专利名称：用于预防和治疗获得性免疫缺陷综合症的协同组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及一种用于预防和治疗获得性免疫缺陷综合症的方法和组合物。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合症(“AIDS”)是一种特征为免疫系统衰弱而很难抵抗机会性感染的疾病。这些导致严重疾病的机会性感染会危急到AIDS患者的生命，但其通常会被具有健康免疫系统的未受感染的个体所控制。不幸的是，AIDS患者的免疫系统通常很弱，从而需要医疗干涉来控制疾病或预防死亡。
AIDS主要由一种已知为人类免疫缺陷病毒1型(“HIV-1”)的逆转录病毒所导致。HIV-1通过侵入人体并接着感染和耗竭辅助性T细胞来削弱免疫系统。辅助性T细胞对于一个健康的免疫系统而言是至关重要的，因为其控制B细胞产生抗体、细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞)的成熟、巨噬细胞和自然杀伤细胞的成熟和活性及免疫系统的很多其它调节剂和效应子功能。
辅助性T细胞的感染和耗竭经过一个多步骤过程而发生，该过程需要病毒附着到辅助性T细胞的CD4受体；病毒附着到共受体CXCR4或CCR5；病毒与细胞融合；病毒脱壳；病毒RNA反转录以形成DNA；第二股DNA的合成；DNA迁移到辅助性T细胞核；病毒DNA整合到辅助性T细胞基因组；转录DNA以产生RNA；翻译病毒RNA以产生病毒多蛋白；所述多蛋白的病毒蛋白酶分裂以产生病毒蛋白；和所述病毒蛋白的组合和出芽(budding)以形成新的病毒并破坏宿主细胞。已设计了不同药物和治疗方法来干涉一个或一个以上这些步骤。用于预防或治疗所述疾病的典型方法包括使用具有以下作用的化合物抑制病毒附着到辅助性T细胞或如巨噬细胞的其它靶细胞(附着抑制剂)；抑制病毒与靶细胞融合(融合抑制剂)；预防病毒DNA整合到辅助性T细胞DNA(整合酶抑制剂)；预防DNA与病毒RNA合成(反转录酶抑制剂)；和预防蛋白酶将病毒多蛋白分裂成病毒蛋白(蛋白酶抑制剂)。
此等化合物有一些已经显示出具有协同作用，例如Beale，K.K.和Robinson，W.E.，Jr.，反转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂的组合在体外可对防止药物敏感和抗RT抑制剂的HIV-1的分子克隆具有协同作用。Antiviral Res.46223-232(2000)和Essey，R.J.，McDougall，B.R.和Robinson，W.E.，Jr.，错位双股RNA(poly I-poly C12U)与不同类别的抗HIV药物具有协同作用且对抵抗体外药物敏感和抗药性HIV-1具有增效作用。Antiviral Res.，51189-202(2001)。
然而，已证明很难有效地预防或治疗AIDS。该病毒具有对用来治疗该疾病的药物产生突变和抗性的能力，所述药物包括添加和协同药物组合。因为存在此一难题，所以需要不断发现用于治疗该疾病的新颖药物和方法。
最新焦点问题集中在使用附着抑制剂和融合抑制剂来预防HIV-1感染，而非使用在感染后起作用的药物如反转录酶或蛋白酶抑制剂，即西班牙巴塞罗那，2002年7月7-12日，第十四届国际艾滋病大会的计划和摘要(Programand Abstracts of the XIV International AIDS Conference)，“Greenberg.，Fusion Inhibitors。摘要MoOrA139”和“W.Olson等人，The Attachment and CCR5 Inhibitors PRO 542 and PRO 140.AbstractMoOrA140。摘要MoOrA140。”实际上，已发现附着和融合抑制剂可有效预防辅助性T细胞的HIV-1感染。
HIV-1进入辅助性T细胞或巨噬细胞的发生分为不同的步骤，即附着和融合。附着和融合要求若干病毒与细胞蛋白在不同的阶段相互作用(1)使病毒包膜蛋白附着到主要受体CD4；(2)使病毒蛋白发生构象变化，从而与共受体结合；和(3)暴露病毒蛋白，使病毒与靶细胞膜融合。主要通过病毒蛋白gp120和gp41作为引起附着和融合的媒介。gp120和gp41形成一种在病毒粒子表面上呈现为三聚体的合成物。gp120是附着到靶细胞表面上的主要受体CD4的病毒蛋白。gp120附着使病毒与细胞发生接触，虽然此接触不够充分以开始融合。CD4的胞外区包含4个区域(D1、D2、D3和D4)。CD4上的HIV-1 gp120结合部位包含CD4区域1(D1)中的氨基酸40到60(股C′、C″和D)、类似于免疫球蛋白(Ig)5区的CDR2的延伸物(stretch)。gp120附着到CD4之后，gp120经历构象变化，且因此结合到趋化因子共受体(CCR5或CXCR4)。CCR5是巨噬细胞嗜性和特定T细胞嗜性主要HIV-1分离物所使用的趋化因子受体，而多数T细胞嗜性主要HIV-1分离物和T细胞系适应HIV-1株使用CXCR4。一些T细胞嗜性分离物为可使用CCR5或CXCR4作为共受体的双嗜性。HIV-1 gp120与共受体相互作用之后暴露HIV-1 gp41。gp41接着经历形成与靶细胞膜的附着的叉形(harpoon-like)构象变化，并接着使用一个类弹簧机械以形成三螺旋、u型蛋白质结构，已知为发夹(hairpin)三聚体。形成所述发夹结构拉近了病毒与细胞的距离并开始了膜融合。此融合导致所述病毒颗粒进入靶细胞并随后感染所述细胞。
