专利名称：宿主微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产有用的蛋白质或多肽的宿主微生物，及重组微生物。
背景技术：
微生物已被应用在广泛的有用物质的工业生产中。例如，利用微生物不仅可生产酒精饮料和食品，如味噌(发酵的大豆糊)和酱油(大豆调味汁)，还可生产氨基酸、有机酸、与核酸相关物质、抗生素、糖类、脂类、蛋白质，及很多其它类型物质。在广泛领域中都可发现这些物质的用途，包括食品、药物、日常必需品，如清洁剂和化妆品，以及多种可通过化学方法获得产品的原料。
在通过利用微生物进行有用物质的工业生产中，一个重要问题是生产力的提高。因此，作为一种衡量方法，通过传统遗传技术，如突变技术已经进行了可生产物质的微生物的培养。特别地，归功于微生物遗传学和生物工艺学的进展，现在通过利用遗传技术，如遗传工程技术可以比以往更为有效地进行对这些可生产物质的微生物的培养，也发展了用于遗传重组的宿主微生物。例如，发展了由公认安全并优秀的微生物菌株枯草杆菌(Bacillus subtilis)Marburg No.168改良而获得的微生物菌株。
微生物含有各种不同的基因，所以它们可以使自己适应自然界里的环境改变。因此，在应用几类有限的生产培养基进行的蛋白质或类似物质的工业生产方面，微生物的物质生产力并不一定是高效的。
同样，关于特定类型微生物，已经建立了其参与早期芽孢形成的基因单一缺失或失活的菌株。不过，这些菌株在生产力上并没有足够的改进。
因此，本发明的一个目标是提供一种宿主微生物，该微生物是通过从基因组中清除对蛋白质或多肽的生产无用或有害的基因，或使这些基因失活，从而增加蛋白质或多肽产量。本发明的另一个目标是提供一种重组微生物，该重组微生物是通过把编码了蛋白质或多肽，并被连接到转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域的区域下游末端的基因整合到上述宿主微生物而获得的。本发明还有一个目标是提供一种利用重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。
发明内容
发明人在多种编码于微生物基因组的基因中，广泛寻找对有用蛋白质或多肽的生产无用或有害的基因，并且发现与未经缺失或失活作用的微生物所获得生产力相比较，可通过如下方法提高目标蛋白质或多肽的生产力，即将参与芽孢形成的特定基因从基因组中缺失或使其失活，接着再把编码了目标蛋白质或多肽，并连接到合适的转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域的基因整合进微生物中。
相应地，本发明提供了一种已缺失或失活了参与芽孢形成中期到晚期的一个或几个基因的微生物；也提供了一种通过将编码了蛋白质或多肽，并连接到转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域的区域下游末端的基因整合进基因缺失或基因失活的微生物中，而获得的重组微生物；以及一种利用重组微生物生产蛋白质或多肽的方法。
实施发明的最佳方式用于构建本发明微生物的母体微生物只要含有参与芽孢形成的基因就无需强加限制。优选的母体微生物是形成芽孢的微生物。母体微生物可以是野生型或突变型。特定实例包括属于杆菌属的细菌，如枯草杆菌，属于梭状芽孢杆菌属的细菌，和酵母，属于杆菌属的细菌是优选的。在这些微生物中，枯草杆菌是尤其优选的，因为其完整的基因组信息已被阐明，也建立了遗传工程和基因组工程技术，并且属于枯草杆菌的细菌具有胞外分泌蛋白质的能力。
通过利用本发明微生物产生的目标蛋白质或多肽的实例包括在食品、药物、化妆品、清洁剂、纤维处理、医疗检测用药物等方面有用的酶；及蛋白质和多肽，如生理学活性因子。
分散存在于基因组上的250个或更多的基因被确定参与了芽孢形成。在这些基因当中，本发明中待缺失或失活的目标基因优选的是促进芽孢形成的基因，这种基因的实例包括编码了芽孢形成期特异性σ因子的基因，参与任何σ因子基因表达的基因，以及参与激活任何σ因子的基因。另外，通过任何σ因子转录，从而参与促进芽孢形成的基因也被包括在本发明的范畴内。已知芽孢形成早期(0-I期)的胞外酶，如蛋白酶和淀粉酶的产量与对数生长阶段产生的量相比是增加的。因此，待缺失或失活的目标基因优选的是特定于芽孢形成中期到晚期表达，从而参与芽孢形成的一个或几个基因。特定地，目标基因优选的是涉及芽孢形成II、III、IV或V期，更为优选的是II或III期，特别优选的是II期的一个或几个基因。本发明发现这些基因不直接涉及目标蛋白质的生产，并且对工业生产应用的普通培养基中的微生物的生长是非必须的。
表1和表2列举了枯草杆菌的这些基因。
