专利名称：培养虫生真菌之固体培养基及方法
技术领域：
本发明提供了培养虫生真菌之固体培养基，以及利用此培养基培养虫生真菌之方法。
背景技术：
喷洒化学农药长期来一直是农业上控制病虫害之主要方法，惟因长久之不当使用，不仅引发抗药性之问题，化学农药更严重污染生活环境。
自从Metschnikoff于1879年以黑僵菌对奥国塞丽金龟及甜菜点腹象鼻虫进行感染实验起，以生物防治法控制农作物病虫害感染之观念于是孕育而生。于生物防治产品中，虫生真菌(entomogenous fungi)为具有潜力之虫生病原微生物(entomopathogenic microorganisms)，因虫生真菌可寄生于昆虫体内，并在其体内大量增殖并引起昆虫之死亡。曾被研究过之虫生真菌大约有100个属，超过800个种，其中最常见之种类为黑僵菌(Metarhizium anisopliae)、白僵菌(Beauveriabassiana)及绿僵菌(Nomureae rileyi)，其皆属不完全菌亚纲(FungiImprefecti)中链孢霉目(Moniliales)之链孢霉科(Monilianceae)，其皆系以分生孢子(conidia)发芽穿过昆虫体壁造成感染，菌丝于昆虫体内吸收养分并杀死昆虫，菌丝再穿透体壁形成分生孢子柄(conidophore)，由此柄产生之分生孢子可藉由风及雨等媒介感染其它虫体。
因此，是否能以人工培养并产生大量之分生孢子，便成为虫生真菌应用之限制条件。
发明内容
本发明提供一新的固体虫生真菌培养基，其可于较经济之情况下，大量且快速地培养虫生真菌。
本发明并提供利用本发明之固体培养基培养虫生真菌之方法。
具体实施例方式
一般培养虫生真菌之方法，可分为液态发酵、固体发酵及液固两相发酵。由于液态发酵及液固两相发酵需昂贵之设备及专业技术，且液态发酵不利于孢子之产生，相较之下，固体发酵就较为简易，且能提供良好之产孢条件。故于现今培养虫生真菌之技术中，以绿僵菌为例，多系以米作为培养基，将米烹煮后，装填入太空包中，经灭菌及接种后，培养10至18天即可产生约1-3×109分生孢子/克。但由于米经烹煮后之粘度较高，故于装填太空包、接种或搅拌时，皆须以人工处理，耗费大量之人工及时间，并不利于大量生产。
本发明提供包含经煮过之大麦仁或大麦仁加工制品之固体培养基，其可用于培养虫生真菌。当利用此固体培养基培养虫生真菌时，由于经煮过之大麦仁及大麦仁加工制品之粘度较低，可利用自动化机械进行装瓶、接种、振荡甚至回收之工作，以节省人工及时间；且经煮过之大麦仁及大麦仁加工制品之表面积较大，具有增加孢子形成面积之优点，且由于其通气性较佳，不仅可提供充分之换气量，更有助于热气之排放而有利于温度之降低，进而提供稳定之产孢培养环境；再者，于无需其它添加物之情况下，即可利用本发明之固体培养基培养虫生真菌，并达到每克约1-3×109个分生孢子之产量。故本发明固体培养基具有成本低且操作方便之优点。
根据本发明，其中经煮过之大麦仁系指经蒸气蒸煮或以沸水烹煮之去壳去皮大麦植物(Hordeum vulgare)榖粒；且大麦仁加工制品系指大麦仁榖粒经由选自加热、干燥、研磨、加压成形、复水或其组合所组成之群之处理方式处理后之制品，其较佳为经复水之麦片。
根据本发明，其中之虫生真菌系指，例如选自白僵菌属(Beauveria)、黑僵菌属(Metarhizium)、干枝孢属(Verticillium)、被毛孢属(Hirsutella)、绿僵菌属(Nomuraea)、曲霉属(Aspergillus)、座壳孢属(Aschersonia)、拟青霉属(Paecilomyces)、多利卡霉属(Tolypocladium)、虫疫霉属(Erynia)、虫草属(Cordyceps)、腔孢属(Coelomyces)及链壶菌属(Lagenidium)等属之真菌，其中较佳为白僵菌、黑僵菌、绿僵菌及冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，更佳为绿僵菌。
根据本发明之固体培养基，其中经复水之麦片系指将麦片与水以约1∶1至约5∶1重量比之比例混合，其较佳之比例为约3∶1.2。
此外，本发明之固体培养基可进一步包含其它之碳源、氮源及/或矿物质以增加孢子之产量；而该碳源及氮源可为任意之公知来源，其中碳源包括但不限定为再来米粉、玉米粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、甘油或其组合；氮源包括但不限定为大豆粉、黄豆蛋白、蛋白胨、酵母萃取物、尿素、氯化铵、硝酸钾、氨基酸或其组合。而矿物质包括但不限定为Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+或其组合。
