专利名称：一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及植物组织培养技术，具体涉及一种高灌蓝莓 工厂化组培快繁复壮培养基的制备与应用。
背景技术：
高灌蓝莓(Blueberry)，学名越橘，系多年生灌木，原产北美。一般无法形成种子，大多采用扦插、压条等繁殖方法，但高灌蓝莓对温度、土壤、气候等要求比较严格，多数品种 不易繁殖，扦插养护更不容易，而且高灌蓝莓种质资源退化较为严重，扦插繁殖的质量很不 理想。组织培养繁殖植物的技术是一种特殊的营养繁殖方式，现在一般称为快速繁殖技术 或微繁殖技术。它是在无菌条件下，利用植物体的一部分，包括细菌、组织和器官，在人工控 制的营养和环境条件下繁殖植物的方法。该技术面临的一个难题是继代培养容易出现苗弱 现象。因此，采用复壮培养基替代继代培养基既能防止品种退化，保证种苗质量，又能提供 大量优质壮苗，提高快繁质量。现有技术一般用传统继代培养基，导致继代丛生芽弱；而且 诱导时间较长，生根难度大，成活率低，不能适应更加快速的市场需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能降低污染率，提高生根成活率且快繁苗 木更壮的高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备和应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。高灌蓝莓组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤(1)、外植体材料处理即选用外植体材料进行处理，在杀死率和污染率最低的平 衡点制备出符合要求的外植体；(2)、诱导即将步骤(1)中所述的外植体接种到培养基上，在诱导条件下诱导出 芽；所述培养基为琼脂综合培养基的改良；(3)复壮培养即将步骤(2)中所得丛生芽新梢在复壮培养基中增殖培养；进一步的，步骤(1)采用当年生剪去叶片的嫩茎，自来水冲洗干净，放入加入活性 炭的0. 氯化汞消毒液中8-30分钟，在无菌工作台上用无菌水冲洗3-5遍，切下解刨芽接 种。优选的技术方案中，所述步骤(1)外植体材料处理包括清洗、消毒、和裁剪；所述 清洗将用于制作外植体的外植体材料洗净；所述消毒对洗净的外植体材料作消毒处理；所 述剪裁将消毒后的外植体材料裁成合适大小的外植体。步骤(2)中所述培养基的配方为琼脂综合培养基+玉米素0. 8-1. 3mg/L+萘乙酸 0. 2-1. 6mg/L，将外植体接种在诱导培养基上，1周后开始萌发，40-52天后芽长成4-5cm左 右的新梢，侧芽同时也萌发出5-10个丛生芽。步骤(3)中所述培养基配方为琼脂综合培养基+玉米素1.0mg/L+吲哚丁酸 0. 2-0. 6mg/L将丛生芽切割2cm左右茎段新梢，转入继代培养基上增值培养，后可分化出30-50个丛生芽，一般54-62天继代培养一次，增值率在30-50倍，壮苗率达到90%。所述外植体材料为高灌蓝莓当年生去叶嫩茎。所述清洗包括无菌水清洗和含洗洁精的水浸洗。 所述消毒包括酒精消毒和加入活性炭的氯化汞消毒液消毒。采用本发明技术方案的高灌蓝莓组织培养快速繁殖方法，与现有技术对比的有益 效果在于使用的消毒液对越桔茎段灭菌时，以25min为宜，污染率与杀死率降到最低，成活 率最高可达75%。初代培养50d左右，部分茎段可直接诱导产生萌生芽，在附加玉米素1. Omg/L 和萘乙酸1.0mg/L的改良琼脂综合培养基中，诱导时间更短，不定芽的萌芽率最高，达到 86. 67% ；越桔在改良生根培养基中，生根率达80%以上，其成活率可达95%，壮苗率达 90%。由于外植体材料处理包括清洗、消毒和裁剪，能够获得更加优质的外植体，为组织 培养快速繁殖方法鉴定良好的基础。由于优选蓝莓去叶嫩茎作为外植体材料，为组织培养快速繁殖提供良好的的材料 保证。由于清洗包括自来水冲洗和含洗洁精的水浸洗，可以使得清洗更加彻底。由于消毒包括酒精消毒和加入活性炭的消毒液消毒，消毒更加彻底。由于将外植体材料去掉叶之后切成0. 5 lcmXO. 85-lcm大小的嫩茎作为外植 体，诱导培养更加方便，且效果更好。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的实施做进一步的说明实施例1 1、外植体材料处理包括对外植体材料进行清洗、消毒和裁剪等处理，以制备出合 乎要求的外植体。具体为采用当年生剪去叶片的嫩茎，自来水冲洗干净，在无菌工作台上用无菌水 冲洗3-5遍，用自来水中冲洗20 30min，再用加洗洁精的水浸洗20 30min。清洗干净 之后在超净工作台上进行消毒处理，放入加入活性炭的0. 氯化汞消毒液中10分钟，消 毒完成之后放入无菌瓶中备用。2、诱导出芽将外植体接种在配方为琼脂综合培养基+玉米素0. 