专利名称：一种双歧杆菌冻干粉的制备方法及其产品和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌冻干粉及其制备方法，还涉及该双歧杆菌冻干粉作为食品或饮料添加剂的用途。
背景技术：
双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道内重要的生理性细菌，它的存在有利于提高人和动物消化道的健康状况。现代众多研究表明消化道微生物在人体健康和疾病方面起着重要作用，例如营养、生理功能、药物功效、癌症、免疫反应、老化等均与消化道菌群密切相关。双歧杆菌在代谢过程中产生有机酸，有抑制肠道腐生细菌生长的作用，从而起到调节肠道菌群，防治腹泻，改善维生素代谢，提高免疫机能等作用，对人体健康有多项有益功效。
此外，利用双歧杆菌作为一种免疫调节剂，通过提高宿主的免疫力还可以开展对系列性疑难病症如类风湿、强直性脊髓炎乃至癌症等的防治。大连医科大学康白等人的研究报道也验证了双歧杆菌可通过调节机体的免疫系统发挥抗肿瘤的作用。
近代世界各国都开始研究如何将活性双歧杆菌作为食品添加剂，用人工方法将这类活菌制成食品的问题。而达到提高人体免疫机能，改善维生素代谢的目的，增强人体健康作用的关键是要确保有足够数量的活性双歧杆菌，但是由于双歧杆菌生长条件苛刻，其适宜生长温度为35～40℃，pH值为6.5～7.0，且专性厌氧。因此缺少一种适合于工业化食品生产的可以确保高活菌量的双歧杆菌冻干粉及其生产方法。
发明内容所要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种活性双歧杆菌冻干粉的制备方法，用于克服上述现有技术缺点。本发明另一目的是提供一种用上述方法制备的双歧杆菌冻干粉，本发明的再一目的是提供上述双歧杆菌冻干粉作为为食品或饮料添加剂的用途。
技术方案本发明的目的是这样实现的本发明双歧杆菌冻干粉的制备方法包括如下步骤(1)菌种活化选用具有改善肠道菌群和提高免疫力的双歧杆菌，例如可以是婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)中的一种或多种的混合物。优选采用婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，更优选为例如菌株编号为BI 002，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0997，保藏日期为2003年9月1日的婴儿双歧杆菌(Bifidobactefium infantis)，或优选为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，更优选为例如菌株编号为BL 003，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0998，保藏日期为2003年9月1日的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
将低温保存的菌种在室温下放置例如12-36小时，优选24小时，之后在无菌室无菌取少量例如0.2mL液体培养基1加入玻管内，取菌物接种于液体培养基1和琼脂平板上，35-37℃条件下厌氧培养48～72小时，再连续活化三代，以提高菌株活力，作为母培养物。
其中所用的培养基1为TPY培养基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐温-80 1g、肝浸液200mL、混合盐溶液10mL、西红柿汁100mL和L-半胱氨酸盐酸0.5g，再加蒸馏水675mL在pH为7.2，温度为例如115℃的条件下灭菌例如20分钟后加入混合维生素制得，其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g和FeCl30.5g加蒸馏水100mL制得，混合维生素是由维生素B1100mg，维生素B2100mg，维生素B6100mg，泛酸钠10mg和生物素1mg加蒸馏水100mL滤过灭菌制得。
(2)一级培养物的制备将母培养物接入培养基1(采用与上述步骤中相同的培养基1)，接菌量为2～3％，在35～37℃条件下厌氧培养10-16个小时，作为一级培养物。
(3)二级培养物的制备将一级培养物接入培养基2，接菌量为2～3％，在35～37℃条件下厌氧培养10-14个小时，作为二级培养物。
其中所用的培养基2是由大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸盐酸0.5g、低聚糖5～7g、吐温-80 1.0g、混合盐溶液5mL、肝浸液或胡萝卜汁150mL和水845mL在pH为7.2，温度为115℃的条件下灭菌20分钟制得，其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸馏水100mL组成。
当选用菌种为婴儿双歧杆菌时，上述培养基2组分中优选用肝浸液；当选用菌种为长双歧杆菌时，上述培养基2组分中优选用胡萝卜汁。
(4)增菌培养将二级培养物接入培养基2(采用与上述步骤中相同的培养基2)，接菌量为2～3％，在温度为35～37℃，Ph值在7.0～7.2，搅拌条件下，例如搅拌速度在300-500rpm，发酵8～12小时后得到双歧杆菌发酵液。
(5)离心分离在4℃条件下将上述双歧杆菌发酵液离心15～20分钟，例如采用离心转速6000～8000rpm，取下层沉淀备用。
(6)添加冻干保护剂冻干将沉淀与冻干保护剂充分混合后，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃，冻干时间为7～10小时的条件下冻干即可获得双歧杆菌冻干粉，其中冻干保护剂的用量为发酵液体积的1/4～1/2，优选采用1/3。