通过抑制附着来预防HIV-1感染的尝试被证明是成功的。2001年10月30日颁给Chang等人(转让给Tanox公司(休斯顿，TX))的题为“Antibodiesspecific for CD4-binding domain of HIV-1”的美国专利第6,309,880号揭示了位于HIV-1 gp120的CD4结合区域中的特定抗原决定部位和特定用于所述抗原决定部位的、可通过各种病毒株和分离物而抑制人类细胞HIV-1感染的抗体。1999年2月16日颁给Burkly等人(转让给Biogen公司(剑桥，MA))的题为“Anti-CD4 antibody homologs useful in prophylaxis andtreatment of AIDS，ARC and HIV infection”的美国专利第5,871,732号揭示了适用于预防或治疗哺乳动物的疾病(包括AIDS)的抗CD4抗体同系物。1998年10月6日颁给Allaway等人(转让给Progenics制药公司(塔利顿，NY))的题为“Synergistic composition of CD4-based protein andanti-HIV-1 antibody，and methods of using same”的美国专利第5,817,767号揭示了含有特定用于HIV-1包膜糖蛋白的CD4基免疫交联物和抗体的组合物。本发明的组合物可协同作用以中和HIV-1。1999年7月13日颁给Tilley等人(转让给纽约城市公共卫生研究所(Public Health Research Instituteof the City of New York)公司(纽约，NY))的题为“Synergisticneutralization of HIV-1 by human monoclonal antibodies and otherantibodies directed against the V3 loop and the CD-4 binding site ofGP-120，and the use for immunotherapy of HIV-1 infection”的美国专利第5,922,325号揭示了特定用于HIV-1包膜糖蛋白gp120的抗体的协同组合。所述抗体中的一个特定用于第三变异环(V3 loop)，另一个特定用于gp120的CD-4结合部位。2001年6月5日颁给Zolla-Pazner等人(转让给纽约大学(纽约，NY))的题为“Human monoclonal antibodies to theCD4-binding domain of HIV，uses thereof and synergisticneutralization of HIV”的美国专利第6,241,986号揭示了特定用于HIVgp120的CD4结合区域的单克隆抗体，其适用于中和HIV-1及预防HIV感染和治疗经HIV感染的患者。2000年10月24日颁给Hanna等人(转让给IDEC药品公司(圣地亚哥，CA))的题为“Recombinant anti-CD4 antibodies forhuman therapy”的美国专利第6,136,310号揭示了特定用于人类CD4抗原的嵌合抗体。
通过抑制融合来预防HIV感染的尝试也已经被证明是成功的。分别于2000年1月18日和2001年8月28日颁给Kang等人(转让给特里美里斯公司(Trimeris，Inc))的题为“Methods and compositions for peptidesynthesis”的美国专利第6,015,881号和第6,281,331号揭示了肽T-20和适用于治疗HIV-1感染的相关的肽。T-20，又称为pentafuside，是一种36氨基酸肽，其预防HIV-1与靶细胞之间的体外和体内融合。T-20及其类似物衍生自HIV-1 gp41的C-端肽(C-terminus peptide)片断。此肽片断涉及到与HIV-1 gp41的N-端肽对应部分的相互作用中。这些C-和N-端肽的结合导致发夹三聚体(trimer-of-hairpin)的形成，所述发夹三聚体对于靶细胞膜与HIV-1病毒外套(viral coat)(Sodroski，Cell 1999；99243-6)之间的融合来说是至关重要的。小分子肽干扰发夹三聚体的形成。Trimeris和Hoffmann-La Roche将小分子肽发展为FuzeonTM牌恩弗韦特(enfuvirtide)(T-20)。一种已知为T-1249的39氨基酸肽是一种具有类似功能的融合抑制剂。
已知为5-Helix的蛋白质通过使用HIV-1 gp41的N-端肽片断来阻断HIV-1 gp41的C-端肽片断从而抑制发夹三聚体的形成。所述蛋白质5-Helix由交替连接的gp41的N-和C-端肽片断(N-C-N-C-N)组成。以此方式构成此一结构，使其不会引起蛋白质分子的聚集(Root等人，Sci.2001；291884-8)。
使用附着和融合抑制剂及其它抗病毒药物来治疗AIDS是有效的。目前对HIV-1感染的临床治疗包括三联药物组合，称为高活性抗逆转录病毒疗法(“HAART”)。HAART通常涉及核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV-1蛋白酶抑制剂的各种组合。在顺应的患者中，HAART在降低死亡率和HIV-1感染向AIDS发展的方面是有效的。然而，这些多药物疗法并未消除HIV-1，且长期的治疗常常导致多药抗性。同样，这些药物很多是高毒性的且/或需要复杂的剂量表，其降低了顺应性并限制了功效。因此，需要不断开发用于预防和治疗HIV-1感染和AIDS的额外药物。理想地是这些药物能针对HIV-1感染生命周期的早期阶段，即抑制或预防附着和融合。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供一种用于预防或治疗如辅助性T细胞和巨噬细胞的靶细胞的HIV-1感染的方法和组合物。
本发明的另一目标是提供用于预防或治疗AIDS的方法和组合物。
