专利名称：高效耐酸性液化糖化酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效耐酸性液化糖化酶及其制备方法，属于淀粉原料的酶水解利用领域。
背景技术：
淀粉质原料的酶分解，一般由α-淀粉酶和糖化酶两种酶协同作用，完成淀粉的液化和糖化过程。α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1.)是一种有内切活性的淀粉酶，在中性pH条件下可从内部切开α-1，4糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖，麦芽寡糖及少量葡萄糖；糖化酶全称葡萄糖淀粉酶(glucoamylase，EC3.2.1.3.)是一种外切酶，在酸性pH条件下可从淀粉的非还原性末端逐个切开α-1，4和α-1，6糖苷键，反应最终产物为葡萄糖分子。
由于α-淀粉酶和糖化酶的最适反应pH不同，中性淀粉酶与酸性糖化酶不能同时使用，淀粉质原料的液化、糖化需由两个工序完成；现市面上虽已有α-淀粉酶和糖化酶的复合酶出现，基于以上原因，在酿酒等发酵过程的酸性环境下，α-淀粉酶的活性变得极低甚至失去活性；现在虽也有细菌产生的耐酸性α-淀粉酶面世，但只有国外有极少公司生产，且价格高，远远不能满足市场的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种高效耐酸性液化糖化酶及其制备方法，其特点是借助基因工程技术进行遗传育种，获得含有多拷贝耐酸性α-淀粉酶和糖化酶融合基因的特种霉菌TR12菌株(Journal of The Institute of Brewing，Vol.105，No.9，1999)，本发明者旨在以该基因工程菌株作为实用菌株，通过发酵工程技术生产酶制剂以及淀粉液化糖化过程的一体化工艺实现。
本发明的目的由以下技术措施实现。其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
高效耐酸性液化糖化酶及其制备方法
淀粉及多种原材料经配料制成种子培养基，接种由基因工程育种所得的特种霉菌TR12菌株，经培养制得种子，该种子接入淀粉及各种原材料经配料制成的发酵培养基中，在通气及一定温度下，获得发酵产物-耐酸性液化糖化酶，再经提取制得酶制剂产品。
(1)斜面菌种培养取工程菌TR12保存菌种(或冻干管、或砂土管、或保藏斜面)，接种选择斜面培养基，于温度30-35℃培养7-10日，选取表面生长均匀，孢子层厚实的斜面菌落，再次移种淀粉培养基，于温度30-35℃培养5-7日，获得斜面菌种，可在温度4℃，保存15-30日。
(2)种子培养将种子培养基的淀粉质原料加水混合均匀，加热搅拌直至淀粉糊化，冷却后，加α-淀粉酶液化，用双层纱布过滤，加入玉米浆，定容。分装于锥形瓶中。在温度118-122℃灭菌20-25分钟，冷却后接种，在120-220r/min的回旋摇床上于温度32-35℃培养20-30小时，获得种子。
(3)摇瓶发酵(不补料发酵工艺)将发酵培养基的淀粉质原料加水糊化，液化，过滤，加玉米浆，调pH，定容，分装于锥形瓶中，在温度118-122℃灭菌20-30分钟后，冷却，按10～20％的接种量加入已培养好的种子培养物，然后在120-220r/min的回旋摇床上于温度30-32℃培养3-4日，获得发酵液产物。
(4)摇瓶发酵(补料发酵工艺)发酵的基础料培养基的配制同上不补料发酵工艺所述的发酵培养基，基础培养基分装于锥形瓶中。在温度118-122℃灭菌20-30min。冷却后，按10～20％的接种量加入已培养好的种子物。在120-220r/mm的回旋摇床上，每次10～20％补料量、1-3次补料条件下(补料培养基，仅碳源浓度为基础料的3-5倍，其它成分同)，在30-32℃培养4-6日，获得发酵液产物。
