专利名称：一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法
技术领域：
一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法，涉及红曲产品的制备，尤其是无桔霉素红曲产品的制备。
背景技术：
近年来，含功能性成分莫纳可林K(Monacolin K)的功能性红曲，也称降脂红曲受到关注，国内外己能批量生产。1995年法国人Blanc发现红曲霉能产生真菌毒素桔霉素(Citrinin)后，红曲产品的食用安全性受到挑战。在不少国家，红曲产品在食品及药品中的应用还未经安全性评估及得到法定认可。随着中国加入WTO，红曲产品要走向世界，获得权威机构的认可是至关重要的。现行红曲产品的国家标准中，没有桔霉素限量指标。我们发现红曲霉菌种普遍具有产生桔霉素的潜在能力；我们还对国内外部分红曲产品中的桔霉素含量进行过检测，检测结果表明，我国红曲产品中桔霉素含量偏高。红曲桔霉素事关食品安全，根据世界一些发达国家对食品和药品中桔霉素含量严加控制的事实，红曲桔霉素的现状，对食品安全提出了新的挑战，并有可能影响我国红曲产品的出口。
我们同时对红曲霉的两个重要代谢产物莫纳可林K及桔霉素，在不同发酵条件下的生产能力进行研究。据了解，国内外在此研究方向还没有相关文献的报道。
从生产无桔霉素红曲产品这个角度来说，有两个层次的工作，其一是确定所使用的红曲霉菌是否具有产生桔霉素的能力(菌种遗传特性所决定)；筛选不产桔霉素的红曲霉菌种是关键；其二是，若菌种本身具有产生桔霉素的潜力，是否可以通过发酵条件(培养基，培养条件)的优化控制桔霉素的产生，包括对红曲产品桔霉素含量的检测。
降脂红曲产品中的一个重要指标是莫纳可林K的含量。由于莫纳可林K在发酵产品中有开环和闭环(或酸式和内酯式)两种结构同时存在，而开环式莫纳可林K的生理功能比闭环莫纳可林K要强(闭环结构的在体内要转变成开环结构)，我们对发酵的降脂红曲产品中这两者的比例也进行了调查。
发明内容
本发明目的是提供一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法。该红曲粉不同于普通红曲粉，其不含桔霉素(Citrinin)；含天然红曲色素(Monascuspigments)，色价200-600U/g(按红曲米国家标准1985年版方法)；含功能性成分莫纳可林K(Monacolin K，或Lovastatin，Mevinolin)4-12g/kg。莫纳可林K中开环结构(也称为酸式结构)比例占70-90％。
技术方案采用红曲霉菌(Monascus sp.)9901菌或红曲霉菌(Monascus sp.)9906菌。该菌株为江南大学生物工程学院生物制药研究室保藏和提供。经过优化条件下液态种子培养，得到液态种子，再用谷物原料和水，采用固态发酵技术，最后采用灭菌干燥磨粉而制得无桔霉素高色价功能性红曲粉；或液态种子，接入液态培养基，采用液体发酵技术，最后采用均质处理，喷雾干燥而制得无桔霉素高色价功能性红曲粉。
红曲霉培养及发酵菌种为本实验室保藏和提供的红曲霉9901菌种或红曲霉9906菌种。
红曲霉是否产生桔霉素的鉴定培养基(YES培养基和MSG培养基)YES培养基(M1，g/L)酵母浸膏，20；蔗糖，60；30℃静止培养2周。
MSG培养基(M2，g/L)葡萄糖，50；谷氨酸钠，6；K2HPO4·3H2O，5；KH2PO4，5；MnSO4·H2O，0.03；FeSO4·7H2O，0.01；MgSO4·7H2O，0.5；CaCl2，0.1；ZnSO4·7H2O，0.05。30℃摇瓶培养1周。
上述两株红曲霉菌种，经过YES培养基和MSG培养基培养，其培养液的65％的乙醇萃取物，用高效液相色谱法的荧光检测器法或用酶联免疫法测不到桔霉素，作为该两株红曲霉菌种确实不含桔霉素的证据。同时，对本技术所制得的红曲粉的萃取物(甲苯/乙酸乙酯/甲酸，体积比7/3/1)，用高效液相色谱法的荧光检测器法或用酶联免疫法测不到桔霉素，作为所制备的红曲产品确实不含桔霉素的证据。