此等和其它目标通过将靶细胞暴露给至少一种附着抑制剂(如结合到CD4的抗体)与至少一种融合抑制剂(如小分子肽)的协同组合来达成。所述组合是有用的，因为当以与单独使用时相同的量一起使用此两者时，其协同作用允许使用更少的药物或增加了该等药物的功效。
所属领域的技术人员将不难发现本发明的其它和另外目标、特征和优点。
具体实施例方式
定义术语“患者”指易感染HIV-1和发展成AIDS的灵长类动物。根据本发明而治疗的灵长类动物优选为人类。
术语“接连”指将本发明的附着抑制剂和融合抑制剂(1)以相同或不同的投药途径以相同或不同频率分别投予患者，或(2)以一种医药上可接受的组合物形式一起投予患者。
术语“非经肠”指通过静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射而投药，或指通过皮下植入而投药。
术语“协同作用”指个别化合物之间的协作效应，使总效应大于独立采用化合物的效应的总和。
术语“功能等效肽”指具有与多肽相同生物活性的多肽片段。
术语“靶细胞”指HIV-1可附着和感染的任何表达细胞膜上的CD4和/或趋化因子共受体CCR5或CXCR4的细胞，例如辅助性T细胞和巨噬细胞，或可通过未经感染的细胞与表达细胞膜上的HIV-1 gp120和gp41的HIV-1感染细胞之间的融合而被感染的任何细胞。
本发明并不限于本文所描述的特定方法论、协议和试剂，因为它们是可以改变的。另外，本文中所使用的术语仅为了描述特定实施例的目的，且不欲限制本发明的范围。除非本文另有规定，如在上述权利要求书中所使用的单数形式“一”和“所述”包括复数指代，例如对“一宿主细胞”的指代包括复数个该等宿主细胞。
除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语及任何缩写的意义与本发明所属领域的技术人员所一般理解的意义相同。尽管本文描述了优选方法、装置和材料，但是与本发明所描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实践中。
本文中所提及的所有专利案和公开案均在合法范围内以引用的方式并入本文中，其目的是描述和揭示其中所报导的可用于本发明的抗体、多肽、肽和方法论。然而，其内容并无法推断承认本发明不具有在根据先前发明的此一揭示内容之前的权利。
发明一方面，本发明提供了一种用于预防靶细胞感染人类免疫缺陷病毒1型(“HIV-1”)的方法。所述方法包含将靶细胞暴露给预防感染量的至少一种附着抑制剂与至少一种融合抑制剂的协同组合。所述方法适用于为有患AIDS的高度危险或在暴露给HIV-1后已患有AIDS的患者预防或治疗AIDS。
本发明的所述附着抑制剂为多肽或其它化合物，所述化合物是结合到靶细胞上的CD4受体或结合到HIV-1上的gp120并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞，或允许HIV-1附着到所述靶细胞但是抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的化合物。一般来说，所述附着抑制剂为抗体、抗体片段、包含如gp120的CD4配体的片段的CD4拮抗体或包含CD4的片段的gp120拮抗体，如与人类IgG2的CD4融合蛋白质。所述附着抑制剂优选为结合到gp120并预防gp120附着到CD4或允许gp120附着到CD4但抑制或预防所述病毒与所述靶细胞发生融合的多克隆或单克隆抗体，和结合到CD4并预防gp120附着到CD4或允许gp120附着到CD4但抑制或预防所述病毒与所述靶细胞发生融合的多克隆或单克隆抗体。所述附着抑制剂更优选为结合到CD4并允许gp120附着但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞发生融合的单克隆抗体，包括(但不限于)美国专利第5,871,732号中所揭示的抗体。
本发明的融合抑制剂为多肽或其它化合物，所述化合物与gp41相互作用以抑制或预防其叉形结合到靶细胞，或抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用(recoil-like action)。所述融合抑制剂优选为与gp41相互作用以预防其发生将gp41结合到靶细胞的叉形作用或其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。所述融合抑制剂最优选为抗gp41抗体或具有30到50个氨基酸并具有与gp41相互作用以预防其发生叉形或反冲形作用的能力的较小多肽。在一个实施例中，所述融合抑制剂为选自由下列各物组成的群组的多肽已知为T-1249的39氨基酸多肽、已知为T-649的36氨基酸多肽、蛋白质5-Helix或其功能等效肽。所述融合抑制剂最优选为小分子肽(T-20)和其功能等效肽。
在一个实施例中，所述方法包含将靶细胞暴露给结合到CD4并抑制或预防gp120附着到CD4的抗CD-4抗体与小分子肽或其功能等效肽的协同组合。数种此等抗体是此项技术中已知的，或可通过此项技术中已知的技术制得，如美国专利第5,961,576号和第5,912,176号中所揭示的抗体。
在另一个实施例中，所述方法包含将靶细胞暴露给允许gp120结合到CD4受体但抑制靶细胞感染HIV-1的抗CD-4抗体与小分子肽或其功能等效肽的协同组合。数种此等抗体是此项技术中已知的，或可通过此项技术中已知的技术制得，如美国专利第5,871,732号中所揭示的抗体。
在另一个实施例中，所述方法包含将靶细胞暴露给结合到gp120并抑制或预防gp120附着到CD4的抗HIV-1 gp120抗体与小分子肽或其功能等效肽的协同组合。在此实施例中，所述附着抑制剂优选为结合到gp120上的CD4结合部位的单克隆抗体。数种此等抗体是此项技术中已知的，或可通过此项技术中已知的技术制得，如美国专利第6,309,880号和美国专利第6,241,986号中所揭示的抗体。