(5)酶制剂提取将上述发酵液产物放入离心机内，以3000～3500rpm、离心10～20分钟、洗涤，上层清液经过滤、合并后得粗酶液。粗酶液在真空度0.07-0.09Mpa、温度40-45℃条件下获得浓缩酶液。浓缩酶液调pH＝3.5-4.5，按每升酶液中加入10-20g玉米淀粉，搅拌均匀，使酶和淀粉充分吸附，在温度10～20℃缓慢加入2-2.5倍的冷藏乙醇，边加边搅拌，即可看到酶的沉淀。沉淀物离心分离后，所得酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.07-0.09Mpa、于温度40-45℃干燥3-4小时，获得粗酶制剂成品。
酶制剂中的耐酸性α-淀粉酶活性参照行业标准QB1805.1-93测定，耐酸性α-淀粉酶活性为500～1000U/g，糖化酶活性参照QB1805.2-93测定，糖化酶活性为20000～50000U/g，最适宜温度50-60℃，pH＝4.0-5.0，在50℃热稳定性最好，K+、Na+、Ca2+、Mg2+等金属化合物可以作为酶制剂活性的保护剂或促进剂。液化糖化酶主要用于淀粉糖制品中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有机酸、抗生素及其它发酵工业中的淀粉水解，本发明的耐酸性液化糖化酶制剂与现有酶制剂指标的比较，详见表1所示。
本发明具有如下优点1、填补了我国在耐酸性α-淀粉酶品种上的空白，实现了酸性环境下液化糖化工序一体化，不仅可以替代进口，而且可以出口创汇，为我国国民经济发展做出贡献。
2、本产品应用范围广泛，市场前景广阔，而且对环境和生态的保护具有重要意义。
3、使用耐酸性液化糖化酶，pH＝4.0-5.0，液化酸度低，液化糖化工序同时进行，粘度低、能耗低、过滤性好、收率高。例如，每吨酒渣加酶再发酵，可望多产50°酒20公斤，经济效益显著。
4、可使应用本产品的企业降低生产成本和劳动强度，提高生产力，促进传统产业跃上新台阶。
四
图1为高效耐酸性液化糖化酶制备的流程图。
五具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1(酶制剂的制备)1)斜面菌种培养取工程菌TR12保藏菌种，接种选择斜面培养基(KCl 2g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，Sugar 1mol/L，乙酰胺10mM，CsCl 15mM，琼脂15g/L)，于温度32℃，培养7日，移种淀粉斜面培养基(玉米淀粉20g/L，KNO32g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO42.7g/L，琼脂粉20g/L，pH5.0)，于温度32℃培养7日，获得斜面菌种。
2)种子培养将种子培养基(玉米粉60g/L，玉米浆20g/L，黄豆粉20g/L)淀粉质原料加水混合均匀，加热搅拌直至淀粉糊化。冷却后加入α-淀粉酶液化，双层纱布过滤后，加入玉米浆成分，定容。按每瓶50ml分装250-ml锥形瓶，8层纱布塞住瓶口，牛皮纸包扎。在121℃灭菌20分钟，冷却后接种，然后在210r/min的回旋摇床上32℃培养25小时。
3)摇瓶发酵将发酵培养基(玉米粉50g/L，玉米浆20g/L，黄豆粉20g/L，麸皮30g/L，柠檬酸调pH值3.5-4.0)的淀粉质原料加水糊化、液化，过滤，最后加玉米浆，调pH，定容，按50ml分装250-ml锥形瓶中。于温度121℃灭菌20分钟，冷却，按10％的接种量加入已培养好的种子培养物，然后在210r/mm的回旋摇床上于温度32℃培养4天，获得发酵液产物。
4)酶制剂提取将上述发酵液产物加入离心机内，以3500rpm离心15分钟、洗涤，上面清液经纱布过滤，合并后得到的含耐酸性α-淀粉酶活性20.9U/ml、糖化酶活性786U/ml的粗酶液，在真空度0.09Mpa、45℃水浴中浓缩，获得含耐酸性α-淀粉酶活性202.9U/ml、糖化酶活性7540U/ml的浓缩酶液。浓缩酶液调pH＝3.5，加入1％玉米粉，搅拌均匀，在10～20℃缓慢加入2.2倍的冷藏乙醇，边加边搅拌，析出酶的沉淀，离心后酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.09Mpa、温度45℃下干燥3小时，干燥物为含耐酸性α-淀粉酶活性863U/g、糖化酶活性30736U/g的粗酶制剂成品。