本说明书基于Nature 390，249-256(1997)中报导的，及JAFANJapan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)(http://bacillus.genome.ad.jp/)出版的枯草杆菌基因组资料库，描述了基因的名称、位点、碱基数目及功能。
表1
表2
下列基因被认为与表1所列举基因相当与表1或表2所列枯草杆菌基因功能相同的基因；来源自其它微生物的基因，优选的是来自杆菌属细菌，并且表现出与表1所列基因中的一个基因有70％或更多同源，优选的是80％或更多，更为优选的是90％或更多同源性。这些基因被包括在本发明的待缺失或失活的基因当中。氨基酸序列之间的同源性是通过Lipman-Pearson方法计算的(Science，227，1435(1985))。
当一个或几个选自上述基因的基因被缺失或失活时，微生物的芽孢形成所需的化学能消耗便降低了，蛋白质或多肽的生成期被延长，或获得其它益处，使得提高了蛋白质或多肽的生产力。
对被缺失或失活的基因数目无需强加限制，只要有至少一个基因被缺失或失活即可。数目可以是3个或更多，或5个或更多。优选的是2个或3个，尤其优选的是2个。
为构建本发明的微生物，还可缺失或失活除上述基因外的一个或几个基因。通过这样组合，便可预期在改进生产力方面获得更大的效果。
基因的缺失或失活可通过已知方法进行。实例包括顺序地缺失或失活目标基因的方法，以及通过缺失或突变使一个或几个任意DNA片段失活，并通过适当技术根据蛋白质生产力分析和评估相应基因的方法。
通过例如同源重组方法缺失或失活目标基因。特定的是通过利用合适的质粒载体进行克隆而获得含目标基因的DNA片段。其它方法中，是采用如下方式使所获DNA片段突变的，即通过常规基因工程技术使基因的全部区域或目标基因的部分区域缺失，而保留与目标基因的相应末端相连的DNA片段；通过碱基替代、移码突变等方法引起结构基因中的无意义突变；或者通过克隆化或PCR分离目标基因片段，再将DNA片段插入分离的目标基因片段中的方法。随后将突变DNA片段导入母体微生物，从而在与目标基因相应末端邻近的两个区域，与母体微生物的基因组同源重组。这样，基因组上的目标基因便可被已缺失或失活目标基因的DNA片段所替代。
当以枯草杆菌细菌为母体微生物以获得本发明微生物时，通过同源重组缺失或失活目标基因的一些方法已有报导(如Mol.Gen.Genet.，223，268(1990))。本发明的宿主微生物可通过重复这种方法获得。
也可通过与上述类似的方式，利用片段进行克隆和同源重组，从母体微生物获得一个或几个任意DNA片段；或可选地通过γ射线照射母体微生物，从而使一个或几个任意DNA片段缺失或失活。
本发明的重组微生物可通过如下方法获得，即将编码目标蛋白质或多肽的基因(下文见“目标蛋白质或多肽基因”)整合到已缺失或失活一个或几个参与芽孢形成中期到晚期的基因的微生物中。
对目标蛋白质或多肽基因无需强加限制。这种基因的实例包括工业用酶，如用于生产清洁剂、食品、纤维、饲料、化学制品的酶，医用酶，诊断用酶，以及生理学活性肽。工业用酶基于其功能可分类为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶/合成酶及其它。目标蛋白质或多肽基因优选的实例包括编码水解酶，诸如纤维素酶、α-淀粉酶或蛋白酶的基因。特定实例包括属于多糖水解酶分类中的家族5的纤维素酶(Biochem.J.，280，309(1991))。其中，例证了来源自微生物的纤维素酶，特别是来源自杆菌属细菌的纤维素酶。更多特定实例包括来源自杆菌属细菌，并具有SEQ ID NO1或2序列的碱性纤维素酶；及具有特定序列的纤维素酶，该序列具有与SEQ ID NO1或2序列70％或更多，优选的80％或更多，更为优选的90％或更多的同源性。氨基酸序列之间的同源性是通过Lipman-Pearson方法测定的(Science，227，1435(1985))。α-淀粉酶的实例包括来源自微生物的α-淀粉酶，特别优选的是来源自杆菌属细菌的液化型淀粉酶。蛋白酶的实例包括来源自微生物的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，特别是来源自杆菌属细菌的蛋白酶。
