专利名称：固定化酶的再生方法
技术领域：
本发明涉及有效利用油脂水解反应中使用过的固定化酶的残存活性，使油脂水解用固定化酶再生的方法。
背景技术：
当使用油脂分解酶使油脂进行水解时，为了有效地使用酶，使用将油脂分解酶固定在无机或者有机的载体上的固定化酶。该固定化酶，随着长期在水解反应中使用，其活性降低，因此在活性降低至某种程度的时刻需要进行回收，交换成新的固定化酶。
作为有效利用被回收的使用过的固定化酶的手段，容易考虑到完全去除附着在其上的油分和蛋白质，作为载体再利用的方法。但是，该方法产生酶载体的数百倍这样大量的洗涤废液，存在环境上的问题，同时也存在不能完全利用残存在使用过的固定化酶中的活性这样的问题。
另外，有下述方法，即，由在酯交换反应或酯转移反应中使用的活性已降低的固定化脂酶，通过溶剂洗涤排除酶反应的阻碍因素的方法(特开平5-137574号公报)，以及对利用低水分下的反应脱离了水的酶，通过使用溶剂、或者溶剂和磷脂进行湿润处理而控制有助于反应的水分，从而使残存的脂酶再活化的方法(特开平9-56379号公报、特开平11-75834号公报)。但是，这些方法不是通过一部分脂酶的脱离使活性已降低的固定化酶进行再生，归根到底是使残存的脂酶再活化的方法。
发明内容
本发明提供油脂水解用固定化酶的再生方法，其在油脂的水解反应中使用过的油脂分解用固定化酶中添加溶剂进行洗涤，调整该洗涤液中的脂肪酸平衡浓度后，去除洗涤液，使油脂水解酶被吸附。
图1是表示在各实施例和比较例中使用过的固定化酶的洗涤液中的脂肪酸浓度和得到的再生固定化酶的表达活性的关系的图。
具体实施例方式
本发明的目的在于，提供在有效利用油脂水解反应中使用过的固定化酶的残存活性的同时，以廉价而且少的废液量，再生成具有和使用前同等性能的油脂水解用固定化酶的方法。
当使油脂水解酶固定化时，通过使脂肪酸预先吸附在酶载体上，得到高活性的固定化酶是已知的(特开平1-153090号公报)。本发明人发现，不完全去除附着在油脂水解反应中使用过的固定化酶上的大量脂肪酸，用溶剂进行处理，使之残存对上述活化有效的量，然后吸附由于酶的脱离而降低了活性的酶，能够在环境上及经济上有利地使使用过的固定化酶再生成和新的固定化酶同等的活性。
作为成为本发明的再生方法对象的固定化酶中的固定化用载体，可举出水合无定形硅藻土、硅藻土、高岭土、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙、陶瓷等无机载体，陶瓷粉末，聚乙烯醇、聚丙烯、壳聚糖、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等有机高分子等，但特别希望是离子交换树脂。
作为离子交换树脂，最好是多孔性的阴离子交换树脂。这样的多孔性载体具有大的表面积，因此能够得到酶的更大吸附量。树脂的粒径最好是100～1000μm，细孔径最好是10～150nm。作为材质，可举出酚醛系、聚苯乙烯系、丙烯酰胺系、二乙烯基苯系等，特别希望是酚醛系树脂(例如Rohm and Hass公司制Duolite A-568)。
作为在本发明中使用的油脂分解酶，最好是脂酶。不用说脂酶来自动物、植物，也可以使用来自微生物的市售脂酶。作为来自微生物的脂酶，可举出起源于根霉属(Rizopus)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、假单胞菌属(Pseudomonas)、地霉属(Geotrichum)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)等的脂酶。
成为本发明的再生方法对象的使用过的固定化酶，是在油脂的水解反应中使用的活性降低的固定化酶。作为油脂，可举出大豆油、橄榄油、棕榈油、菜子油等植物油，牛油、猪油、鱼油等动物油。
作为在使用过的固定化酶的洗涤中使用的溶剂，可举出乙醇、正己烷、丙酮等，尤其以乙醇、正己烷为佳。另外，在没有残存酶的脱离·失活、能够减低酶使用量这方面，以正己烷为最佳。
如果用这些溶剂将使用过的固定化酶洗涤一定时间(30分钟左右)，洗涤液中的脂肪酸浓度和固定化酶的残存(吸附)脂肪酸量就达到平衡。洗涤液中的脂肪酸浓度例如以每单位重量溶液的溶解脂肪酸重量表示。另外，残存在固定化酶中的脂肪酸量例如以每单位重量固定化酶的脂肪酸重量表示。在本发明中，为了得到高活性的再生固定化酶，需要调整洗涤液中的脂肪酸平衡浓度。该脂肪酸平衡浓度可以根据去除洗涤液后被吸附的酶的形态适宜地进行调整，较好是4～28重量％，更好是5～25重量％，特别是5～22重量％，尤其最好是5～20重量％。对于溶剂的使用量，考虑洗涤前的固定化酶含有的脂肪酸量，洗涤液的脂肪酸平衡浓度达到成为上述范围的量即可，但一般来说，以使用过的固定化酶的3～20重量倍左右为佳，较好是3～15重量倍，更好是3～10重量倍，特别是5～10重量倍，尤其最好是5～8重量倍。使用溶剂的固定化酶的洗涤温度，最好是不引起残存的酶失活的0～60℃，特别最好是5～40℃。