在另一个实施例中，所述方法包含将靶细胞暴露给允许gp120结合到CD4受体但抑制靶细胞感染HIV-1的抗HIV-1 gp120抗体与小分子肽或其功能等效肽的协同组合。所述抗HIV-1 gp120抗体可结合到gp120上的任何抗原决定部位，包括趋化因子共受体CCR5或CXCR4的结合部位。数种此等抗体是此项技术中已知的，或可通过此项技术中已知的技术制得，如美国专利第5,922,325号中所揭示的抗体。
在另一个实施例中，所述方法包含将靶细胞暴露给结合到所述趋化因子共受体CCR5或CXCR4并抑制或预防所述共受体附着到gp120的抗HIV-1共受体抗体与小分子肽或其功能等效肽的协同组合。数种此等抗体是此项技术中已知的，或可通过此项技术中已知的技术制得。
可使用此项技术中已知的蛋白质模建方法来设计和制造本发明的多肽。此项技术(例如，WO98/47089)中已描述了许多用于设计和/或模建蛋白质构象的计算算法。
所述附着抑制剂和融合抑制剂可与其它药物组合投药，所述其它药物如整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂，包括在HAART类治疗中。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含将靶细胞暴露给与至少一种其它药物组合的本发明的附着抑制剂和融合抑制剂，所述至少一种其它药物如整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。所述药物优选为至少一种整合酶抑制剂和/或至少一种转录酶抑制剂和/或至少一种蛋白酶抑制剂。所述方法适用于HAART系统。所述方法最优选包含将靶细胞暴露给至少一种抗CD4或抗gp120抗体和小分子肽和一种或一种以上整合酶、转录酶或蛋白酶抑制剂。所述抗gp120抗体优选为美国专利第6,309,880号所揭示的抗体。所述抗CD4抗体优选为美国专利第5,871,732号所揭示的抗体。
在另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(“AIDS”)的方法。所述方法包含将预防或治疗疾病量的至少一种附着抑制剂与至少一种融合抑制剂的协同组合投予有感染AIDS或患AIDS的危险的患者。
在另一方面，本发明提供了一种适用于预防靶细胞感染HIV-1并适用于预防或治疗AIDS的组合物，其包含至少一种附着抑制剂和至少一种融合抑制剂。所述组合物包含单独的抑制剂或其与医药上可接受的载剂的组合，所述载剂如各种赋形剂、辅剂、添加剂和稀释剂。所述组合物适用于预防或治疗AIDS。
可通过此项技术中已知的任何适当的方法(尤其是用于投药肽或多肽的方法)将本发明的所述附着抑制剂和融合抑制剂投予或共同投予给一个患者。所述方法包括(但不限于)注射、植入等等。优选是用注射，因为注射可精确控制投药用时间和剂量水平。所述抑制剂可经以下方式投药非经肠、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌肉内、皮下、关节内或鞘内。所述抑制剂优选是以非经肠方式投药。
所述附着抑制剂和融合抑制剂优选是大约同时投药，但是如果投药比较困难，那么所述抑制剂接连投药则比较有效。例如，可在合理的时间内将所述附着抑制剂通过静脉内注射投予患者并将所述融合抑制剂通过肌肉内注射而投予患者，一般为8小时内，优选为2小时内，且最优选为0.1-0.5小时内。很多此类投药方式对所属领域的技术人员是显而易见的。
本发明涵盖一单一的附着抑制剂和一单一的融合抑制剂的使用，一单一的附着抑制剂和两种或两种以上融合抑制剂的使用，两种或两种以上附着抑制剂和一单一的融合抑制剂的使用，和两种或两种以上附着抑制剂和两种或两种以上融合抑制剂的使用，所有这些使用均与多种其它药物向组合以组合疗法来治疗AIDS。
所述附着抑制剂和融合抑制剂可在所定义的周期以单剂量投药或以多剂量投药。例如，所述附着抑制剂可通过静脉内注射以单剂量投药，而所述融合抑制剂可在数天的周期内通过每日注射进行投药。很多所述投药方式对所属领域的技术人员将是显而易见的。
根据患者的年龄、体格和健康状况、投药方式、疾病的严重度以及所述剂量是用于治疗还是用于预防，所投的附着抑制剂和融合抑制剂的量和剂量可不同。一般而言，附着抑制剂以每千克体重约1到50毫克(mg/kg)、优选约5到30mg/kg的剂量向患者投药，且所述融合抑制剂通常以每千克体重约0.1到10毫克(mg/kg)、优选约0.5到5mg/kg的剂量向患者投药。所述附着抑制剂通常按周时刻表来投药，但可以按每日时刻表来投药。所述融合抑制剂通常每天投药，但可以每天投药数次。对于数日、数周或更长时间的重复投药而言，需根据病情重复治疗，直到达成所希望的对HIV-1病毒负荷和/或病症的遏制或达到所希望的对患者病情的改善。所述剂量可以一周一次到每六个月一次的时间间隔进行再投药。投药的最佳剂量和最佳途径和频率的确定在所属领域的技术人员的知识范围内。类似地，无需额外的试验即可确定本发明范围内的其它药物的剂量。
本发明的组合物包括医药上可接受的本来无毒性和非治疗用的载剂。所述载剂的实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，如人类血清白蛋白；缓冲物质，如磷酸盐；甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾；饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物；水；盐；或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚烯吡酮、纤维素基物质和聚乙二醇。可通过此项技术中已知的方法以剂型来制备和配制所述医药组合物。