液态种子培养基(M3)每1000mL中，葡萄糖60g，蛋白胨25g，NaNO32g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO41g，pH5.0。装液量100mL/500mL三角瓶。30℃培养2-3天。得一级种子培养液。
液态种子培养方法摇瓶培养得一级种子，一级种子可用于二级摇瓶种子和种子罐培养。
红曲米的固态发酵原料为谷物原料(包括大米，小米和小麦等)。三角瓶或塑料瓶培养时装料量100-200g/1000mL瓶。加等量的水。pH自然，先常压蒸煮10min，再121℃灭菌20min，冷却后，接入液态种子10-50％(体积质量比，以原料质量为基准，V/W)，三角瓶或塑料瓶培养或固体发酵罐发酵。发酵温度25-32℃。发酵时间2-3周。发酵环境湿度控制在60-90％。得到的红曲米经100℃灭菌30min，50℃烘干24小时，磨粉，得到红曲米粉产品，含功能性成分莫纳可林K(MonacolinK，或Lovastatin，Mevinolin)4-12g/kg。莫纳可林K中开环结构(也称为酸式结构)比例占.70-90％。产品中含红曲色素200-600U/g，不含桔霉素。
用固体发酵罐生产，其菌种，液态种子及接种量和固体发酵原料及有关制备条件与三角瓶进行的固态发酵的条件相同。
红曲液态发酵摇瓶液态发酵，培养基(M4)小米粉10-50g/L，甘油50-100g/L，大豆水解液25g干物质/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，玉米浆10mL/L，pH4.5。121℃灭菌30min，灭菌后，接入液态种子10-50％(V/V)，摇瓶培养条件行程10cm、70次/分钟往复振荡培养。25-32℃摇瓶发酵2-3周。温度控制策略为最初30-32℃，逐步降低发酵温度，2天后28℃，第4天后稳定在25-27℃。
发酵结束后，发酵液搅碎后，用喷雾干燥或真空冷冻干燥制成红曲粉，即为无桔霉素功能性红曲粉产品。
发酵罐液态发酵初始培养基(M5)小米粉10-50g/L，甘油50-100g/L，大豆水解液干物质5g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，玉米浆10mL/L，pH4.5，总体积10L。121℃灭菌30min，灭菌后，接入液体种子10-50％(V/V)；25-32℃搅拌通风发酵2-3周，流加用大豆水解液1L，含固形物200g。大豆水解液的流加方式42h～192h期间以1.0g/h的速度流加，共加入大豆水解液干物质150g(即15g/L)，192～288h期间以0.52g/h的速度流加，加入大豆水解液干物质50g(即5g/L)。15L全自动发酵罐；搅拌转速初始150r/min，菌球形成后逐步增加转速，4天后增加到300r/min。通风量初始为1L/(L·min)，逐步提高到1.6-1.8L/(L·min)。温度控制策略为最初30-32℃，逐步降低发酵温度，2天后28℃，第4天后稳定在25-27℃。
发酵结束后，取出菌丝体及发酵液，搅碎后，用喷雾干燥制成红曲粉。即为无桔霉素功能性红曲粉产品。
发酵罐液态发酵也可用100-5000L发酵罐进行生产。
红曲霉9901菌和9906菌产不产桔霉素的证据要了解红曲霉是否产桔霉素，常用的方法是采用酵母提取物及蔗糖培养基(YES培养基)或谷氨酸葡萄糖培养基(MSG培养基)，看其培养物中是否含桔霉素。在初步确认菌种不产桔霉素的情况下，再检测各种培养基条件及培养状态下所得到的发酵产品中的桔霉素含量。只有这样，才能确保红曲产品中不含桔霉素。如果其中有一种培养基或培养条件，发现产桔霉素，则说明该菌有能力产桔霉素。
我们的实验结果表明，红曲霉9901菌和9906菌用YES培养基和MSG培养基培养(红曲霉是否产桔霉素的鉴定培养基)，用HPLC法测其培养液，均未测出桔霉素。这初步说明这两株红曲霉菌种不再具有生物合成桔霉素的能力。