使用溶剂洗涤后，通过过滤等去除洗涤液后，用缓冲液将固定化酶洗涤。通过使用该缓冲液的洗涤完全去除残存的溶剂，但此时，也可以利用蒸馏去除溶剂。尤其，在溶剂是正己烷的情况下，最好进行蒸馏。该蒸馏可以是常压蒸馏，也可以是减压蒸馏。作为缓冲液，可以使用在下面进行的酶的固定化中使用的缓冲液。
进行酶的固定化的温度可以根据酶的特性决定，但最好是不引起酶失活的0～60℃，特别最好是5～40℃。并且在固定化时使用的酶溶液的pH值，只要是不引起酶的改性的范围即可，与温度同样可以根据酶的特性决定，但pH最好是3～9。为了维持该pH，使用缓冲液，作为缓冲液，可举出乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、tris盐酸缓冲液等。
上述酶溶液中的酶浓度，从固定化效率这点考虑，希望是酶的饱和溶解度以下且足够的浓度。并且被吸附的酶量，可以根据使用过的固定化酶的残存活性进行调整。作为酶溶液，根据需要，可以使用用离心分离去除不溶部分后的上清液或通过超滤等进行纯化得到的酶溶液。
酶的固定化后，通过过滤回收湿润状态的固定化酶，也可以直接在下面的油脂水解反应中使用，并且根据需要，也可以通过使用特开平12-166552号公报中记载的油脂进行处理的方法或干燥等去除水分。
再者，固定化酶的活性(1U)表示在40℃，一边搅拌混合油脂∶水＝100重量份∶25重量份的混合液，一边进行30分钟水解时，在1分钟生成1μmol的游离脂肪酸的酶的分解能力。
实施例使用过的固定化酶的准备在N/10的氢氧化钠水溶液100重量份中将10重量份Duolite A-568(Rohmand Hass公司)搅拌1小时。过滤后，用100重量份的离子交换水进行洗涤，用500mM的磷酸缓冲液(pH7)100重量份进行pH的平衡化。此后，用50mM的磷酸缓冲液(pH7)100重量份每2小时进行2次pH的平衡化。此后进行过滤，回收载体后，用40重量份乙醇进行乙醇置换。过滤后，加入10重量份蓖麻油酸和31.6重量份乙醇的混合液，在30分钟使蓖麻油酸吸附在载体上。此后，回收载体，用50mM磷酸缓冲液(pH7)50重量份每30分钟进行4次洗涤，去除乙醇，进行过滤，回收载体。此后，使3.88重量份的脂酶(脂酶AY amano30，天野制药公司)与溶解在50mM的磷酸缓冲液(pH7)180重量份中的酶液接触2小时，进行固定化。此时，由固定化后的酶液的残存活性和固定化前的酶液的活性之差求出固定化率，是70％。固定化后进行过滤，回收固定化酶后，用50mM的磷酸缓冲液(pH7)50重量份进行30分钟洗涤，去除未固定化的酶或蛋白质。在洗涤后进行过滤，回收湿润状态的固定化酶。接着使回收的固定化酶和40重量份的菜子油接触2小时，进行过滤，回收油处理过的固定化酶。以上操作全部在20℃进行。
通过以上的操作调制成的固定化酶，初期的表达活性是2800U/g。将该固定化酶填充在柱中，一边混合反应基质(菜子油∶水＝100重量份∶60重量份)，一边在柱中循环进行水解，该操作连续地反复进行。酶的表达活性随反应操作的反复而降低，回收具有各种残存活性的使用过的固定化酶(活性降低酶)。
实施例1对残存活性770U/g的使用过的固定化酶10重量份(干燥基准)，加入72重量份乙醇进行分散，搅拌30分钟。此时，搅拌操作后的洗涤液中的脂肪酸浓度是12.9重量％。过滤后，用50mM的磷酸缓冲液(pH7)50重量份每30分钟进行4次洗涤，去除乙醇，进行过滤，回收载体。此后，使3.88重量份的脂酶(脂酶AYamano30，天野制药公司)与溶解在50mM的磷酸缓冲液(pH7)180重量份中的酶液接触2小时，进行固定化。此时，由固定化后的酶液的残存活和固定化前的酶液的活性之差求出固定化率，是67％。固定化后进行过滤，回收固定化酶后，用50mM的磷酸缓冲液(pH7)50重量份进行30分钟洗涤，去除未固定化的酶或蛋白质。在洗涤后进行过滤，回收湿润状态的固定化酶。以上的操作全部在20℃进行。
通过以上操作再生的固定化酶初期的表达活性是2600U/g。
实施例2除所用的乙醇是40重量份以外，和实施例1相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是22.3重量％，酶的固定化率是73.1％，表达活性是2401U/g。
