉冲同步进行。
7.如权利要求1-6中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，可通过比较预定电荷量与测量时间实际输入的电荷量来确定第二个脉冲的启动时间(T2)，并在达到设定的电荷量时结束。
8.如权利要求1-7中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，规定以1毫秒为测定周期来检测实际的电荷量，其中，在时间(T2)期间，电容器电压按指数规律下降，并在达到特定的电荷量(Q2)时，所述功率半导体元件(9、19)就会阻断。
9.如权利要求1-8中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，在输入第一个和/或第二个脉冲后，至少在经过预定间隔时间之后，测定其流通的电流，如果其电流超过或低于预定值，可重新调节脉冲的持续时间，以使输入的电荷量保持恒定。
10.如权利要求1-8中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，在输入第一个和/或第二个脉冲后，至少在经过预定间隔时间之后，测定其流通的电流，如果其电流超过或低于预定值，就会发出一个错误信息。
11.如权利要求1-8中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，在输入第一个和/或第二个脉冲后，至少在经过预定间隔时间之后，测定其流通的电流，如果其电流超过或低于预定值，就要重新调整其预定值。
12.如权利要求1-11中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，预选设定的脉冲参数值(U1、T1、I2、T2、K2)可用手工方法输入，或以密码馈入。
13.如权利要求1-12中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，对第一个和第二个脉冲设定一个过载电流截止条件。
14.如权利要求1-13中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，所述用于计算U2值的小试管电阻R可在控制功率半导体元件之前通过电阻测定进行测量。
15.如权利要求1-13中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，所述用于计算U2值的小试管电阻R是预先设定的。
16.如权利要求1-15中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，预选设定的脉冲参数值(U1、T1、I2、T2、K2、R)可利用记忆卡进行阅读。
17.如权利要求1-16中任一项或数项所述的电路布局，其特征在于，提供一种装置以测定和记录对小试管施加电压的时间分布和/或流经小试管的电流情况，并可将所测定的电压的时间分布状况和/或电流储存在记忆卡内。
18.如权利要求1-17中任一项所述的电路布局在转染静止期或分裂期真核细胞中的应用。
19.如权利要求1-17任何一项所述的电路布局在转染初级细胞中的应用
20.如权利要求1-17任何一项所述的电路布局在转染人血液细胞中的应用。
21.如权利要求1-17任何一项所述的电路布局在转染人血多能祖细胞中的应用。
22.如权利要求1-17任何一项所述的电路布局在转染初级人成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞或黑色素细胞中的应用。
23.如权利要求1-17任何一项所述的电路布局在融合细胞、细胞衍生物、亚细胞颗粒和/或囊泡中的应用。
24.被如权利要求1-17任何一项所述的电路布局转染的真核细胞在分析或诊断目的中的应用。
25.被如权利要求1-17任何一项所述的电路布局转染的真核细胞在制造用于体外基因治疗的药物制品中的应用。
全文摘要
本发明涉及电转染技术或电融合技术的一种新式电路布局，这种布局能够不必依赖于细胞分裂过程，而将DNA和/或其他生物活性分子，输入高级真核细胞或细胞融合体，并能够降低细胞的死亡率。
文档编号C12N15/82GK1503845SQ02808650
公开日2004年6月9日 申请日期2002年4月23日 优先权日2001年4月23日
发明者H·穆勒-哈特曼, G·里曼, K·罗斯曼, C·蒂尔, L·奥特罗格, M·韦格尔, R·克里斯蒂, E·罗巴赫, J·赫尔夫里奇, H·韦森多夫, G·希本柯特恩, H 穆勒-哈特曼, 喾, 孤, 秃, 究绿囟, 穸 , 芈薷, 蚶锲, 锼沟 申请人:埃麦克萨有限公司