对红曲霉9901和9906菌摇瓶发酵和发酵罐发酵液的红曲米(粉)进行桔霉素检测。从色谱图中可以看出，两株红曲霉在摇瓶和发酵罐的发酵液中都没有检测到桔霉素的产生，桔霉素的分析结果证明，用该菌株在我们设定的培养基及培养条件下生产得到的发酵液中没有检测到桔霉素的存在，采用三角瓶固态培养方式，发酵两周至三周。连续多批次发酵。所得的红曲米粉经萃取，用HPLC检测桔霉素含量。部分批次的结果见表1。所有的固态样品中均未测出桔霉素(连续十四个批次)。
综上所述，红曲霉9901和红曲霉9906菌株无论是在YES培养，MSG培养，还是在固态或液态(摇瓶或发酵罐)情况下，所得到的红曲产品中，用HPLC法均未测出桔霉素。因此，可以肯定，此两菌株在遗传上，已失去桔霉素的生物合成能力。因此用这两株菌所生产的红曲粉中不含桔霉素，食用是安全的。作为功能性红曲产品，这一结果是十分必要和有意义的。
红曲霉液态发酵产品中莫纳可林K的生产经过大量的培养基配方实验，得出了莫纳可林K产量最高的摇瓶发酵培养基(如上所述)，普通碳源，如葡萄糖，淀粉对产莫纳可林K不利，甘油是最好的碳源。
在摇瓶发酵过程中，莫纳可林K的合成随着发酵天数的增加而增加，在第4天到第14天之间产量迅速增加，生产能力平均为130.14mg/(L·d)；在后期产量的增长趋于平缓。第14天以后Monacolin K产量增加趋于平缓，维持在1600mg/L，第23天时的产量较第17天已略有下降。
在摇瓶发酵工艺条件研究的基础上，进行了15L发酵罐(初始装液量10L)液态深层发酵，周期为12天。大豆水解液为连续流加方式，40h～136h期间以1.56g/h的速度流加，共加入大豆水解液干物质150g(即15g/L)，136～232h期间以0.52g/h的速度流加，加入大豆水解液干物质50g(即5g/L)。在发酵过程中蒸发的水分及时补足。Monacolin K达到了535.5mg/L。
固态发酵产品中莫纳可林K及桔霉素的检测结果采用三角瓶固态培养方式，连续多批次发酵。所得的红曲米粉经萃取，用HPLC同时检测开环和闭环莫纳可林K的含量。部分批次的结果见表1。发酵两周至三周。总莫纳可林K的含量可达到5783-11183mg/kg(个别批次达到16000mg/kg，结果未显示)。
表1功能红曲粉莫纳可林K(MK)及桔霉素用HPLC的检测结果样品批次2003-1-20 2003-1-21 2003-1-21 2003-1-22 2003-1-23 2003-1-23 2003-1-24检测时间2003-2-14 2003-2-14 2003-2-27 2003-2-14 2003-2-14 2003-2-28 2003-3-1稀释倍数 26.61 28.00 54.06 27.44 25.35 54.2854.02开环MK含量(mg/kg) 4952.48 7929.52 8815.94 7710.81 6129.83 4770.61 8039.14闭环含量(mg/kg) 1066.45 2425.32 2367.095 3206.28 1017.76 1012.37 1641.07MK总含量(mg/kg) 6018.93 10354.83 11183.02 10917.10 7147.58 5782.98 9680.21开环含量所占比例(％) 82.28 76.58 78.83 70.63 85.76 82.4983.05闭环含量(％) 17.72 23.42 21.17 29.37 14.24 l7.5116.95桔霉素HPLC法 未检测出 未检测出 未检测出 未检测出 未检测出 未检测出 未检测出从表1可看出，红曲米粉中开环的莫纳可林K的比例较高，最低为70.63％，最高的为85.76％。我们对发酵液和发酵液冻干粉中两种结构的莫纳可林K的比例也进行了比较，发现，开环结构的莫纳可林K占大多数。一般在70-90％左右。
