一种用于蓝莓组织培养的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于蓝莓组织培养的培养基，其组分及含量为NH4NO3400mg/L，MgSO4.7H2O370mg/L，CaCl2.2H2O95mg/L，Ca(NO3)2.4H2O695mg/L，KH2PO4340mg/L，K2SO4745mg/L，KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，ZnSO4.7H2O8.6mg/L，Na2Mo04.2H200.25mg/L，CuSO4.5H2O0.025mg/L，CoCl2.6H2O0.025mg/L，MnSO4.4H2O22.3mg/L，FeS04.7H2055.6mg/L，Na2-EDTA74.6mg/L。以本发明的配方为基本培养基，在初代培养基上茎段诱导率为82.5～90.5%，平均初代诱导率较在WPM培养基上提高3.7%；在继代培养基上的增殖率平均为7.8，较在WPM培养基上的增殖率高9.0%。
【专利说明】一种用于蓝莓组织培养的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及到植物的组织培养，特别是涉及到蓝莓的组织培养。
【背景技术】
[0002]蓝莓(Blueberry)学名越桔，属杜胃$花科(Ericaceae)越桔亚科(Vaccinioideae)越桔属(Vacciniodeae)植物，多年生落叶或常绿灌木或小灌木。蓝莓果实含有丰富的Vc、糖、酸及矿物质，尤其富含花色素、S0D、果胶等营养保健成分，对改善人体大脑记忆和智力，增强心脑血管功能，改善视力，增强人体免疫力和组织抗氧化等有特效，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。欧美的很多国家都把蓝莓作为保健与功能食品。国际市场需求量大，供不应求，市场售价昂贵。而且随着人们生活水平和消费能力提高，营养和保健意识增强，蓝莓、树莓、刺梨等小水果类因其营养和保健等作用日益受到消费者喜爱，成为新兴水果，发展前景广阔。 [0003]我国蓝莓种植和研究较晚，从20世纪80年代才开始引进种植，但是近几年呈迅猛态势，在吉林、辽宁、山东、浙江、江苏、贵州等地区种植面积大，经济效益显著，开创了一条特色高效农业发展之路。
[0004]传统的扦插、压条等繁殖方法繁殖系数和出苗率低，难以满足迅速推广优良品种的需要。组织培养繁殖速度快，需要种苗少，能生产出无毒苗，因此被应用于蓝莓新品种的繁育。蓝莓茎段培养所用的基本培养基有MS、1/2MS、White、WPM( Woody PlantMedium )、改良 WPM (将 WPM 培养基中的 K2S04、CaCl2, FeSO4 和 Na2EDTA 以 KN03190mg/L、Ca(NO3)2.4H20684mg/L> C10H13FeN2NaO 873.4 mg /L 和盐酸硫胺素 0.1 mg/L 代替)、knops培养基和B5等几种。目前WPM及其改良型培养基是生产研究中较多为研究者所采用的基本培养基。
[0005]在组织培养中仍存在初代诱导率不高，育苗周期长，缺乏适合特定区域蓝莓品种的适宜培养基。由于蓝莓品种差异对培养基的营养成分需求也有不同，因此通过组织培养方式生产蓝莓种苗时依据品种需使用不同的培养基。
【发明内容】
[0006]本发明研究出一种适合我国南方地区栽植蓝莓品种的、具有节约成本、初代诱导率和增殖率高，缩短育苗周期、芽的质量好，得到的苗生根率高，出根能力强，叶片深绿色的
培养基。
[0007]本发明的技术方案是:.一种用于蓝莓组织培养的培养基，其特征在于所述的培养基其组分及含量为=NH4NO3 400 mg/L, MgSO4.7H20 370 mg/L, CaCl2.2H20 95 mg/L,Ca (NO3) 2.4H20 695 mg/L, KH2PO4 340 mg/L, K2SO4 745 mg/L, KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, ZnSO4.7H20 8.6 mg/L, Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H200.025 mg/L, MnSO4.4H20 22.3 mg/L, FeSO4.7H20 55.6 mg/L, Na2-EDTA 74.6 mg/L,甘氨酸2.0mg/L，肌醇 100 mg/L，盐酸硫胺素(VB1) 1.0 mg/L，盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L，烟酸 0.5mg/L,鹿糖30 g/L，琼脂7.0 g/L, pH为5.4,余量为蒸懼水。
