专利名称：一种pcr检测sars病毒基因的方法
技术领域：
本发明关于一种PCR检测SARS病毒基因的方法，尤其是一种多重巢式PCR检测SARS病毒基因的方法。
背景技术：
SARS病毒的检测方法主要有(1)病原学检测，通过病毒对敏感的细胞株(如vero细胞)所致的病变效应及电镜下病毒形态的观察来检测SARS病毒。(2)免疫学方法检测，用直接免疫法或间接免疫法分别检测标本中的抗原或抗体。(3)分子生物学检测方法，采用聚合酶链式反应(PCR)方法检测病毒的基因序列。虽然细胞培养及病毒形态的观察是一种准确的检测方法，但细胞培养条件要求较高，仪器(如电镜)较昂贵，整体实验操作较烦琐，普通实验室无法开展工作。相比较，免疫学检测法较容易开展，且其特异性和敏感性都很高，但病人产生抗体需在感染后2周甚至20天以后才能测到，不利于早期检测；如若检测抗原，则需恢复期病人的血清或其它免疫动物血清，试剂难以获得。
PCR技术是利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶在体外合成DNA片段，通过反复循环的DNA变性、退火和延伸，可使靶DNA得到大量扩增。传统的PCR方法主要包括内标法、PCR-ELISA法和实时荧光定量PCR法。
内标法通常是在不同的PCR反应管中加入已定量的人工合成内标和一对引物(其一为荧光标记)，在模板扩增的同时，内标也被扩增，在PCR产物中，由于内标和模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量检测模板。
PCR-ELISA法是利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再与加入的酶标抗地高辛或抗生物素结合，最终酶使底物显色。上述内标法和PCR-ELISA都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性较差。
实时荧光定量PCR可实现从定性到定量的转变，是指在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这种技术可实现荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，且每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，有效地解决了传统定量只能终点检测的局限。
上述现有PCR方法一般每次扩增只针对一种病毒。如果一份血样，要检测其是否含有多种病毒中的某一种或多种的话，则需要分别进行多次PCR反应，因而费时费力，耗费药品试剂多，检测成本高。于是多重PCR方法便应运而生，其即是在一个试管中、在同一种反应条件下对两个或两个以上的不同靶基因进行同步扩增，这样能大大地提高PCR检测效率。
PCR技术用于检测病毒的基因，是一种快速的检测方法，受标本中病毒基因含量多少及其它方面的影响，但是应用PCR技术进行病毒基因(如SARS)检测常会出现假阴性或假阳性的错误，导致误诊或漏诊。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种多重巢式PCR检测SARS病毒基因的方法，利用在病毒基因组五个相对保守的区域设计的引物进行多重PCR，可防止病毒基因某些部位发生突变而导致假性或阴性结果。
本发明提供一种PCR检测SARS病毒基因的方法，包括步骤一提取SARS病毒RNA；步骤二根据SARS病毒基因设计若干套引物；和步骤三采用步骤二设计的引物对SARS病毒RNA进行多重巢式PCR扩增。
步骤一包括提取标本中病毒RNA，标本用量为140μl，然后经逆转录成cDNA。
步骤二设计五套引物，分别对应SARS病毒基因的ORF1b，S，E，M，N五个相对保守区域。
这五套引物所扩增的区域分别为1.外侧28710-29119(410bp)；内侧28750-28910(161bp)；2.外侧25920-26481(561bp)；内侧26008-26410(403bp)；3.外侧24415-24878(464bp)；内侧24494-24831(338bp)；4.外侧15255-15705(451bp)；内侧15368-15638(271bp)；5.外侧17931-18336(406bp)；内侧18038-18248(211bp)。