目标蛋白质或多肽基因在其上游末端被理想地连接到参与基因转录或翻译、或基因产物分泌的调节区域，即含有启动子和转录起始点的转录起始调节区域、含有核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始区域、或合适形式的分泌信号肽区域。例如，目标蛋白质或多肽基因被理想地连接到纤维素酶基因包含的上述调节区域中，该纤维素酶基因来源自Japanese Patent Application Laid-Open(kokai)No.2000-210081或Hei 4-190793所描述的杆菌属细菌，以及被连接到纤维素基因上游末端邻近区域包含的上述调节区域中并具有1kb或小于1kb，优选的0.6kb或小于0.6kb的长度。特定的在其它情况当中，目标蛋白质或多肽基因被理想地连接到SEQ ID NO1或2序列，或与SEQ ID NO1或2序列一定程度上同源、具有与上述序列相似调节功能的碱基序列中。
本发明的重组微生物可通过如下方法获得，使含有目标蛋白质或多肽基因的DNA片段与合适的质粒载体组合，并通过常规转化方法将重组质粒整合进宿主微生物。可选地，本发明的重组微生物可通过另一方法获得，即利用被连接到宿主微生物基因的合适同源区域中的DNA片段，将其直接整合进宿主微生物基因。
利用本发明的重组微生物进行目标蛋白质或多肽的生产可通过如下方法完成将重组微生物接种至含有可同化碳源、氮源和其它基本成分的培养基中，通过常规方法培养重组微生物，并于培养完成后，收集并纯化目标蛋白质或多肽。
如上所述，可生成已缺失或失活芽孢形成相关基因的目标宿主微生物，并且通过利用宿主微生物可生产目标重组微生物。另外，利用重组微生物，可有效生产有用的蛋白质或多肽。通过利用枯草杆菌制得α-淀粉酶或纤维素酶的实例情况将于下文特别描述。
例如，当枯草杆菌属细菌编码RNA聚合酶亚基σF因子的sigF基因(768bp)被缺失时，可应用下列操作步骤，该RNA聚合酶亚基σF因子在芽孢形成II期或随后时期出现的前芽孢中表达。
第一步，从枯草杆菌菌株的宿主微生物中提取基因组基因。以基因组基因为模板，通过SOE(重叠延伸拼接法)-PCR(Gene，77，61(1989))或其它方法将标记基因，如抗氯霉素基因插入待连接片段，即位于sigF基因起始密码子上游的DNA片段和位于sigF基因终止密码子下游的DNA片段之间，使二者连接起来。
下一步，通过适当方法利用上一步所获DNA片段转化宿主枯草杆菌属细菌，并基于氯霉素抗性或其它特性，分离转化株，促成sigF基因的上游和下游区域的同源重组，从而获得相应的转化株，该转化株中，位于基因组上的sigF基因被诸如抗氯霉素基因等标记基因所替代。
其后，将含有编码α-淀粉酶或纤维素酶的基因的质粒导入上一步获得的转化株中，并以枯草杆菌的原始细胞系为对照。在合适的条件下，例如在营养培养基中进行震荡，培养已获得的重组体。检测培养溶液上清的α-淀粉酶活性或纤维素酶活性，并将其生产力与枯草杆菌原始细胞系的生产力相比较，从而确认通过缺失sigF基因可获得增加量的目标产物。当分离和纯化培养液时，可获得α-淀粉酶和纤维素酶。
实施例实施例1从枯草杆菌168中提取基因组DNA。以提取的基因为模板，使基因组上在sigF基因(碱基号2442658←2443425)上游末端与其邻近的一个长度为1.5-kb的DNA片段(A)，和在sigF基因下游末端与其邻近的一个长度为1.5-kb的DNA片段(B)倍增。以质粒pC194为模板，单独倍增含有抗氯霉素基因的0.9-kb DNA片段(C)。通过SOE-PCR按顺序连续连接片段(A)、(B)、(C)，从而制得长度为3.9-kb的DNA片段。通过适当方法利用获得的DNA片段转化枯草杆菌168。在含有氯霉素的LB琼脂培养基上培养枯草杆菌168，分离菌落作为转化株。通过PCR和测序证实该转化株具有的基因组中，含sigF基因(2442632-2443318)的区域缺失，并被抗氯霉素基因替代。基因组的下列区域中的每一个都被分别缺失，并以与上述相似的方式被抗氯霉素基因替代含sigE基因的区域(1604136-1604976)；含spoIISB基因的替代部分(1347913←1348083)的区域(1347781-1348081)；含spoIIE基因的替代部分(70536→73019)的区域(70537-73018)；含sigG基因的替代部分(1605025→1605807)的区域(1605083-1605877)；含spoIVCB基因(2652262→2652732)的区域(2652156-2652723)；或含从spoIVCB基因到spoIIIC基因的区域(2652262→2701023)的区域(2652156-2701031)，从而制得参与芽孢形成的基因缺失的微生物。