[0008]培养基灭菌后冷却至40-70°C时加入无菌ZT，pH值调至5.4。
[0009]培养基灭菌后最好冷却至40-50°C时加入无菌ZT，pH值调至5.4。
[0010]ZT 加入量为 l-2mg/L。
[0011]一种用于蓝莓组织培养的培养基的制备方法，包括步骤:
①.大量元素A液，其组分及含量为=NH4NO38.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L ；
B 液，其组分及含量为=CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L ；
C 液，其组分及含量为=KH2PO4 6.8g/L，K2SO4H.9 g/L ；
②微量元素，其组分及含量为=KI0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L,Na2MoO4.2H20 0.025 g/L, CuSO4.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H20
2.23 g/L ；
③铁盐，其组分及含量为=FeSO4.7H20 2.78 g/L，Na2-EDTA 3.73 g/L ；
④有机元素:Vb其组分及含量为:盐酸硫胺素0.1 8/1，盐酸吡哆醇0.05 g/L，烟酸0.05 g/L ；
甘氨酸含量为:0.2 g/L ；
肌醇含量为:10.0 g/L。
[0012]其中混合配制IL培养基的用量为A液、B液、C液各50ml，铁盐20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml，蔗糖30 g/L，琼脂7.0 g/L，余量是蒸馏水；
⑤将上述配制好的培养基121°C温度下灭菌20min.。
[0013]培养基灭菌后冷却至40_50°C时加入无菌ZT, pH值调至5.4。
[0014]ZT 加入量为 l_2mg/L。
[0015]有益效果
以本发明的配方为基本培养基，在初代培养基上茎段诱导率为82.5~90.5%，平均初代诱导率较在WPM培养基上提高3.7% ;在继代培养基上的增殖率平均为7.8，较在WPM培养基上的增殖率高9.0%。苗生根率高，苗木健壮，育苗周期短，降低了成本，提高了苗木繁殖效率。
[0016]【具体实施方式】:
1、培养基的制备及灭菌
按照本培养基组分及含量配制母液:大量元素A液(NH4NO3 8.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L, )、B 液(CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L)、C 液(KH2PO4 6.8g/L, K2SO4H.9g/L)，微量元素(ΚΙ 0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L, Na2MoO4.2H20 0.025g/L, CuS04.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H20 2.23 g/L)、铁盐(FeS04.7H20 2.78 g/L，Na2_EDTA 3.73 g/L)、甘氨酸(0.2 g/L)、肌醇(10.0 g/L)、VB (盐酸硫胺素0.1 g/L,盐酸吡哆醇0.05 g/L,烟酸0.05 g/L)各1L。配制IL培养基的用量为A液、B液、C液各50ml，铁盐20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml。加入琼脂7.0 g/L,蔗糖30.0 g/L,加蒸馏水定容至1L，煮沸后，装入IL容量瓶中。在121°C温度下灭菌20min。在超净工作台上，用无菌(0.22um微孔滤膜)过滤器过滤1.0 mg/ml的ZT溶液。灭菌后的培养基冷却至40-70°C，最好是40 - 50°C时每升加入l_2ml 1.0 mg/ml无菌ZT溶液，PH调至5.4。其中ZT -zeatin,玉米素，从玉米嫩籽中分离出的一种存在于高等植物中的天然细胞分裂素；分子式:c1(ih13n5o。
[0017]2、外植体茎段的初代培养
2.1初代培养基
培养基灭菌后冷却至40-70°C，最好是40 - 50°C时用无菌移液枪每升中加入2ml
1.0 mg/ml的无菌ZT溶液，摇匀后分装到30根无菌试管中。将7-8cm茎段，70%酒精处理30s+0.l%HgCl26-8min，剪成单芽茎段接种在改良WPM+2mg/LZT的培养基上。。
[0018]2.2茎段诱导
