专利名称：用于重组生产抗融合肽的方法
技术领域：
本发明涉及用于重组生产抑制病毒与靶细胞膜融合的肽的方法。特别地，本发明涉及重组生产慢病毒属如人免疫缺陷病毒(HIV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(MEV)，流感病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)或人副流感病毒(HPV)的肽抑制剂的方法。
背景技术：
对于有包膜病毒如HIV-I，HIV-II，RSV，麻疹病毒，流感病毒，副流感病毒，埃-巴二氏病毒和肝炎病毒进入到细胞，病毒与细胞膜的融合是一个必需步骤。在已进入细胞后可以引发导致病毒感染的病毒复制级联。
HIV是慢病毒属的一种，所述慢病毒属包括拥有复杂基因组和显示圆锥状衣壳核心颗粒的逆转录病毒。慢病毒属的其它实例包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，脑膜脑炎病毒和马传染性贫血病毒(EIAV)。类似所有逆转录病毒，HIV的基因组是由RNA编码，其在进入新宿主细胞后由病毒逆转录酶(RT)逆转录为病毒DNA。Bullough，P.A.，等，Nature371(1994)37-43；Carr，C.M.，和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；和Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373描述了流感病毒和它们的细胞进入机制。
所有慢病毒属是由源于宿主细胞膜的脂双层包裹。通过与跨膜蛋白质(TM，gp41)的相互作用将曝露的表面糖蛋白(SU，gp120)锚定给病毒。脂双层还含有几种源于宿主细胞的细胞膜蛋白，包括主要组织相容性抗原，肌动蛋白和遍在蛋白质(Arthur，L.O.，等，Science 258(1992)1935-1938)。一种含有大约2000个拷贝基质蛋白(MA，p17)的基质壳排列在病毒膜的内表面，并且一种含有大约2000个拷贝衣壳蛋白(CA，p24)的圆锥状衣壳核心颗粒位于病毒的中心。衣壳颗粒包裹两个拷贝未剪接的病毒基因组，其被稳定成一种具有大约2000个拷贝核衣壳蛋白(NC，p7)的核糖核蛋白复合体，并且还含有三种基本的病毒编码的酶蛋白酶(PR)，逆转录酶(RT)和整合酶(IN)。病毒颗粒还包装辅助蛋白，Nef，Vif和Vpr。似乎不包装在宿主细胞内发挥作用的另外三种辅助蛋白，Rev，Tat和Vpu。
在HIV的情形中，病毒进入是与HIV包膜表面糖蛋白相关(Lawless，M.K.，等，Biochemistry 35(1996)13697-13708；和Turner，B.G.，和Summers，M.F.，J.Mol.Biol.285(1999)1-32)。在HIV-1的情形中，该表面蛋白是作为一种单个的160kD的前体蛋白被合成，所述前体蛋白被一种细胞蛋白酶切割成两种糖蛋白gp-41和gp-120。gp-41是一种跨膜蛋白质，gp-120是一种保持与gp-41以三聚体或多聚体形式的非共价结合的胞外蛋白(Hammarskjld，M.-L.，等，Biochim.Biophys.Acta 989(1989)269-280)。由于CD4表面蛋白充当HIV-I病毒的细胞受体，因此HIV靶向CD4+淋巴细胞。病毒进入细胞取决于与细胞CD4+受体分子结合的gp-120而gp-41将包膜糖蛋白复合体锚定在病毒膜中并介导膜融合(McDougal，J.S.，等，Science 231(1986)382-385；和Maddon，P.J.，等，Cell 47(1986)333-348)。
gp41是介导病毒和细胞膜融合的跨膜亚单位。gp41胞外域核心是一个由三个螺旋状发夹结构组成的六螺旋束，每个发夹结构由与反向平行的C螺旋成对的N螺旋组成(Chan，D.C.，等，Cell 89(1997)263-273；Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430；Tan，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)12303-12308)。该N螺旋形成一个具有三个保守疏水沟的内部三聚体卷曲螺旋；一个C螺旋填充于这些沟的每一个之中。该结构可能相当于gp41融合-活性状态的核心。依照Chan，D.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617，有证据表明在1类HIVgp41的卷曲螺旋中的显著的空腔是有吸引力的药物目标。