在另一方面，由于所述附着抑制剂和融合抑制剂可分别或与其它药物一起投药，本发明提供了一种套组形式的制品，其在独立的容器中一单一封装中包含(1)附着抑制剂、(2)融合抑制剂及视情况(3)用于抑制或预防靶细胞感染HIV-1或用于预防或治疗AIDS的其它药物的两种或两种以上的组合。当向患者投药时，所述套组含有足以提供每千克体重约1到50毫克(mg/kg)、优选约5到30mg/kg的量剂，且的附着抑制所述融合抑制剂通常以每千克体重约0.1到10毫克(mg/kg)、优选约0.5到5mg/kg的剂量向患者投药。所述套组所包含的其它药物的量通过参考特定药物的批准或建议剂量而确定。所述套组通常含有一种附着抑制剂和一种融合抑制剂。所述套组优选含有抗CD4抗体、抗HIV-1 gp120抗体或抗HIV-1 gp41抗体和小分子肽。所述套组最优选含有抗CD4抗体和小分子肽。所述可选药物优选为整合酶、转录酶或蛋白酶抑制剂。
在另一方面，本发明提供了一种用于传递信息或说明的手段，所述信息或说明是关于协同使用附着抑制剂和融合抑制剂以预防靶细胞感染HIV-1并预防或治疗AIDS的信息或说明。所述传递手段包含一含有所述信息或说明的文档或视觉显示。所述传递优选为一显示于一视频监控器上的网址、小册子或含有所述信息或说明的包装插页。
有用信息包括所述抑制剂具有协同作用的事实、有关由组合使用所述抑制剂或与其它药物组合使用而导致的副作用(如果有的话)的细节、和如果患者遇到有关所述抑制剂或其用途的问题时供其使用的联系信息。有用说明包括抑制剂剂量、投药量和频率和投药途径。所述传递手段适用于向患者说明使用本发明的协同抑制剂的益处，和将所述抑制剂的经批准的投药方法传递给患者。
实例通过本发明优选实施例的以下实例可进一步说明本发明，但是应了解此等实例仅是为了说明的目的，且除非另外特定说明，该等实例并非意欲限制本发明的范围。
材料和方法病毒滴定6种病毒。每种病毒分离物的TCID50/ml如下HIV-1 302076(小儿)39810；HIV-1 302077(小儿)39810；HIV-1 302143(小儿)158489；HIV-1 2054(成人)19952；HIV-1 301714(成人)10000；NIH.HTLV-IIIB(实验)5011将病毒储备液稀释到2,000 TCID50/ml。
将512.2μl的HIV-1 302076添加到9487.8μl的R-3介质中。将512.2μl的HIV-1 302077添加到9487.8μl的R-3介质中。将126.3μl的HIV-1302143添加到9873.7μl的R-3介质中。将1002.4μl的HIV-1 301714添加到8997.6μl的R-3介质中。将2000μl的HIV-1 m2054添加到8000.0μl的R-3介质中。将4000μl的HTLV-IIIB添加到6000μl的R-3介质中。将病毒稀释为100TCID50病毒储备液将2.5ml的2000TCID50/ml添加到2.5ml的R-3介质中，这就是100TCID50(100μl)原料。PBMC通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法将外周血单核细胞(PBMC)从未感染HIV-1的供体中分离出来。使PBMC在补充有20％胎牛血清、5％IL-2和5μg/ml PHA(R-3介质)的RPMI 1640中生长。
5A8(对CD4的人源化单克隆抗体)在PH7.0、11.55mg/ml的无菌PBS中进行制备。将所述抗体储存在4-8℃的无菌条件下。HPLC分析显示所述抗体是等轴的且具有高于99％的纯度。稀释5A8储备溶液(500μg/ml)。
将60μl的5A8(11.55mg/ml)添加到1326μl的PBS，得到5A8储备溶液(500μg/ml)。将5A8储备溶液稀释到用于实验的浓度将192μl的5A8储备溶液添加到1008μl的PBS中，得到80μg/ml溶液(1∶6.25稀释度)。取200μl的5A8 80μg/ml并添加800μl的PBS(1∶31.25稀释度)。重复以上步骤得到1∶156.25、781.25、3906.25和19531.25稀释度。最后，用于实验的浓度为2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064μg/ml。
T-20所述制剂的纯度高于96.55％。将T-20存储于-20℃下并使其免受光照。稀释T-20到储备溶液将5mg T-20溶于5ml PBS中，得到T-20储备稀释液(1mg/ml)。
将T-20稀释到用于实验的浓度将48μl T-20储备溶液添加到1152μlPBS中，得到40μg/ml溶液(1∶25稀释度)。取200μl T-2040μg/ml并添加800μl PBS(1∶1.25稀释度)。重复以上步骤得到1∶625、1∶3125、1∶15625、1∶78125和390625的稀释度。最后，用于实验的浓度为1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032μg/ml。
实例1将药物暴露于感染下并维持12小时将病毒、细胞和试剂在37℃下隔夜培养，如下共18个试管用于6种5A8稀释液，3个试管用于病毒对照；共18个试管用于6种T-20稀释液，3个试管用于病毒对照；共18个试管用于6种5A8/T-20稀释液，3个试管用于病毒对照。
从最高浓度开始将50μl 5A8浓缩液和50μl T-20浓缩液添加到所述第一批18个试管中。将100μl PBS添加到最后三个试管中。从最高浓度开始将50μl T-20浓缩液和50μl PBS添加到所述第二批18个试管中。将100μl PBS添加到最后3个试管中。从最高浓度开始将50μl 5A8和50μlPBS添加到所述第三批18个试管中。将100μl PBS添加到最后3个试管中。将100μl的100 TCID50病毒储备液等分到所有63个试管中。将2×106PBMC添加到1.8ml的R-3介质中(每个试管共2.0ml)。将所述试管在37℃下隔夜培养。