4-6月份，剪取生长健壮，无病虫害的当年生枝条，去掉叶片，叶柄留l_2mm，剪成7~8cm的茎段，流水冲洗lh。在超净台上先在IL盛装70%酒精的烧杯中浸泡30s，无菌水冲洗3次,再在IL盛装0.1% HgCl2的烧杯中消毒6~8min,无菌水冲洗5次,每次5min,无菌滤纸吸干水分后剪成1.0-1.5cm单芽茎段，接种到分装培养基的试管中。25°C，黑暗培养7d后，每天光照培养14h，光强19001x，黑暗培养lOh，40-50d后继代。
[0019]诱导率=(萌芽茎段数/接种茎段数)X 100%
3个品种接种在改良WPM培养基上的诱导率为82.5-90.5%,较在WPM培养基上的诱导率分别高4.1%, 1.9%, 5.2%。品种间诱导率有差异，其中都克 > 蓝雨 > 灿烂。
[0020]表1不同品种芽诱导率
【权利要求】
1.一种用于蓝莓组织培养的培养基，其特征在于所述的培养基其组分及含量为:NH4NO3 400 mg/L, MgSO4.7H20 370 mg/L, CaCl2.2H20 95 mg/L, Ca (NO3) 2.4H20 695 mg/L,KH2PO4 340 mg/L, K2SO4 745 mg/L, KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, ZnSO4.7H20 8.6 mg/L,Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L,MnSO4.4H20 22.3mg/L, FeSO4.7H20 55.6 mg/L, Na2-EDTA 74.6 mg/L,甘氨酸 2.0mg/L,肌醇 100 mg/L,盐酸硫胺素(VB1 )1.0 mg/L，盐酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L，烟酸 0.5 mg/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 7.0g/L,余量为蒸懼水。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于:所述的培养基灭菌后冷却至40-70°C时加入无菌ZT，pH值调至5.4。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于:所述的培养基灭菌后冷却至40-50°C时加入无菌ZT，pH值调至5.4。
4.如权利要求2或3所述的培养基，其特征在于:所述的ZT加入量为l_2mg/L。
5.一种用于蓝莓组织培养的培养基的制备方法，包括步骤: ①.大量元素A液，其组分及含量为=NH4NO38.0g/L, MgSO4.7H20 7.4g/L ；
B 液，其组分及含量为=CaCl2.2H20 1.9 g/L, Ca(NO3)2.4Η2013.9 g/L ； C 液，其组分及含量为=KH2PO4 6.8g/L，K2SO4H.9 g/L ；
②微量元素，其组分及含量为=KI0.083 g/L, H3BO3 0.62 g/L, ZnSO4.7H20 0.86 g/L,Na2MoO4.2H20 0.025 g/L, CuSO4.5H20 0.0025 g/L, CoCl2.6H20 0.0025 g/L, MnSO4.4H202.23 g/L ；` ③铁盐，其组分及含量为=FeSO4.7H20 2.78 g/L，Na2-EDTA 3.73 g/L ； ④有机元素:Vb其组分及含量为:盐酸硫胺素0.1 8/1，盐酸吡哆醇0.05 g/L，烟酸0.05 g/L ；
甘氨酸含量为:0.2 g/L ；
肌醇含量为:10.0 g/L ； 其中混合配制IL培养基的用量为A液、B液、C液各50ml，铁盐20ml，微量元素、甘氨酸、肌醇、VB各10ml，蔗糖30.0g，琼脂7.0g，余量是蒸馏水； ⑤将上述配制好的培养基121°C温度下灭菌20min.。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的培养基灭菌后冷却至40-50°C时加入无菌ZT，pH值调至5.4。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述的ZT加入量为l_2mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK103548697SQ201310546475
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】涂俊凡, 秦仲麒, 李先明, 杨夫臣, 朱红艳, 伍涛 申请人:湖北省农业科学院果树茶叶研究所