专利名称：一种木聚糖酶及其生产方法与专用生产菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种木聚糖酶，它的生产方法及其专用生产菌株。
背景技术：
木聚糖酶系主要包括两种酶，一种是β-1，4-木聚糖酶，另一种是β-木糖苷酶，二者共同作用可将自然界中的木聚糖降解成单糖，在造纸、饲料、食品工业中具有重要作用。产生木聚糖酶的微生物有很多种包括丝状真菌、细菌、放线菌等。根据国内外研究报道，产生木聚糖酶的细菌主要有Bacillus subtilis、Clostridium sp.、Pseudomonas fluorescens等；产生木聚糖酶的放线菌主要有Streptomyces lividans、Streotomyces thermoviolaceus等；产木聚糖酶的丝状真菌主要有Aspergillusniger、Aspergillus nidulans、Aspergillus phoenicis、Trichoderma reesei、Trichoderma koningii等。国内的研究主要集中在丝状真菌。
微生物产生的木聚糖酶理化性质和分子量各不相同。分子量从9500到72000道尔顿，绝大多数为20000-30000道尔顿，等电点从3.6-10.3都有分布。催化反应的最适温度一般在50℃左右。最适pH根据微生物来源的不同而有差异，多数在pH4.0-6.0。
不同微生物产木聚糖酶的能力差异很大。以分批液体发酵(不补充养分)中每毫升培养液所产生的木聚糖酶酶活作比较。国外文献报道中，Samain E等人报道的Bacillus sp.XE产木聚糖酶最高活力为380IU/ml(1997年)；Dhillon A等人报道的Bacillus circulans AB 16最高产酶活力为55IU/ml(2000年)；Kohli U等人报道的Thermoactinomyces thalophilus subgroup C.的最高酶活为42IU/ml(1997年)；Antonopoulos VT等报道的StreptomycesalbusATCC 3005的最高酶活为11.97IU/ml(2001年)；Costa-Ferreira M等人报道的Aspergillus niger CCMI 850的最高产酶活力为65IU/ml(1994年)；de Souza CG报道的Aspergillus flavus的最高产酶活力为190IU/ml(1999年)。国内的研究报道中，曲音波等人报道的Bacilluspumilus A30产木聚糖酶最高活力为431IU/ml(1999年)；陈红歌等人报道的Aspergillus niger E149的最高酶活力为375.2IU/ml(1998年)；蔡敬民等人报道的Aspergillus nigerA3的最高酶活力为340IU/ml(1996年)；丁少军等人报道的Pseudomonas fluorescens O1的最高酶活力为164IU/ml(1998年)；杨革等人报道的Pseudomonas pseudoflava SQ153最高酶活为400IU/ml(2000年)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种能够产生具有较强酶活力的木聚糖酶的菌株。
一种生产木聚糖酶的巴氏毕赤酵母，是基因组中包含有与序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏毕赤酵母。其中优选的是基因组中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏毕赤酵母。
巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722是基因组中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏毕赤酵母，已于2002年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 0836。
巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722由以下步骤获得(1)从黒曲霉(Aspergillus.niger)149菌株(陈红歌，朱静，梁改琴，严自正，张树政，1999，酸性木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件。微生物学报，39(4)89-93；陈红歌，朱静，梁改琴，严自正，贾新成，张树政，2000，黑曲霉木聚糖酶的纯化与性质，菌物系统19(1)111-116)中获得xylanase B基因的cDNA序列；(2)将该cDNA序列连接到巴氏毕赤酵母pPIC9K的表达载体，构建成重组表达载体pPICH6(其物理图谱如图4所示)；(3)将重组表达载体pPICH6转化巴氏毕赤酵母GS115受体菌，获得重组PGX722菌株。
该菌株具有以下特点(1)巴氏毕赤酵母PGX722，基因工程酵母，菌体呈球状，菌落光滑，呈乳白色。生长温度为28℃-30℃，代谢表型为Muts。
(2)此菌株的基因组中有序列表中的特征性序列。
本发明的另一个目的是提供一种新的酶活性较强的木聚糖酶及其生产方法。
本发明所提供的木聚糖酶，是发酵巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№ 0836得到的。
本发明的木聚糖酶分子量为21KD，最适pH为5.0(如图1所示)，最适温度为50℃(如图2所示)，在pH值4.0-7.0的范围内保持较高的活性(如图3所示)，在50℃保温12小时，酶活能够保持。
一种生产木聚糖酶的方法，是发酵巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№ 0836，并自其发酵液中获得木聚糖酶。
所述发酵培养的培养基为BMGY和BMMY培养基，其中BMGY培养基为菌体生长培养基，含有1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，1％甘油，4×10-5生物素，pH6.0；BMMY培养基为诱导产酶培养基，含有1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，pH6.0。
用本发明方法得到的木聚糖酶活性在700-1200IU。酶活性的测定方法是取0.1ml稀释的酶液，加入到0.1ml用0.2mol/L pH4.8磷酸缓冲液配制的1％木聚糖溶液中，50℃反应10分钟，DNS测定还原糖(以木糖为标准)。在上述条件下，每分钟产生的还原糖相当于1μmol木糖的所需酶量定义为1个酶活力单位(IU)。
本发明所提供的由巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722产生的木聚糖酶为重组木聚糖酶，具有较高的酶活力，用重组木聚糖酶水解木聚糖，木聚糖的水解率达95％以上，水解产物以木二糖、木三糖、木四糖为主，占90％以上。
本发明的重组木聚糖酶在造纸、食品、饲料工业等方面具有重要的应用价值，在纸浆漂白过程中，通过使用该重组木聚糖酶可降低纸浆漂白过程中40％-50％的用氯率。