本发明进一步提供利用本发明固体培养基培养虫生真菌之方法，其包括将本发明之固体培养基置于发酵槽或小型培养容器中，于适当之条件下培养。
根据本发明，小型培养容器为任何容量为3公升以下，透明或半透明之定型或不定型容器，其包括但不限定为太空包、透明或半透明之玻璃或塑料容器，例如玻璃三角瓶或血清瓶。
根据本发明较佳之实施方案，本发明之培养方法系于小型培养容器中进行，例如将煮过之大麦仁或经复水之麦片以分装机定量充填至小型培养容器中，容器经封盖机封盖后即可经由输送带送入杀菌系统中进行灭菌，灭菌冷却后之培养容器即可进行自动化或人工接菌之工作，将接菌后之培养容器置于适当之培养条件下培养，以获得所欲之虫生真菌。
下述实施例仅系用于例示本发明，而非用以限定本发明。
实施例1固体培养基之制备将去壳去皮之大麦仁于滚水中煮约3至4分钟，捞起沥干，且将麦片与水以3∶1.2重量比之比例混合后，分别将约200克煮过之大麦仁及经复水之麦片分别加入500毫升之三角瓶中，盖上塞子后，于120℃及1.4公斤/平方厘米压力下灭菌约15至20分钟，待冷却后备用。
实施例2种子培养物之培养将绿僵菌(获自台中县农业药物毒物试验所生物药剂组，编号F055)接种于PDA(融合形马铃薯20％，葡萄糖(Bacto Dextrose)2％，琼脂2％)斜面上，于24℃下培养14天后，以无菌水将孢子洗下。将收集液稀释至每毫升约含有108以上个孢子，作为接种用之种培养物。
实施例3绿僵菌孢子之大量生产将2毫升由实施例2获得之种培养物添加至实施例1所制备之培养瓶中，于24℃及适当光照下静置培养14日后，以100毫升之冲洗液(体积比为水∶非离子性界面活性剂＝3,000∶1)冲洗三次，将孢子由培养基中洗出。孢子悬浮液经过滤及稀释后，发现不论以煮过之大麦仁或经复水之麦片作为培养基，每克培养基皆可产生约3×109个分生孢子。
权利要求
1.一种培养虫生真菌之固体培养基，其包含经煮过之大麦仁或大麦仁加工制品。
2.根据权利要求1之固体培养基，其中该虫生真菌为白僵菌属(Beauveria)、黑僵菌属(Metarhizium)、干枝孢属(Verticillium)、被毛孢属(Hirsutella)、绿僵菌属(Nomuraea)、曲霉属(Aspergillus)、座壳孢属(Aschersonia)、拟青霉属(Paecilomyces)、多利卡霉属(Tolypocladium)、虫疫霉属(Erynia)、虫草属(Cordyceps)、腔孢属(Coelomyces)或链壶菌属(Lagenidium)之真菌。
3.根据权利要求2之固体培养基，其中该虫生真菌为黑僵菌、白僵菌、绿僵菌或冬虫夏草。
4.根据权利要求1之固体培养基，其中该加工制品为经复水之麦片。
5.根据权利要求4之固体培养基，其中该经复水之麦片是将麦片与水以1∶1至5∶1重量比之比例混合而得。
6.根据权利要求5之固体培养基，其中该经复水之麦片是将麦片与水以3∶1.2重量比之比例混合而得。
7.根据权利要求1之固体培养基，其视需要进一步包含其它之碳源、氮源及矿物质。
8.一种培养虫生真菌之方法，其包含将虫生真菌接种于根据权利要求1至7中任一项之固体培养基，并于适当之条件下培养。
9.根据权利要求8之方法，其中该真菌系为白僵菌属(Beauveria)、黑僵菌属(Metarhizium)、干枝孢属(Verticillium)、被毛孢属(Hirsutella)、绿僵菌属(Nomuraea)、曲霉属(Aspergillus)、座壳孢属(Aschersonia)、拟青霉属(Paecilomyces)、多利卡霉属(Tolypocladium)、虫疫霉属(Erynia)、虫草属(Cordyceps)、腔孢属(Coelomyces)或链壶菌属(Lagenidium)之真菌。
10.根据权利要求9之方法，其中该虫生真菌为黑僵菌、白僵菌、绿僵菌或冬虫夏草。
11.根据权利要求8之方法，其中该虫生真菌是于发酵槽中培养。
12.根据权利要求8之方法，其中该虫生真菌是于小型培养容器中培养。
13.根据权利要求12之方法，其中该小型培养容器为玻璃或塑料容器。
14.根据权利要求13之方法，其中该玻璃容器为三角瓶或血清瓶。
全文摘要
本发明涉及培养真菌之固体培养基，其包含经煮过之大麦或大麦加工制品。本发明同时提供了利用此固体培养基培养虫生真菌之方法。
文档编号C12N1/14GK1521254SQ03102179
公开日2004年8月18日 申请日期2003年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者林石源 申请人:林石源