发酵液冻干粉及红曲米粉中莫纳可林K的确认对发酵液冻干粉及红曲粉中的两种与开环及闭环标准样出峰时间相同的物质用液相色谱进行紫外光谱分析，这两者和开环(酸型)及闭环(内酯型)Monacolin K的紫外光谱图特征一致，都出现3个吸收峰(231.0nm、239.0nm和248.0nm)，其中239.0nm处为最大吸收峰。同时对红曲样品的LC-ESI/MS分析结果表明，液相色谱条件下分析的物质确实为Monacolin K(图谱略)。
有益效果本发明方法利用红曲霉，谷物原料和水，采用固态发酵技术，生产绿色食品添加剂—无桔霉素高色价功能性红曲米粉。
该产品含天然的红曲色素，色价200-600U/g；同时含有具有降低高脂血症的功能性成分莫纳可林K(或称为洛伐它汀)4-12g/kg。该产品不含毒性物质桔霉素。产品中总莫纳可林K中的开环结构(也称为酸式结构，真正起生理作用的成分)比例占70-90％。产品可作为食品添加剂和健康食品配料。确保食用安全性。
该产品安全性能高于普通红曲米粉，用于各种食品的着色剂，该产品具有功能性成分莫纳可林K，含量较高，可作为保健食品的配料。
生产过程中，除了谷物原料，微生物菌种及水外，不添加任何其它化学物质。生产全过程中无污染。
本发明方法也可利用红曲霉，用一般微生物培养基的成分，采用液态发酵技术，生产无桔霉素功能性红曲粉。该产品除了色素含量较固态发酵的低外，其它性能和用途与固态发酵的红曲米粉相同。
具体实施例方式
实施例1采用红曲霉菌种9901，按照说明书上述条件经YES培养基(M1)和MSG培养基(M2)的培养，发酵液中不含桔霉素。
用种子培养基(M3)培养种子(摇瓶或种子罐)，得液态种子。
在三角瓶或塑料瓶(1000mL)中加入原料小米，100g，加等量的水，先常压蒸煮，再灭菌后，接入50mL液体种子。25-32℃培养2-3周。所得红曲米，经100℃灭菌30min，50℃烘干，磨粉，所得样品批次为2003-1-20。
实施例2采用红曲霉菌种9906，按照说明书上述条件经YES培养基(M1)和MSG培养基(M2)的培养，发酵液中不含桔霉素。
用种子培养基(M3)培养种子(摇瓶或种子罐)，得液态种子。
在三角瓶或塑料瓶(1000mL)中加入原料大米，100g，加等量的水，先常压蒸煮，再灭菌后，接入50mL液体种子。25-32℃培养2-3周。所得红曲米，经100℃灭菌30min，50℃烘干，磨粉，所得样品批次为2003-1-23。
实施例3采用红曲霉菌种9901，按照说明书上述条件经YES(M1)培养基和MSG(M2)培养基的培养，发酵液中不含桔霉素。
用种子培养基(M3)培养种子(摇瓶或种子罐)，得液态种子。在500mL三角瓶中，加入摇瓶培养基(M4)100mL，121℃灭菌30min，灭菌后，接入液态种子20mL。25-32℃摇瓶发酵2-3周。发酵液经冻干或喷雾干燥得粉状物。
实施例4采用红曲霉菌种9901，按照说明书上述条件经YES(M1)培养基和MSG(M2)培养基的培养，发酵液中不含桔霉素。
用种子培养基(M3)培养种子(摇瓶或种子罐)，得液态种子。在15L发酵罐中，加入发酵培养基(M5)10L，121℃灭菌30min，灭菌后，接入液态种子1L。25-32℃通风搅拌发酵2-3周。发酵液经冻干或喷雾干燥得粉状物。
权利要求
1.一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法，其特征是采用红曲霉菌(Monascus sp.)9901菌株或红曲霉菌(Monascus