图1为重组木聚糖酶的最适pH曲线图2为重组木聚糖酶的最适温度曲线图3为重组木聚糖酶的pH稳定性曲线图4为重组表达载体pPICH6的物理图谱具体实施方式
实施例1、发酵巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722获得木聚糖酶1、配制发酵培养基BMGY和BMMY；2、取配制的BMGY培养基25毫升置于250毫升的三角瓶中，并从YPD培养基上取本发明巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC №0836用菌环接种于三角瓶中；3、在转速为220r/min的旋转式摇床上，30℃条件下培养48小时；4、离心收集菌体，将菌体转入25毫升BMMY培养基中，30℃条件下培养72小时；5、收集发酵液并离心得到酶液。
实施例2、本发明木聚糖酶用于麦草浆的漂白1、酶处理条件浆浓5％；温度50℃；处理时间60分钟；pH值中性；酶用量20IU/g。
2、次氯酸漂白条件浆浓6％；温度40℃；漂白时间2小时；漂液为次氯酸钠，浓度为26-25g/L；用氯量为5％-3.5％。
3、纸浆经酶处理及次氯酸盐漂白结果如表1所示，其中X-0未经酶处理、只用次氯酸漂白的纸浆；X-1经酶处理、未用次氯酸漂白的纸浆；X-2、X-3经酶处理、在漂白机里用次氯酸钠漂白的纸浆；X-2、X-0漂白条件完全相同。
表1经不同处理后漂白纸浆的结果
从表1的结果可以看出未漂浆经酶处理，可改善麦草浆的次氯酸盐漂白性能，当漂白用氯量为5％时，漂白原浆经酶处理比未经酶处理漂后纸浆白度提高5.6个百分点，即从65.6％提高到71.2％。当漂到白度为65.6％左右时，原浆漂白用氯为5％，经酶处理的纸浆比对照可节省用氯30％。
序列表<160>1<210>1<211>1019<212>DNA<213>巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)<400>1acagcaatat ataaacagaa ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt 60attagcttac tttcataatt gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact120tttaacgaca acttgagaag atcaaaaaac aactaattat tcgaaggatc caaacgatga180gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta gctgctccag240tcaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc atcggttact300cagatttaga aggggatttc gatgttgctg ttttgccatt ttccaacagc acaaataacg360ggttattgtt tataaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa ggggtatctc420tcgagaaaag agaggctgaa gcttacgtag aattctcgac cccgagctcg accggcgaga480acaacggctt ctactactcc ttctggaccg acggcggtgg agacgtgacc tacaccaacg540gagatgctgg tgcctacact gttgagtggt ccaacgtggg caactttgtc ggtggaaagg600gctggaaccc cggaagtgcg caggacatca cctacagcgg caccttcacc cctagcggca660acggctacct ctccgtctat ggctggacca ctgaccctct gatcgagtac tacatcgtcg720agtcttacgg cgactacaac cccggcagtg gaggcacgta caagggcacc gtcacctcgg780acggatccgt ttacgatatc tacacggcta cccgtaccaa tgctgcttcc attcagggaa840ccgctacctt cactcagtac tggtccgttc gccagaacaa gagagttggc ggaaccgtta900ccacctccaa ccacttcaat gcttgggcta agctgggaat gaacctgggt actcacaact960accagatcgt ggctaccgag ggttaccaga gcagtggatc ttcgtccatc actgttcag1019
权利要求
1.一种生产木聚糖酶的巴氏毕赤酵母，是基因组中包含有与序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述的巴氏毕赤酵母，其特征在于所述巴氏毕赤酵母的基因组中包含有序列表中序列1的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的巴氏毕赤酵母，其特征在于所述巴氏毕赤酵母为巴氏毕赤酵母PGX722 CGMCC №0836。
4.权利要求3所述的巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC No PGX722的制备，包括以下步骤(1)从黑曲霉(Aspergillus.niger)149菌株中获得xylanase B基因的cDNA序列；(2)将该cDNA序列连接到巴氏毕赤酵母pPIC9K的表达载体，构建成重组表达载体pPICH6；(3)将重组表达载体pPICH6转化巴氏毕赤酵母GS115受体菌，获得重组PGX722菌株。
5.一种重组木聚糖酶，是发酵巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№0836得到的。
6.巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC №0836在生产木聚糖酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种木聚糖酶及其生产方法与专用生产菌株，本发明提供的生产木聚糖酶的巴氏毕赤酵母，是基因组中包含有与序列表中序列1的DNA序列至少90％同源性或相同性的DNA序列的巴氏毕赤酵母。巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722是基因组中包含有序列表中序列1的DNA序列的巴氏毕赤酵母，已于2002年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 0836。本发明所提供的由巴氏毕赤酵母(Pichia Pastoris)PGX722 CGMCC№0836产生的木聚糖酶具有高的酶活力，在造纸、食品及饲料工业中将得到广泛应用。
文档编号C12N15/31GK1614015SQ20031010324
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月3日 优先权日2003年11月3日
发明者董志扬, 毛爱军, 祝令香 申请人:中国科学院微生物研究所