所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟。
本发明双歧杆菌冻干粉是采用上述方法制备的。
采用上述方法制得的双歧杆菌冻干粉，其中每克双歧杆菌冻干粉中含双歧杆菌活菌数大于1010cfu，水分含量小于5％。
本发明产品可单独食用，也可以作为食品添加剂应用于食品或饮料的生产中。例如可以与豆粉、米粉、奶粉、花粉、药粉等可食用品粉末按比例直接混合作为保健食品。或者与蔬菜汁或果汁等液体饮料按比例混合，并根据需要添加适量甜味剂等添加剂，搅拌均匀后灌装做成含活性双歧杆菌的饮料。
有益效果本发明双歧杆菌冻干粉每克含双歧杆菌活菌数大于1010cfu，水分含量小于5％，此外还具有生产工艺简单，营养价值高，用途广泛等优点，可单独食用，也可作为食品添加剂，具有良好的市场前景和经济效益。
图1为本发明双歧杆菌冻干粉的制备工艺过程图。
具体实施例实施例1婴儿双歧杆菌冻干粉的制备a)菌种活化将低温保存的婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis，菌种编号为BI 002，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0997，保藏日期为2003年9月1日)在室温下放置24小时，在无菌室将菌种安瓶管用70％酒精棉擦拭表面消毒，然后用酒精灯将其上部烤热，滴加冷的灭菌蒸馏水，使玻管开裂，用镊子敲掉上部，无菌取0.2mL液体培养基(1)加入玻管内，用灭菌铂金耳插入玻管取菌物接种于液体培养基(1)和琼脂平板上，35-37℃条件下厌氧培养60小时，再连续活化三代，以提高菌株活力，作为母培养物。
其中所用的培养基(1)为TPY培养基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐温-80 1g、肝浸液200mL、混合盐溶液10mL、西红柿汁100mL和L-半胱氨酸盐酸0.5g，再加蒸馏水675mL在pH为7.2，温度为115℃的条件下灭菌20分钟后加入混合维生素制得，其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g和FeCl30.5g加蒸馏水100mL制得，混合维生素是由维生素B1100mg，维生素B2100mg，维生素B6100mg，泛酸钠10mg和生物素1mg加蒸馏水100mL滤过灭菌制得。
b)一级培养物的制备将母培养物接入培养基(1)(采用与上述步骤中相同的培养基(1))，接菌量为2.5％，在35～37℃条件下厌氧培养14个小时，作为一级培养物。
c)二级培养物的制备将一级培养物接入培养基(2)，接菌量为2.5％，在35～37℃条件下厌氧培养12个小时，作为二级培养物。
其中所用的培养基(2)是由大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸盐酸0.5g、低聚糖5～7g、吐温-801.0g、混合盐溶液5mL、肝浸液150mL和水845mL在pH为7.2，温度为115℃的条件下灭菌20分钟制得，其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸馏水100mL组成。
d)增菌培养将二级培养物接入培养基(2)(采用与上述步骤中相同的培养基(2))，接菌量为2.5％，在温度为35～37℃，Ph值在7.1，搅拌速度在400rpm的条件下发酵10小时后得到双歧杆菌发酵液；e)离心分离在4℃，离心转速7000rpm的条件下将上述双歧杆菌发酵液离心18分钟，取下层沉淀备用；f)添加冻干保护剂冻干将沉淀与冻干保护剂充分混合后，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃，冻干时间为9小时的条件下冻干即可获得婴儿双歧杆菌冻干粉，其中冻干保护剂的用量为发酵液体积的1/3。所述的冻干保护剂是由脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。其中胱氨酸、维生素C采用过滤除菌，其他成分采用在105℃灭菌30分钟，得婴儿双歧杆菌冻干粉。
实施例2双歧杆菌冻干粉的制备类似于实施例1，选用菌株编号为BL 003，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0998，保藏日期为2003年9月1日的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)作为活性双歧杆菌；培养基2组分中采用胡萝卜汁替代肝浸液，制备出长双歧杆菌冻干粉。
实施例3含本发明双歧杆菌冻干粉的食品将实施例1制备的双歧杆菌冻干粉，与奶粉按重量1∶5000的比例混合均匀，称量后分装做成含活性双歧杆菌的奶粉，奶粉的包装形式可以是袋装、盒装或罐装。
实施例3含本发明双歧杆菌冻干粉的饮料将实施例1制备的双歧杆菌冻干粉，与蔬菜汁按1∶6000比例混合，添加适量甜味剂，搅拌均匀后灌装做成含活性双歧杆菌的蔬菜汁。
试验例1本发明双歧杆菌冻干粉活菌计数试验活菌计数试验样品1g按照实施例1制备的双歧杆菌冻干粉。
活菌计数试验方法将上述样品用稀释液进行10倍梯度递减稀释，取适宜稀释液倾倒BS平板，37℃厌氧培养36小时后计数活菌数，在换算为原始菌数。