这五套引物分别是S1外侧ttcaactcctggcagcagtagg，aagtcagccatgttcccgaag，S1内侧atggctagcggaggtggtg，gtacgtttttggcgaggctt；S2外侧aaattactacagacactggta，aggaataggaaacctattac，S2内侧aatcgacggctcttcaggag，cgttgtctgccatgataagca；S3外侧ttgacaggttaattacaggcagacttc，tgagtcaagctcaggttgcagag，S3内侧ggcttctgctaatcttgctgctac，tgccaataacgacatcacaatttc；S4外侧atgcttaggataatggcctctcttg，tgctagctactaaaccttgagccg，S4内侧ggtcatgtgtggcggctc，catcatggagaaatgtttacgcag；S5外侧agtctagaaataccacgtcgcaatg，cagtcggtacagctactaagttaacacc，S5内侧acctacacacctcagcgttgatataa，gccctctacatcaaagccaatc。
上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系均为10×buffer(15mMMgCl2)2.5μl，10mMdNTP 0.5μl，25mM MgCl20.6μl，引物1(F/R)各0.15μl，引物2(F/R)各0.30μl，引物3(F/R)各0.10μl，引物4(F/R)各0.10μl，引物(F/R)各0.10μl，模板(标本cDNA)3μl，Hotstart Taq酶0.17μl，ddH2O 16.7μl，共25μl反应体系。上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系同时设阳性和阴性对照。
PCR的扩增条件为95℃15min；94℃40s，59℃30s(↓0.5℃/cycle)，72℃40s，共12cycles；94℃40s，52℃30s，72℃40s，共30cycles；72℃10min。
PCR扩增产物经3％琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪观察。
本发明利用在病毒基因组五个相对保守的区域设计的引物进行多重PCR，可防止病毒基因某些部位发生突变而导致假性或阴性结果。
本发明提取适量SARS病毒基因，经逆转录后，利用巢式PCR原理，进行两轮扩增反应，能有效地增加目的基因量，从而提高阳性检出率。本发明优于免疫学检测技术的特点在于，它可用于检测感染早期的病例而不仅是检测病人感染相当长一段时间后产生的抗体。
图1是SARS病毒的基因结构示意图。
图2是本发明多重巢式PCR扩增示意图。
具体实施例方式
现结合说明书附图，对本发明PCR检测SARS病毒基因的方法作进一步详细说明。
由于SARS具有极强的传染性，给人民健康和社会生活带来了极大的不便，同时也对经济建设和社会发展产生了一定的影响。本发明即旨在提供一种多重巢式PCR检测SARS病毒基因的方法，利用在病毒基因组五个相对保守的区域设计的引物进行多重PCR，可防止病毒基因某些部位发生突变而导致假性或阴性结果。
本发明包括步骤一提取SARS病毒RNA；步骤二采用特选的五套引物对上述SARS病毒RNA进行多重巢式PCR扩增，这五套引物分别设计在其ORF1b，S，E，M，N五个相对保守区域；和步骤三，用实时荧光定量PCR方法检测步骤一中所提取的SARS病毒RNA含量，并与步骤二的检测结果进行对比。
其中，步骤一采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(购自QIAGEN公司)提取标本中病毒RNA，具体操作根据QIAamp Viral RNA MiniKit Handbook 01/99进行，标本用量为140μl，然后经逆转录成cDNA。
步骤二根据NCBI网站所提供的SARS冠状病毒Tor2全基因组序列，用primer express2.0引物设计软件设计五套引物用于进行多重巢式PCR。
图1所示的是SARS病毒的基因结构图，本发明的五套引物分别设计在其0RF1b，S，E，M，N五个相对保守区域，大箭头显示外侧的引物，小箭头显示相应的内侧引物(大箭头在小箭头上方)。
本发明五套引物所扩增的区域分别为1.外侧28710-29119(410bp)；内侧28750-28910(161bp)；2.外侧25920-26481(561bp)；内侧26008-26410(403bp)；3.外侧24415-24878(464bp)；内侧24494-24831(338bp)；4.外侧15255-15705(451bp)；内侧15368-15638(271bp)；5.外侧17931-18336(406bp)；内侧18038-18248(211bp)。
所述五套引物分别是S1外侧ttcaactcctggcagcagtagg，aagtcagccatgttcccgaag，S1内侧atggctagcggaggtggtg，gtacgtttttggcgaggctt；S2外侧aaattactacagacactggta，aggaataggaaacctattac，S2内侧aatcgacggctcttcaggag，cgttgtctgccatgataagca；S3外侧ttgacaggttaattacaggcagacttc，tgagtcaagctcaggttgcagag，S3内侧ggcttctgctaatcttgctgctac，tgccaataacgacatcacaatttc；S4外侧atgcttaggataatggcctctcttg，tgctagctactaaaccttgagccg，