将来源自杆菌sp.KSM-S237(Japanese Patent Application Laid-Open(kokai)No.2000-210081)的碱性纤维素酶基因的一个DNA片段(3.1kb)导入穿梭载体pHY300PLK的限制酶BamHI切割点，从而制得重组体质粒pHY-S237。通过原生质体方法将质粒整合进实施例1制得的每个基因缺失微生物内，并以枯草杆菌168作为对照。在LB培养基(10ml)中，37℃，震荡条件下培养获得的微生物过夜。将相应的培养液(0.05ml)接种至2×L-麦芽糖培养基中(50ml；2％蛋白胨，1％酵母提取物，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5-ppm 4-5水合硫酸锰，15-ppm四环素)，然后在30℃震荡条件下培养3天。培养完成后，通过离心从培养液中除去细胞，并检测上清液中的碱性纤维素酶活性，以测定培养期间细胞外分泌的碱性纤维素酶的数量。结果如表3所示，发现与对照微生物枯草杆菌168(野生型)相比，所有缺失了参与芽孢形成的基因的微生物都分泌了增加量的碱性纤维素酶。
表3
工业适用性当应用本发明微生物时不形成芽孢。因此，本发明能够生产目标蛋白质或目标多肽，同时降低能量损失、副产物的生产和特定生产速度，以大量减少培养基不必要的消耗。此外，蛋白质或多肽的生产期可以被延长，由此可以有效地制得目标产物。
序列表<110>花王株式会社<120>宿主微生物<130>KS-660<140>
<141>
<150>JP P2001-160520<151>2001-05-29<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>杆菌sp.KSM-S237<220>
<221>CDS<222>(573)..(3044)<220>
<221>sig_肽<222>(573)..(659)<220>
<221>mat_肽<222>(660)..(3044)<400>1gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata 240
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<221>CDS<222>(610)..(3075)<220>
<221>sig肽<222>(610)..(696)<220>
<221>mat肽<222>(697)..(3075)<400>2agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta 600ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att 651
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1.一种微生物，其中缺失或失活了一个或几个参与芽孢形成中期到晚期的基因。
2.权利要求1所述的微生物，该微生物是属于杆菌属的细菌。
3.权利要求2所述的微生物，其中属于杆菌属的细菌是枯草杆菌。
4.权利要求1～3中任何一项所述的微生物，其中基因是于芽孢形成的II、III、IV和V期中的任意一个时期表达的，从而参与了芽孢形成。
5.权利要求1～4中任何一项所述的微生物，其中待缺失或失活的基因选自枯草杆菌的sigE基因、sigF基因、spoIIE基因、spoIISB基因、sigG基因、属于从枯草杆菌的spoIVCB到spoIIIC区域中的基因、与这些基因中的任意一个或几个等同的基因。
6.一种重组微生物，通过如下方法获得将编码了蛋白质或多肽，并连接到转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域的区域下游末端的基因整合进权利要求1～5中任何一项所述的微生物中。
7.权利要求6所述的重组微生物，其中转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域来源自杆菌属细菌的纤维素酶基因，或来源自纤维素酶基因的上游延伸的1 kb区域。
8.权利要求6或7所述的重组微生物，其中转录起始调节区域、翻译起始调节区域、或分泌信号区域来源自具有SEQ ID NO1或2序列，或具有与SEQ ID NO1或2序列有70％或更多同源性序列的纤维素酶基因。
9.一种通过利用权利要求6～8中任何一项所述的微生物生产蛋白质或多肽的方法。
全文摘要
一种已缺失或失活一个或几个参与芽孢形成中期到晚期的基因的微生物；一种利用微生物制得目标产物(蛋白质)的方法。当应用该微生物时，不形成芽孢，由此能够生产目标产物(蛋白质)，同时降低能量消耗、副产物的生产和特定生产速度，以减少培养基的不必要的消耗。此外，生产期可以被延长，从而可以有效地制得目标产物(蛋白质)。
文档编号C12N1/20GK1513057SQ02811118
公开日2004年7月14日 申请日期2002年5月28日 优先权日2001年5月29日
发明者泽田和久, 远藤圭二, 小泽忠弘, 东畑正敏, 尾崎克也, 也, 二, 弘, 敏 申请人:花王株式会社