实施例3除使用过的固定化酶的残存活性是800U/g、所用的乙醇是40重量份以外，和实施例1相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是19.7重量％，酶的固定化率是70.9％，表达活性是2910U/g。
实施例4除使用过的固定化酶的残存活性是1440U/g、所用的乙醇是72重量份以外，和实施例1相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是13.1重量％，酶的固定化率是69.6％，表达活性是3014U/g。
实施例5代替乙醇使用正己烷，和实施例1相同地使使用过的固定化酶分散，进行30分钟搅拌操作。此时，搅拌操作后的溶液中的脂肪酸浓度是12.8重量％。过滤后，投入50mM的磷酸缓冲液(pH7)50重量份，在20℃、于30托的减压下搅拌30分钟，去除溶剂。过滤后，用50mM的磷酸缓冲液(pH7)50重量份每30分钟洗涤3次，进行过滤，回收载体。此后的脂酶吸附和实施例1相同地进行。酶的固定化率是70％，再生后的表达活性是2672U/g。
实施例6除所用的正己烷是110重量份以外，和实施例5相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是8.9重量％，酶的固定化率是81.4％，表达活性是2489U/g。
实施例7除使用过的固定化酶的残存活性是1440U/g、所用的正己烷是68重量份以外，和实施例5相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是13.7重量％，酶的固定化率是67.5％，表达活性是2768U/g。
实施例8使用过的固定化酶的残存活性是605U/g，所用的正己烷是182重量份，使36.8重量份脂酶(脂酶AYamano25L，天野制药公司)与溶解在50mM的磷酸缓冲液(pH7)148重量份中的酶液接触2小时，进行固定化，除此以外和实施例5相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是6.0重量％，酶的固定化率是81.8％，表达活性是2814U/g。
实施例9除使用过的固定化酶的残存活性是604U/g、所用的正己烷是89重量份以外，和实施例8相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是11.7重量％，酶的固定化率是76.3％，表达活性是3016U/g。
比较例1除使用过的固定化酶的残存活性是700U/g、所用的乙醇是530重量份以外，和实施例1相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是2重量％，酶的固定化率是81.8％，表达活性是1744U/g。
比较例2除所用的正己烷是24重量份以外，和实施例5相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是30.4重量％，酶的固定化率是59.8％，表达活性是2167U/g。
比较例3除所用的正己烷是337重量份以外，和实施例5相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是3.1重量％，酶的固定化率是83.8％，表达活性是2200U/g。
比较例4除使用过的固定化酶的残存活性是607U/g、所用的正己烷是552重量份以外，和实施例8相同地进行。洗涤液中的脂肪酸浓度是2.0重量％，酶的固定化率是79.0％，表达活性是2334U/g。
在图1中示出各实施例和比较例中的使用过的固定化酶洗涤液中的脂肪酸浓度和得到的再生固定化酶的表达活性的关系。
权利要求
1.油脂水解用固定化酶的再生方法，该再生方法是在油脂的水解反应中使用的油脂分解用固定化酶中添加溶剂进行洗涤，调整该洗涤液中的脂肪酸平衡浓度后，去除洗涤液，使油脂水解酶被吸附。
2.根据权利要求1所述的油脂水解用固定化酶的再生方法，其中，将该洗涤液中的脂肪酸平衡浓度调节成4～28重量％。
3.根据权利要求1或2所述的再生方法，其中，溶剂是乙醇或者正己烷。
全文摘要
在油脂的水解反应中使用的油脂分解用固定化酶中添加溶剂进行洗涤，调整该洗涤液中的脂肪酸平衡浓度后，去除洗涤液，使油脂水解酶被吸附的油脂水解用固定化酶的再生方法。根据本发明方法，能够有效地利用油脂水解反应中使用过的固定化酶的残存活性，以廉价而且少的废液量，再生成具有和使用前同等性能的油脂水解用固定化酶。
文档编号C12P7/64GK1495256SQ0313275
公开日2004年5月12日 申请日期2003年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者小松利照, 仙田良孝, 宇治田吾朗, 吾朗, 孝 申请人:花王株式会社