S4内侧ggtcatgtgtggcggctc，catcatggagaaatgtttacgcag；S5外侧agtctagaaataccacgtcgcaatg，cagtcggtacagctactaagttaacacc，S5内侧acctacacacctcagcgttgatataa，gccctctacatcaaagccaatc。
这五套引物对应其所扩增的区域分别为1.外侧引物5’ttcaactcctggcagcagtagg，3’aagtcagccatgttcccgaag；扩增区域为28710-29119(410bp)；内侧引物5’atggctagcggaggtggtg，3’gtacgtttttggc gaggctt；扩增区域为28750-28910(161bp)。
2.外侧引物5’aaattactacagacactggta，3’aggaataggaaacctattac；扩增区域为25920-26480(561bp)；内侧引物5’aatcgacggctcttcaggag，3’cgttgtctgccatg ataagca；扩增区域为26008-26410(403bp)。
3.外侧引物5’ttgacaggt taattacaggcagacttc，3’tgagtcaagctcaggttgcagag；扩增区域为24415-24878(464 bp)；内侧引物5’ggcttctgctaatcttgctgctac，3’tgccaataacg acatcacaatttc；扩增区域为24494-24831(338bp)。
4.外侧引物5’atgc ttaggataatggcctctcttg，3’tgctagctactaaaccttgagccg；扩增区域为15255-15705(451bp)；内侧引物5’ggtcatgtgtggcggctc，3’catcatggagaaat gtttacgcag；扩增区域为15368-15638(271bp)。
5.外侧引物5’agtc tagaaataccacgtcgcaatg，3’cagtcggtacagctactaagttaacacc；扩增区域为17931-18336(406bp)；内侧引物5’acctacacacctcagcgttgatataa，3’gccctctacatcaaagccaatc；扩增区域为18038-18248(211bp)。
步骤三进行PCR扩增。上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系均为10×buffer(15mM MgCl2)2.5μl，10mMdNTP 0.5μl，25mM MgCl20.6μl，引物1(F/R)各0.15μl，引物2(F/R)各0.30μl，引物3(F/R)各0.10μl，引物4(F/R)各0.10μl，引物5(F/R)各0.10μl，模板(标本cDNA)3μl，Hotstart Taq酶0.17μl，ddH2O16.7μl，共25μl反应体系。
上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系同时设阳性和阴性对照。
PCR扩增条件为95℃15min；94℃40s，59℃30s(↓0.5℃/cycle)，72℃40s，共12cycles；94℃40s，52℃30s，72℃40s，共30cycles；72℃10min。
PCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪观察。
与普通RT-PCR相比，本发明经逆转录后，利用巢式PCR的原理，进行两轮扩增反应，有效地增加目的基因量，从而提高阳性检出率。利用在病毒基因组五个相对保守的区域设计的引物进行多重PCR，可防止病毒基因某些部位发生突变而导致假阴性结果。且本发明不需要特别昂贵的仪器。本发明优于免疫学检测技术的特点在于，它可用于检测感染早期的病例而不是检测病人感染相当长一段时间后产生的抗体。
本发明通过所设计的近乎跨SARS病毒全基因组的五套引物，经合适的比例组合，采用多重巢式PCR方法，能够准确、有效地检测病人标本中存在的SARS病毒基因，为及早发现和检出SARS病例及预防和控制疾病流行提供了可靠的依据，也为其它由病毒引起的其它传染性疾病的检测提供了一个技术平台。
权利要求
1.一种PCR检测SARS病毒基因的方法，包括步骤一提取SARS病毒RNA；步骤二根据SARS病毒基因设计若干套引物；步骤三采用步骤二设计的引物对SARS病毒RNA进行多重巢式PCR扩增。