其中稀释液由Na2HPO46g、KH2PO44.5g、L-半胱氨酸盐酸0.5g、琼脂1g、吐温-80 0.5g，加蒸馏水至1000mL，在115℃下灭菌20分钟制得；BS培养基由西红柿汁200mL、蛋白胨7g、酵母粉6g、胰酶水解酪蛋白5g、植物蛋白胨3g、多胨3g、葡萄糖10g、可溶性淀粉0.5g、吐温80 1g、溶液A 10mL、溶液B 5mL、琼脂20g组成。BS培养基用到的溶液A由KH2PO425g、K2HPO425g、水250g组成；溶液B由MgSO4·7H2O10g、FeSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、MnSO40.337g水250g组成；BS添加液由丙酸钠30g加入灭菌烧瓶中，加灭菌蒸馏水80mL，待溶解后加硫酸新霉素400毫克，巴龙霉素100毫克，LiCl6g，再加灭菌蒸馏水至100mL制得。
活菌计数试验结果样品含双歧杆菌活菌数大于1010cfu。
虽然，上文中已经用一般性说明及技术实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基本上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于它包括如下步骤(1)菌种活化选用具有改善肠道菌群和提高免疫力的冻干菌种，将低温保存的菌种在室温下放置12-36小时，在无菌室无菌取液体培养基1加入玻管内，取菌物接种于液体培养基1和琼脂平板上，35-37℃条件下厌氧培养48～72小时，再连续活化三代，作为母培养物；(2)一级培养物的制备将母培养物接入培养基1，接菌量为2～3％，在35～37℃条件下厌氧培养10-16个小时，作为一级培养物；(3)二级培养物的制备将一级培养物接入培养基2，接菌量为2～3％，在35～37℃条件下厌氧培养10-14个小时，作为二级培养物；(4)增菌培养将二级培养物接入培养基2，接菌量为2～3％，在温度为35～37℃，Ph值在7.0～7.2，在搅拌条件下发酵8～12小时后得到双歧杆菌发酵液；(5)离心分离在4℃条件下将上述双歧杆菌发酵液离心15～20分钟，取下层沉淀备用；(6)添加冻干保护剂冻干将沉淀与冻干保护剂充分混合后，在真空度6Pa，冷冻温度-40℃，冻干时间为7～10小时的条件下冻干即可获得双歧杆菌冻干粉，其中冻干保护剂的用量为发酵液体积的1/4～1/2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的双歧杆菌是婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium ado1escentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)冻干粉的一种或多种的混合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)的双歧杆菌是婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)或长双歧杆菌(Bifidobacterium Longum)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(1)中的双歧杆菌是保藏号为CGMCC No.0997的婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)或保藏号为CGMCC No.0998的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。
5.根据权利要求1-4之任一所述的制备方法，其特征在于所述的培养基1为TPY培养基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐温-801g、肝浸液200mL、混合盐溶液10mL、西红柿汁100mL、L-半胱氨酸盐酸0.5g、蒸馏水675mL和混合维生素10mL组成；其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸馏水100mL组成；其中，混合维生素是由维生素B1100mg，维生素B2100mg，维生素B6100mg，泛酸钠10mg、生物素1mg和蒸馏水100mL组成。
6.根据权利要求1-5之任一所述的制备方法，其特征在于所述的培养基2是由灭菌后的大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸盐酸0.5g、低聚糖5～7g、吐温-801.0g、混合盐溶液5mL、肝浸液或胡萝卜汁150mL、水845mL组成；其中混合盐溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸馏水100mL组成。
7.根据权利要求1-6之任一所述的制备方法，其特征在于所述的冻干保护剂是由灭菌后的脱脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、维生素C3g、水1000g组成。
8.一种双歧杆菌冻干粉，其特征在于它是采用权利要求1-7之任一的方法制备的。
9.根据权利要求8所述的双歧杆菌冻干粉作为食品或饮料添加剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述的食品为奶粉。
全文摘要
本发明涉及一种活性双歧杆菌冻干粉的制备方法及其产品，还涉该方法制备的双歧杆菌冻干粉在食品或饮料加工领域中的用途。本发明采用选育出的具有改善肠道菌群和提高免疫力的菌株，然后采用高密度培养、离心和冻干等方法生产出冻干菌粉，可将其作为食品添加剂，用于食品加工领域。双歧杆菌冻干粉含双歧杆菌活菌数大于10
文档编号A23L1/30GK1603402SQ20031010323
公开日2005年4月6日 申请日期2003年11月3日 优先权日2003年11月3日
发明者霍贵成, 孟祥晨, 杨丽杰 申请人:东北农业大学