专利名称：一种黑色培养基及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黑色培养基及其制作方法。
背景技术：
植物细胞、组织、器官离体培养技术已广泛应用于植物细胞和遗传学研究领域，植物细胞工程、基因工程领域，各种作物、苗木脱毒和各种快繁、微繁殖等工厂化生产。
离体培养所用的培养基，是离体培养的基础，离体培养的成功与否关键在于含适当成分的培养基的制作和培养基成分的及时调整。培养基的成分，主要包括1)无机盐，2)氨基酸和维生素等有机成分，3)植物激素，4)糖，5)其他添加成分。
根据离体培养的需要，常常需要添加一些成分来调整培养基的功能。最常用的是，在生根培养时需要黑暗条件，一般采用加一定量的活性炭来制作黑色的培养基，活性炭的添加量一般为1～5g/L。然而，活性炭具有吸附作用，在培养基中添加活性炭会吸附培养基中的一些成分，结果这些成分作用就受到影响，尤其是对培养基中的微量成分影响更大。已有研究表明，活性炭会吸附培养基中的植物激素，使得植物激素的作用不能发挥。植物激素在培养基中含量很低，一般在mg/L级，是调节植物生长必不可少的重要成分，离体培养的植物细胞、组织是愈伤组织生长还是分化再生、是芽再生还是生根、是器官途径再生还是胚状体途径再生等，均依赖于微量的植物激素的生长调节作用，植物激素是通过对有关基因的表达调控而达到这些生长调节的。
生根培养中，添加的活性炭会吸附植物激素，开始时植物激素的作用几乎为零，然后随着植物细胞的分化再生、植物组织分泌一些物质，会使得活性炭中吸附的植物激素成分逐渐释放，因此不仅导致培养物分化和再生滞后，而且由于后期培养基中活性炭所吸附的植物激素的释放而发生的植物激素浓度增加，常常导致再生植株异常。
三、技术方案针对用活性炭制作黑色培养基的问题，本发明的目的是公开一种采用墨汁或水溶性黑色墨水取代普通黑色培养基中采用的活性炭制作而成的黑色培养基。
采用墨汁或水溶性黑色墨水替代植物离体培养培养基中的活性炭，即在按常规方法制作黑色培养基过程中，其他成份不变，但不添加活性炭，加入墨汁或水溶性黑色墨水，墨汁或水溶性黑色墨水的添加量一般在0.5～3ml/L范围内，根据培养基黑色的深浅需要，可以加更少或更多的墨汁或水溶性黑色墨水。本发明对培养基中所加墨汁无特殊要求，但最好使用松烟墨汁。
水溶性黑色墨水主要包括碳素墨水、黑色水彩墨水和宝珠笔墨水。
本发明还公开了黑色培养基的制作方法按常规方法制作培养基、调pH值，然后添加墨汁或水溶性黑色墨水，装瓶，常规高压灭菌。
采用墨汁或水溶性黑色墨水来制作黑色的培养基，不仅满足了植物细胞生根培养时对黑暗环境的要求，而且不影响培养基中植物激素的作用，培养物分化再生无滞后现象；并且，由于后期的培养基中植物激素成分不会增加，再生植株异常也减少。
本发明所公开的黑色培养基主要应用在植物细胞、组织、器官的离体培养研究和大规模工厂化培养方面。
本发明所制作的培养基不含活性炭，在培养后期培养基中植物激素的量不会像添加活性炭那样增加，因此再生植株异常会减少，而且墨汁价格低于活性炭，可降低培养基成本。
具体实施例方式
实施例1 胡萝卜悬浮细胞系的再生材料为已经建立10年以上的长期继代的胡萝卜愈伤组织系。选转继代培养10～14天的胡萝卜愈伤组织2～3g，悬浮培养于30ml液体培养基中，150～160转/分振荡培养。5天后除大块愈伤组织，悬浮细胞静止10分钟沉降，倾去上清液留沉降的细胞，加20ml新鲜液体培养基，100～130转/分振荡培养基。3～4天后，过50目筛子除去大块愈伤组织，过滤液中的细胞约300转/分手摇离心沉降。取沉降的细胞1ml，加10ml新鲜液体培养基重悬，取1ml细胞悬液培养在固体再生培养基E(MS无机盐，0.5mg/L VB1，200mg/L Asn，蔗糖20g/L，琼脂粉5g/L，pH5.2～5.4，加墨汁1ml/L)上，固体培养基的表面直径约7cm。在37.9μmol·m-2·s-1，14h光/10h暗，26±1℃条件下培养。对照为添加1g/L活性炭代替墨汁的同样固体培养基，在同样的条件下培养。
培养5～6周后，在添加墨汁的培养基上每平方厘米培养基表面再生胡萝卜小苗的数量平均在10株以上，对照略稀、平均约8～9株。