实施例2(酶制剂的制备)
1)斜面菌种培养同实施例1。
2)种子培养同实施例1。
3)摇瓶发酵将发酵培养基(玉米粉50g/L，玉米浆20g/L，黄豆粉20g/L，麸麦30g/L，柠檬酸调pH值3.5)的淀粉质原料加水糊化、液化，过滤。按800mL分装于3000ml锥形瓶中。于温度122℃灭菌25min。冷却后，按15％的接种量加入已培养好的锥形瓶种子物。在160r/min的回旋摇床上32℃培养，并分别在32小时、80小时按20％量各补料1次(补料培养基，仅碳源浓度为基础料的3倍，其它成分同)，培养5日后，获得发酵液产物。
4)酶制剂提取提取方法与实施例1同，上述发酵液产物经离心、洗涤、过滤、浓缩、干燥后，获得含耐酸性α-淀粉酶活性925U/g、糖化酶活性35142U/g的粗酶制剂成品。
实施例3(酶制剂的制备)1)斜面菌种培养同实施例1。
2)种子培养同实施例1。
3)摇瓶发酵将发酵培养基(玉米粉50g/L，玉米浆20g/L，黄豆粉20g/L，麸麦30g/L，柠檬酸调pH值3.5)的淀粉质原料加水糊化、液化，过滤。按500ml分装于3000-ml锥形瓶中。于温度118℃灭菌30min。冷却后，按20％的接种量加入已培养好的锥形瓶种子物。在160r/min的回旋摇床上32℃培养，并分别在32小时、64小时、96小时按15％量各补料1次(补料培养基，仅碳源浓度为基础料的5倍，其它成分同)，培养6日后，获得发酵液产物。
4)酶制剂提取提取方法与实施例1同，上述发酵液产物经离心、洗涤、过滤、浓缩、干燥后，获得含耐酸性α-淀粉酶活性711U/g、糖化酶活性21754U/g的粗酶制剂成品。
应用实例1(葡萄糖浆制备)玉米淀粉加水调成浓度300～320g/L的淀粉乳，用HCl水溶液将淀粉乳调至pH4.5-4.6，按每千克干淀粉添加氯化钙500mg和氯化钠10mg。加入本实验室自制酶8U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性计)，在60-65℃保温60min左右，至用碘液测试呈棕橙色，液化纯度20-22％为止。再降温到55℃，再补充加入自制的酶制剂100U/g淀粉(以糖化酶活性计)继续糖化30小时左右，保温测定糖化度至96％～98％。加活性碳1％-1.5％，加热至80℃-90℃保温脱色30min，调pH4.0-4.2。经过滤、离子交换树脂处理，可得到纯净的葡萄糖浆。
应用实例2(酒精发酵)称取玉米粉50g，加2.5倍量的水调浆，调pH值为4.6，煮沸糊化2min，冷却至60℃，加入10U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性计)的自制酶液，于60℃液化糖化15min，再降温到50℃，补加150U/g淀粉(以糖化酶活性计)的自制酶液继续糖化30min，至稀碘液显棕色。把糖化液装入500-ml三角瓶中，糖化液补水至225g，加入1g干酵母，常温25℃发酵3日。蒸馏，获浓度28.3％v/v的酒精80ml，乙醇收率为45.28ml/100g淀粉。
应用实例3(酒精发酵)称取玉米粉50g，加2.5倍量的水调浆，调pH值为4.6后，直接加入10U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性计)的自制酶液，于60℃液化糖化1h，再降温到50℃，补加80U/g淀粉(以糖化酶活性计)的自制酶液继续糖化30min，至稀碘液显棕色。把糖化液装入500-ml三角瓶中，糖化液补水至225g，加入1g干酵母，常温25℃发酵4日。蒸馏，获浓度30.9％v/v的酒精80ml，乙醇收率为49.44ml/100g淀粉。
表1本发明的耐酸性液化糖化酶制剂与现有酶制剂指标的比较
权利要求