以PBS洗涤所述细胞3次。在没有添加新的5A8或T-20的情况下使所述细胞再悬浮于24孔板中的2ml R-3介质中。在第4天和第7天，在每个共培养孔(coculture well)的上清液中进行HIV-1 P24抗原测量。在第4天添加R-3介质中的0.5ml细胞(106/ml)。使用“Chou剂量效应”来计算IC50和组合指数。结果显示于表1中。
表1IC50(μg/ml)和*CI(第4天)5A8 T-20 5A8/T-20*CI T-20/5A8*CI病毒株(IC50) (IC50)HIV-1 302076 0.15 0.043 0.032 0.33 0.0160.12HIV-1 302077 0.17 0.016 0.017 0.41 0.0081 0.20HIV-1 302143 0.97 0.14 0.13 0.21 0.0650.20HIV-1 2054 0.070 0.039 0.015 0.36 0.0077 0.14HIV-1 301714 0.70 0.20 0.11 0.28 0.0530.14HTLV-IIIB0.44 0.011 0.025 0.73 0.0120.38IC50(μg/ml)和*CI(第7天)病毒株 5A8 T-20 5A8/T-20*CI T-20/5A8*CIHIV-1 302076 0.65 0.29 0.15 0.33 0.0780.17HIV-1 302077 0.50 0.071 0.14 0.84 0.0710.42HIV-1 302143＞2.0 0.66 1.04 0.87 0.52 0.44HIV-1 2054 0.13 0.11 0.088 0.72 0.0440.36HIV-1 301714 1.82 0.050 0.043 0.31 0.0210.15HTLV-IIIB1.30 0.015 0.017 0.39 0.0087 0.20实例2连续药物暴露重复实例1，但是将T-20和5A8的浓度改变如下T-200.1、0.02、0.004、0.0008、0.00016、0.000032μg/ml；5A81.0、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032μg/ml。结果显示于表2中。
表2IC50(μg/ml)和*CI(第4天)病毒株 5A8 T-20 5A8/T-20*CI T-20/5A8*CIHIV-1 302076 0.10 0.0070 0.014 0.50 0.000530.11HIV-1 302077 0.14 0.0069 0.015 0.31 0.0016 0.031HIV-1 302143 0.038 0.044 0.00450.12 0.000450.012HIV-1 2054 0.041 0.019 0.025 0.67 0.0023 0.062HIV-1 302174 0.14 0.049 0.070 0.58 0.0070 0.058HTLV-IIIB0.19 0.017 0.00680.69 0.0068 0.069IC50(μg/ml)和*CI(第7天)病毒株 5A8 T-20 5A8/T-20*CI T-20/5A8*CIHIV-1 302076 0.028 0.0036 0.013 0.75 0.00130.075HIV-1 302077 0.067 0.0065 0.015 0.41 0.00150.041HIV-1 302143 0.022 0.021 0.00600.27 0.00600.27HIV-1 2054 0.017 0.16 0.00920.49 0.00160.049HIV-1 301714 0.30 0.040 0.097 0.51 0.00970.052HTLV-IIIB0.16 0.013 0.042 0.31 0.00430.031*CI组合指数CI＜0.9表示协同作用；0.9＜CI＜1.1表示添加剂相互作用；CI＞1.1表示拮抗作用。
参看表1和表2，所述数据显示了在所有研究的条件下5A8与T-20之间存在对抗活体外HIV-1复制的协同活性。在存在两种试剂的情况下，所有计算出的CI值均小于0.9且IC50的值被减少了1-10倍。一般而言，5A8增加了更多的T-20活性，而T-20增加较少的5A8活性。当将5A8和T-20的浓度保持7天时，相较于将感染性病毒添加到靶细胞12小时之后移除药物的情况，5A8和T-20的IC50减少了数倍。
在本说明书中，已揭示了本发明的典型优选实施例，尽管采用了特定的术语，但是其仅用于一般性和描述性的意义，而非用于限制本发明的目的，上述权利要求书中陈述了本发明的范围。显然，鉴于上述教示，本发明的很多修改和改变都是可能的。因此，应了解，在上述权利要求书范围内本发明的实施方法也可不同于本文所明确描述的实施方法。
权利要求
1.一种用于预防靶细胞感染人类免疫缺陷病毒1型(“HIV-1”)的方法，其包含将靶细胞暴露于预防感染量的至少一种附着抑制剂与至少一种融合抑制剂的协同组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由下列多肽组成的群组的多肽其结合到靶细胞上的CD4受体并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；其结合到靶细胞上的CD4受体并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽；其结合到HIV-1上的gp120并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；和其结合到HIV-1上的gp120并