实施例2 离体培养烟草细胞的再生培养烟草材料为已经建立10年以上的愈伤组织系。转继代培养7～10天的烟草愈伤组织系，选合适的组织块，培养在烟草再生固体培养基NB(MS基本培养基，200mg/L Asn，1.8mg/L VB1，1.8mg/L6-BA，0.4mg/L IAA，蔗糖20g/L，琼脂粉5g/L，pH5.4～5.6，加墨汁2ml/L)上，37.9μmol·m-2·s-1，14h光/10h暗，26±1℃，直接进行苗再生。对照为同样培养基但添加2g/L活性炭来替换墨汁，培养在同样的条件下。
在含墨汁的培养基上培养3～4周，即有小苗再生。对照一般需7～8周才有小苗再生。小苗再生后，继续培养3～4周，让小苗长大。在添加墨汁的培养基上，小苗形态基本正常，畸形苗低于20％。而对照培养在添加活性炭的培养基上的小苗，畸形苗高于50％，但这些畸形苗移栽后会逐渐正常，畸形苗的95％以上属于生理性的形态异常。
实施例3 国兰的离体培养圆球茎转接到固体培养基OR202(MS基本培养基，2.0mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，香蕉100g/L，蔗糖20g/L，琼脂粉5g/L，pH5.8，加墨汁3ml/L)上，16h光/8h暗，37.9μmol·m-2·s-1，26±1℃。对照为同样培养基但添加活性炭3g/L来替换墨汁，在同样的条件下培养。
在添加墨汁的培养基上，接种时0.5cm的小苗，经2个月的培养后小苗平均高5cm左右。而对照培养在含活性炭的培养基上的小苗，平均高为3cm左右。
实施例4 葡萄的生根培养葡萄无菌苗茎段(每茎段有1个芽，长度为1cm)转接到葡萄固体生根培养基GR05(1/2MS基本培养基，琼脂粉5g/L，pH5.4，加墨汁1.5ml/L)上，26±1℃，16h光/8h暗，37.9μmol·m-2·s-1。对照为同样培养基但用2g/L活性炭代替墨汁，培养在同样条件下。
在添加墨汁的培养基上培养10天后，根再生；4周后，苗平均高7～8cm，侧芽约为4～6个，每株5～10条根。在添加活性炭的对照培养基上培养约2周后根再生，4周后苗平均高5～6cm，侧芽约3～5个，每株3～8条根。
权利要求
1.一种黑色培养基，包括普通培养基和黑色添加成分，其特征是用墨汁或水溶性黑色墨水取代普通黑色培养基中采用的活性炭制作的黑色培养基。
2.根据权利要求1所述的黑色培养基，其特征是墨汁或水溶性黑色墨水的添加量在0.5～3ml/L。
3.根据权利要求2所述的黑色培养基，其特征是水溶性黑色墨水主要包括碳素墨水、黑色水彩墨水和宝珠笔墨水。
4.根据权利要求1或2所述的黑色培养基，其特征是所加墨汁无特殊要求，最好使用松烟墨汁。
5.权利要求1所述的黑色培养基的制作方法，按常规方法制作培养基、调pH值，然后添加墨汁或水溶性黑色墨水，装瓶，常规高压灭菌。
6.根据权利要求1所述的黑色培养基主要应用在植物细胞、组织、器官的离体培养研究和大规模工厂化培养方面。
全文摘要
本发明涉及一种本发明涉及一种培养基及其制作方法，针对目前使用的黑色培养基中活性炭吸附培养基中的植物激素，使得植物激素的作用减弱，并在培养后期释放产生异常植株的问题，公开了一种黑色培养基及其制作方法，采用墨汁或水溶性黑色墨水取代普通黑色培养基中采用的活性炭制作而成的黑色培养基，即在按常规方法制作黑色培养基过程中，其他成分不变，但不添加活性炭，加入墨汁或水溶性黑色墨水，墨汁或水溶性黑色墨水的添加量一般在0.5～3ml/L范围内。黑色培养基的制作方法按常规方法制作培养基、调pH值，然后添加墨汁或水溶性黑色墨水，装瓶，常规高压灭菌。本发明主要应用在植物细胞、组织、器官的离体培养研究和大规模工厂化培养方面。本发明中在培养后期培养基中植物激素的量不会增加，再生植株异常会减少，而且可降低培养基成本。
文档编号C12N5/04GK1539960SQ0311775
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月25日 优先权日2003年4月25日
发明者郭骁才, 畅志坚 申请人:中国科学院成都生物研究所