8mg/L+萘乙酸 0. 2mg/L的培养基中，将外植体接种在诱导培养基上，1周后开始萌发，40天后芽长成4-5cm 左右的新梢，侧芽同时也萌发出5-10个丛生芽3、生根培养将丛生芽切割2cm左右茎段新梢，转入继代培养基上增值培养，所述 培养基配方为琼脂综合培养基+玉米素1. Omg/L+吲哚丁酸0. 2mg/L后可分化出30-50个 丛生芽，54天左右继代培养一次，增值率在30-50倍。实施例2:1、外植体材料处理包括对外植体材料进行清洗、消毒和裁剪等处理，以制备出合乎要求的外植体。具体为采用当年生剪去叶片的嫩茎，自来水冲洗干净，在无菌工作台上用无菌水 冲洗3-5遍，用自来水中冲洗20 30min，再用加洗洁精的水浸洗20 30min。清洗干净 之后在超净工作台上进行消毒处理，放入加入活性炭的0. 氯化汞消毒液中20分钟，消 毒完成之后放入无菌瓶中备用。
2、诱导出芽将外植体接种在配方为琼脂综合培养基+玉米素1.0mg/L+萘乙酸 1. Omg/L的培养基中，将外植体接种在诱导培养基上，1周后开始萌发，45天后芽长成4-5cm 左右的新梢，侧芽同时也萌发出5-10个丛生芽3、生根培养将丛生芽切割2cm左右茎段新梢，转入继代培养基上增值培养，所述 培养基配方为琼脂综合培养基+玉米素1. Omg/L+吲哚丁酸0. 4mg/L后可分化出30-50个 丛生芽，58天继代培养一次，增值率在30-50倍。实施例3 1、外植体材料处理包括对外植体材料进行清洗、消毒和裁剪等处理，以制备出合 乎要求的外植体。具体为采用当年生剪去叶片的嫩茎，自来水冲洗干净，在无菌工作台上用无菌水 冲洗3-5遍，用自来水中冲洗20 30min，再用加洗洁精的水浸洗20 30min。清洗干净 之后在超净工作台上进行消毒处理，放入加入活性炭的0. 氯化汞消毒液中30分钟，消 毒完成之后放入无菌瓶中备用。2、诱导出芽将外植体接种在配方为琼脂综合培养基+玉米素1. 3mg/L+萘乙酸 1. 6mg/L的培养基中，将外植体接种在诱导培养基上，1周后开始萌发，52天后芽长成4-5cm 左右的新梢，侧芽同时也萌发出5-10个丛生芽3、生根培养将丛生芽切割2cm左右茎段新梢，转入继代培养基上增值培养，所述 培养基配方为琼脂综合培养基+玉米素1. Omg/L+吲哚丁酸0. 6mg/L后可分化出30-50个 丛生芽，62天继代培养一次，增值率在30-50倍。
权利要求
一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，包括如下步骤(1)、外植体材料处理即选用外植体材料进行处理，在杀死率和污染率最低的平衡点制备出符合要求的外植体；(2)、诱导即将步骤(1)中所述的外植体接种到培养基上，在诱导条件下诱导出芽；所述培养基为琼脂综合培养基的改良；(3)复壮培养即将步骤(2)中所得丛生芽新梢在复壮培养基中增殖培养。
2.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤 (1)所述材料用0. 氯化汞和含活性炭消毒液处理。
3.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤(1)所述材料处理时间为8—30分钟。
4.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤(2)所用培养基为琼脂综合培养基+玉米素0.8-1. 3mg/L+萘乙酸0. 2-1. 6mg/L。
5.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤(2)培养40-52天再切割新梢。
6.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤(3)所用培养基为琼脂综合培养基+玉米素1.Omg/L+吲哚丁酸0. 2-0. 6mg/L。
7.如权利要求1所述的一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，其特征在于步骤 (3)培养54-62天后生根培养。
全文摘要
本发明提供一种高灌蓝莓组织培养复壮培养基制备方法，包括如下步骤(1)外植体材料处理即选用外植体材料进行处理，在杀死率和污染率最低的平衡点制备出符合要求的外植体；(2)诱导即将步骤(1)中所述的外植体接种到培养基上，在诱导条件下诱导出芽；所述培养基为琼脂综合培养基的改良；(3)复壮培养即将步骤(2)中所得丛生芽新梢在复壮培养基中增殖培养。
文档编号C12N5/04GK101838630SQ20091002073
公开日2010年9月22日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者不公告发明人 申请人:山东高端蓝莓生物技术股份有限公司;山东高端投资有限公司