sp.)9906菌株，该两株菌株由江南大学提供，该两株菌经过YES培养基和MSG培养基培养，培养液中不含桔霉素，用这两株菌株在液态种子培养基中培养得到液态种子，液态种子培养基每1000mL中，葡萄糖60g，蛋白胨25g，NaNO32g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO41g，pH5.0，装液量100mL/500mL三角瓶，30℃培养2-3天，得一级种子培养液；将液态种子接入到用谷物原料和水，经灭菌制备的固态培养基上，固态发酵技术而制得无桔霉素高色价功能性红曲米粉；或将液态种子接入到液态发酵培养基中，液态发酵制得无桔霉素功能性红曲粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是采用固态发酵；原料为谷物原料，1000mL瓶装原料100-200g，加等量的水，先常压蒸煮，灭菌后，接入液态种子，接入量为10-50％(V/W)，25-32℃发酵2-3周，所得红曲米，经灭菌、烘干、磨粉，得到产品红曲米粉；产品中，总莫纳可林K含量达到4-12g/kg，其中开环莫纳可林K的比例达到70-90％，产品中含红曲色素，不含桔霉素。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是可用固体发酵罐生产。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是液态发酵采用摇瓶液态发酵；培养基小米粉10-50g/L，甘油50-100g/L，大豆水解液25g干物质/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，玉米浆10mL/L，pH4.5，灭菌后，接入液态种子10-50％(V/V)，25-32℃摇瓶发酵2-3周，发酵结束后，菌丝体及发酵液用喷雾干燥或真空冷冻干燥制成红曲粉，即为无桔霉素功能性红曲粉产品。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是液态发酵采用发酵罐液态发酵；初始培养基小米粉10-50g/L，甘油50-100g/L，大豆水解液干物质5g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O2g/L，玉米浆10mL/L，pH4.5，在15L全自动发酵罐中装10L培养基，灭菌后，接入液态种子10-50％(V/V)，25-32℃搅拌通风发酵2-3周，发酵结束后，菌丝体及发酵液用喷雾干燥制成红曲粉，即为无桔霉素功能性红曲粉产品。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是发酵罐液态发酵时，大豆水解液的流加方式流加用大豆水解液1L，含固形物200g，42h～192h期间以1.0g/h的速度流加，共加入大豆水解液干物质150g，即150g/10L，192～288h期间以0.52g/h的速度流加，加入大豆水解液干物质50g，即50g/10L；搅拌转速初始150r/min，菌球形成后逐步增加转速，4天后增加到300r/min；通风量初始为1L/(L·min)，逐步提高到1.6-1.8L/(L·min)；温度控制策略为最初30-32℃，逐步降低发酵温度，2天后28℃，第4天后稳定在25-27℃。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是发酵罐液态发酵时，可用100-5000L发酵罐进行生产。
全文摘要
一种无桔霉素高色价功能性红曲粉的制备方法，属于红曲产品制备技术领域。本发明采用红曲霉9901菌或9906菌株液态培养种子，用谷物原料加等量水制成固态培养基，接入10－50％液态种子后，在25－32℃温度，60－90％的湿度的条件下，经过2－3周时间固态发酵，再经过灭菌，烘干和磨粉，制得无桔霉素高色价功能性红曲米粉，也可采用液态发酵技术生产无桔霉素高色价功能性红曲粉，所得产品中色价200－600U/g，含功能性成分莫纳可林K4－12g/kg，其中开环结构的莫纳可林K的比例70－90％，产品不含毒性物质桔霉素。生产过程中不添加其它化学物质，无污染。产品可用作食品添加剂和食品配料，确保食用安全。
文档编号C12N1/14GK1448503SQ0311335
公开日2003年10月15日 申请日期2003年4月30日 优先权日2003年4月30日
发明者许赣荣 申请人:江南大学