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组其与gp41相互作用以抑制或预防其叉形(harpoon-like)附着到靶细胞的多肽，和其与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形(recoil-like)作用的多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由下列各物组成的群组抗体、抗体片段、包含CD4配体的片段的CD4拮抗体和包含CD4的片段的gp120拮抗体，且所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由抗CD4抗体和抗gp120抗体组成的群组，且所述融合抑制剂是选自由T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地(pentafuside)和其功能等效肽组成的群组。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述附着抑制剂是允许gp120结合到所述CD4受体但抑制靶细胞感染HIV-1的抗CD4抗体，且所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含将靶细胞暴露于组合了至少一种其它药物的所述附着抑制剂和融合抑制剂，所述至少一种其它药物是选自由下列各物组成的群组整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述附着抑制剂为一抗HIV-1共受体抗体，其结合到一选自由CCR5和CXCR4组成的群组的趋化因子共受体，并抑制或预防所述共受体附着到gp120，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组其与gp41相互作用以抑制或预防其叉形附着到靶细胞的多肽和其与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由下列各物组成的群组T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地和其功能等效肽。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
11.根据权利要求7所述的方法，其进一步包含将靶细胞暴露于组合了至少一种其它药物的所述附着抑制剂和融合抑制剂，所述至少一种其它药物是选自由下列各物组成的群组整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
12.一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(“AIDS”)的方法，其包含向有感染AIDS或患有AIDS的危险的患者投予预防或治疗疾病用量的至少一种附着抑制剂与至少一种融合抑制剂的协同组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由下列多肽组成的群组的多肽其结合到靶细胞上的CD4受体并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；其结合到靶细胞上的CD4受体并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽；其结合到HIV-1上的gp120并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；和其结合到HIV-1上的gp120并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组其与gp41相互作用以抑制或预防其叉形附着到靶细胞的多肽，和其与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由下列各物组成的群组抗体、抗体片段、包含CD4配体的片段的CD4拮抗体和包含CD4的片段的gp120拮抗体，且所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述附着抑制剂是选自由抗CD4抗体和抗gp120抗体组成的群组，且所述融合抑制剂是选自由下列各物组成的群组T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地和其功能等效肽。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述附着抑制剂是允许gp120结合到所述CD4受体但抑制靶细胞感染HIV-1的抗CD4抗体，且所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
17.根据权利要求12所述的方法，其进一步包含将靶细胞暴露给组合了至少一种其它药物的所述附着抑制剂和融合抑制剂，所述至少一种其它药物是选自由下列各物组成的群组整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述附着抑制剂为抗HIV-1共受体抗体，其结合到选自由CCR5和CXCR4组成的群组的趋化因子共受体，并抑制或预防所述共受体附着到gp120，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组与gp41相互作用以抑制或预防其叉形附着到靶细胞的多肽和与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由下列各物组成的群组T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地和其功能等效肽。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