2.如权利要求1所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于步骤一包括提取标本中的病毒RNA，标本用量为140μl，然后经逆转录成cDNA。
3.如权利要求1或2所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于步骤二设计五套引物，分别对应SARS病毒基因的ORF1b，S，E，M，N五个相对保守区域。
4.如权利要求3所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于这五套引物所扩增的区域分别为1.外侧28710-29119(410bp)；内侧28750-28910(161bp)；2.外侧25920-26481(561bp)；内侧26008-26410(403bp)；3.外侧24415-24878(464bp)；内侧24494-24831(338bp)；4.外侧15255-15705(451bp)；内侧15368-15638(271bp)；5.外侧17931-18336(406bp)；内侧18038-18248(211bp)。
5.如权利要求4所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于这五套引物分别是S1外侧ttcaactcctggcagcagtagg，aagtcagccatgttcccgaag，S1内侧atggctagcggaggtggtg，gtacgtttttggcgaggctt；S2外侧aaattactacagacactggta，aggaataggaaacctattac，S2内侧aatcgacggctcttcaggag，cgttgtctgccatgataagca；S3外侧ttgacaggttaattacaggcagacttc，tgagtcaagctcaggttgcagag，S3内侧ggcttctgctaatcttgctgctac，tgccaataacgacatcacaatttc；S4外侧atgcttaggataatggcctctcttg，tgctagctactaaaccttgagccg，S4内侧ggtcatgtgtggcggctc，catcatggagaaatgtttacgcag；S5外侧agtctagaaataccacgtcgcaatg，cagtcggtacagctactaagttaacacc，S5内侧acctacacacctcagcgttgatataa，gccctctacatcaaagccaatc。
6.如权利要求5所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系均为10×buffer(15mM MgCl2)2.5μl，10mMdNTP 0.5μl，25mM MgCl20.6μl，引物1(F/R)各0.15μl，引物2(F/R)各0.30μl，引物3(F/R)各0.10μl，引物4(F/R)各0.10μl，引物(F/R)各0.10μl，模板(标本cDNA)3μl，Hotstart Taq酶0.17μl，ddH2O 16.7μl，共25μl反应体系。
7.如权利要求6所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于上述五个区域的外、内侧PCR扩增体系同时设阳性和阴性对照。
8.如权利要求7所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于PCR的扩增条件为95℃15min；94℃40s，59℃30s(↓0.5℃/cycle)，72℃40s，共12cycles；94℃40s，52℃30s，72℃40s，共30cycles；72℃10min。
9.如权利要求8所述的PCR检测SARS病毒基因的方法，其特征在于PCR扩增产物经3％琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪观察。
全文摘要
本发明关于一种PCR检测SARS病毒基因的方法，包括步骤一提取SARS病毒RNA；步骤二根据SARS病毒基因设计若干套引物；和步骤三采用步骤二设计的引物对SARS病毒RNA进行多重巢式PCR扩增。本发明提取适量SARS病毒基因，经逆转录后，利用巢式PCR原理，进行两轮扩增反应，能有效地增加目的基因量，从而提高阳性检出率。本发明利用在SARS病毒基因组五个相对保守的区域设计的引物进行多重PCR，可防止病毒基因某些部位发生突变而导致假性或阴性结果。
文档编号C12Q1/68GK1493702SQ03150948
公开日2004年5月5日 申请日期2003年9月15日 优先权日2003年9月15日
发明者顾柏炜, 赵瑞华, 施静艺, 陈赛娟 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院