1.一种由下述方法制得的高效耐酸性液化糖化酶，其特征在于淀粉及多种原材料经配料制成种子培养基，接种由基因工程育种所得的特种霉菌TR12菌株，经培养制得种子，该种子接入淀粉及各种原材料经配料制成的发酵培养基中，在通气及一定温度下，获得发酵产物-耐酸性液化糖化酶，再经提取制得酶制剂产品，其中耐酸性α-淀粉酶活性参照行业标准QB1805.1-93测定，耐酸性α-淀粉酶活性为500～1000U/g，糖化酶活性参照QB1805.2-93测定，糖化酶活性为20000～50000U/g。
2.按照权利要求1所述方法制得的高效耐酸性液化糖化酶，其特征在于(1)斜面菌种培养取工程菌TR12保存菌种，接种选择斜面培养基，于温度30-35℃培养7-10日，选取表面生长均匀，孢子层厚实的斜面菌落，再次移种淀粉培养基，于温度30-35℃培养5-7日，获得斜面菌种，(2)种子培养将种子培养基的淀粉质原料加水混合均匀，加热搅拌直至淀粉糊化，冷却后，加α-淀粉酶液化，用双层纱布过滤，加入玉米浆，定容，分装于锥形瓶中，在温度118-122℃灭菌20-25分钟，冷却后接种，在120-220r/min的回旋摇床上于温度32-35℃培养20-30小时，获得种子，(3)摇瓶发酵(不补料发酵工艺)将发酵培养基的淀粉质原料加水糊化，液化，过滤，最后加玉米浆，调pH，定容，分装于锥形瓶中，在温度118-122℃灭菌20-30分钟后，冷却，按10～20％的接种量加入已培养好的种子培养物，然后在120-220r/min的回旋摇床上于温度30-32℃培养3-4日，获得发酵液产物，(4)摇瓶发酵(补料发酵工艺)发酵的基础料培养基的配制同上不补料发酵工艺所述的发酵培养基，基础培养基分装于锥形瓶中，在温度118-122℃灭菌20-30min，冷却后，按10～20％的接种量加入已培养好的种子物，在120-220r/min的回旋摇床上，每次10～20％补料量1-3次补料条件下(补料培养基，仅碳源浓度为基础料的3-5倍，其它成分同)，在30-32℃培养4-6日，获得发酵液产物，(5)酶制剂提取将上述发酵液产物放入离心机内，以3000～3500rpm、离心10～20分钟、洗涤，上层清液经过滤、合并后得粗酶液，粗酶液在真空度0.07-0.09Mpa、温度40-45℃条件下获得浓缩酶液，浓缩酶液调pH＝3.5-4.5，按每升酶液中加入10-20g玉米淀粉，搅拌均匀，使酶和淀粉充分吸附，在温度10～20℃缓慢加入2-2.5倍的冷藏乙醇，边加边搅拌，即可看到酶的沉淀，沉淀物离心分离后，所得酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.07-0.09Mpa、温度40-45℃干燥3-4小时，获得粗酶制剂成品，其中耐酸性α-淀粉酶活性参照行业标准QB1805.1-93测定，耐酸性α-淀粉酶活性为500～1000U/g，糖化酶活性参照QB1805.2-93测定，糖化酶活性为20000～50000U/g。
3.按照权利要求1或2所述高效耐酸性液化糖化酶的用途，其特征在于液化糖化酶主要用于淀粉糖制备中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有机酸、抗生素及其它发酵工业中的淀粉水解。
全文摘要
一种高效耐酸性液化糖化酶及其制备方法和用途，其特点是借助基因工程技术进行遗传育种，获得含有多拷贝耐酸性α－淀粉酶和糖化酶融合基因的特种霉菌TR12作为实用菌株，通过发酵工程技术生产酶制剂以及液化糖化过程一体化工艺实现，该酶制剂中耐酸性α－淀粉酶活性参照行业标准QB1805.1－93测定，耐酸性α－淀粉酶活性为500～1000U/g，糖化酶活性参照QB1805.2－93测定，糖化酶活性为20000～50000U/g，液化糖化酶主要用于淀粉糖制品中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有机酸、抗生素及其它发酵工业中的淀粉水解，它具有液化糖化工序同时进行，能耗低、产品粘度低、过滤性好、收率高、质量稳定、无三废污染、大幅度降低生产成本和劳动强度，有显著的经济效益和社会效益。
文档编号C12N1/14GK1477200SQ0311747
公开日2004年2月25日 申请日期2003年3月17日 优先权日2003年3月17日
发明者张文学, 何殿松, 杨瑞, 胡承 申请人:四川大学