22.根据权利要求18所述的方法，其进一步包含将靶细胞暴露于组合了至少一种其它药物的所述附着抑制剂和融合抑制剂，所述至少一种其它药物是选自由下列各物组成的群组整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
23.根据权利要求12所述的方法，其中以每千克体重约1到50毫克的量向患者投予所述附着抑制剂，且以每千克体重0.1到10毫克的量向患者投予所述融合抑制剂。
24.一种用于预防靶细胞感染HIV-1且用于预防或治疗AIDS的组合物，其包含至少一种附着抑制剂和至少一种融合抑制剂。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述附着抑制剂是选自由下列多肽组成的群组的多肽其结合到靶细胞上的CD4受体并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；其结合到靶细胞上的CD4受体并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽；其结合到HIV-1上的gp120并抑制或预防HIV-1附着到所述靶细胞的多肽；和其结合到HIV-1上的gp120并允许HIV-1附着到所述靶细胞但抑制或预防HIV-1与所述靶细胞之间发生细胞融合的多肽，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组其与gp41相互作用以抑制或预防其叉形附着到靶细胞的多肽，和其与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述附着抑制剂是选自由下列各物组成的群组抗体、抗体片段、包含CD4配体的片段的CD4拮抗体和包含CD4的片段的gp120拮抗体，且所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述附着抑制剂是选自由抗CD4抗体和抗gp120抗体组成的群组，且所述融合抑制剂是选自由T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述附着抑制剂是允许gp120结合到所述CD4受体但抑制靶细胞感染HIV-1的抗CD4抗体，且所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
29.根据权利要求24所述的组合物，其进一步包含选自由下列各物组成的群组的至少一种其它药物整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
30.根据权利要求24所述的组合物，其中所述附着抑制剂为抗HIV-1共受体抗体，所述抗体结合到选自由CCR5和CXCR4组成的群组的趋化因子共受体，并抑制或预防所述共受体附着到gp120，且所述融合抑制剂是选自由下列多肽组成的群组其与gp41相互作用以抑制或预防其叉形附着到靶细胞的多肽和其与gp41相互作用以抑制或预防其发生使HIV-1与靶细胞紧密接触的反冲形作用的多肽。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述融合抑制剂是选自由抗gp41抗体和多肽组成的群组，所述多肽具有30到50个氨基酸且具有与gp41相互作用以预防其叉形或反冲形作用的能力。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述融合抑制剂是选自由下列各物组成的群组T-1249、T-649、5-Helix、潘它夫西地和其功能等效肽。
33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
34.根据权利要求30所述的组合物，其进一步包含选自由下列各物组成的群组的至少一种其它药物整合酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。
35.一种套组形式的制品，其在分离的容器中单一封装内由附着抑制剂和融合抑制剂的两种或两种以上的组合。
36.根据权利要求35所述的制品，其进一步包含适用于抑制或预防靶细胞的HIV-1感染或适用于预防或治疗AIDS的另一药物。
37.根据权利要求36所述的制品，其中所述药物是选自由整合酶、转录酶或蛋白酶抑制剂组成的群组。
38.根据权利要求35所述的制品，其中所述附着抑制剂是选自由抗CD4抗体和抗gp120抗体组成的群组，且所述融合抑制剂是选自由潘它夫西地和其功能等效肽组成的群组。
39.一种用于传递信息或说明的手段，所述信息或说明是关于协同使用附着抑制剂和融合抑制剂以预防靶细胞感染HIV-1并预防或治疗AIDS的信息或说明，其包含一含有所述信息或说明的文档或视觉显示。
40.根据权利要求39所述的手段，其是选自由显示于一视频监控器上的网址、小册子和/或包装插页组成的群组。
全文摘要
一种用于预防辅助性T细胞和其它靶细胞感染人类免疫缺陷病毒1型(“HIV－1”)和用于通过将靶细胞暴露于至少一种附着抑制剂与至少一种融合抑制剂的协同组合来预防和治疗获得性免疫缺陷综合症(“AIDS”)的方法。所述附着抑制剂为结合到靶细胞上的CD4受体或结合到HIV－1上的gp120的化合物，例如抗体；且所述融合抑制剂为与gp41相互作用以抑制或预防其与靶细胞相互作用的化合物，例如，潘它夫西地(pentafuside)。
文档编号C12Q1/70GK1685064SQ03822621
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月26日 优先权日2002年9月27日
发明者丰锡中 申请人:唐纳士公司