据假设gp-41介导膜融合的机制可能涉及一种卷曲螺旋三聚体的形成，其被认为是推动从静止到融合状态的转变，如例如对于流感血凝素的描述(Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373；Carr，C.M.和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；Bullough，P.A.，等，Nature 371(1994)37-43)。
有包膜病毒的C肽(对应于C螺旋的肽)，如DP178和C34，有效地抑制HIV-1的适合实验室的毒株和原始分离株的膜融合(Malashkevich，V.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)9134-9139；Wild，C.T.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国91(1994)9770-9774)。使用C肽DP178的I期临床试验提示它具有导致病毒负荷减少的体内抗病毒活性(Kilby，J.M.，等，Nature Medicine 4(1998)1302-1307)。gp41核心的结构特征暗示这些肽通过一种优势的一负(dominant-negative)调节机制作用，其中C肽结合于gp41中心卷曲螺旋并导致它的失活(Chan，D.C.，等，Cell 93(1998)681-684)。
在每个卷曲螺旋界面内部是一个由一串在N螺旋卷曲螺旋中的残基形成的深腔，其已被提出成为用于开发抗病毒化合物有吸引力的目标。源于C螺旋的三个残基(Trp-628，Trp-631，和Ile-635)插入到该空腔中并造成广泛的疏水接触。突变分析说明包含该空腔的N-螺旋残基中的两个(Leu-568和Trp-571)对于膜融合活性是关键性的(Cao，J.，等，J.Virol.67(1993)2747-2755)。因此，以高亲和力与该空腔结合并抑制正常的N和C螺旋配对的化合物可能是有效的HIV-1抑制剂。在不同的HIV-1分离株中该空腔中的残基是高度保守的。而且，含有空腔结合区域的C肽比缺少该区域的DP178对抗性病毒的进化更不敏感得多(Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-993)。这些观察暗示以高度保守的卷曲螺旋表面，尤其它的空腔为目标的高亲和性配体将具有对不同HIV分离株的广泛活性并更不可能被逃避药物的突变体回避。
从流感病毒，莫洛尼鼠类白血病病毒和猿猴免疫缺陷病毒(在Chan，D.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617中引证)，人呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒，人T细胞白血病病毒，猿猴副流感病毒显示了包膜融合蛋白的融合结构。它说明在正粘病毒科，副粘病毒科，逆转录病毒科和其它类线状病毒科各科之间的一种紧密关系，其中类跨膜糖蛋白如HIV-1的gp41，流感的血凝素，埃博拉病毒的GP2及其它使得病毒能够进入靶细胞(Zhao，X.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177)。
在技术水平方面，描述了用于制备肽抑制剂(C-肽)的方法(参见，例如，Root，M.J.，等，Science 291(2001)884-888；Root等描述了来源于HIV-1.HXB2和含有残基625-661的肽C37-H6)。它是作为带有GGR-接头和组氨酸标记的N40-节段被重组表达，其是在大肠杆菌中表达并从细菌裂解物的可溶性级分来纯化。Zhao，X.等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177中描述了一种recRSV-1(人呼吸道合胞病毒)的合成基因，其编码残基153-209，一个富含G的接头，残基476-524，Xa因子切割位点和一个组氨酸标记。Chen.，C.H.，等，在J.Virol.69(1995)3771-3777中描述了重组表达被作为融合蛋白合成的gp41胞外结构域，残基540-686，融合至MBP。
已知了这类膜融合相关事件的许多肽抑制剂，其也称为抗融合肽，所述相关事件包括例如抑制逆转录病毒传染未感染细胞。例如Lambert，D.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191，美国专利号6,013,263；6,017,536；和6,020,459和WO 00/69902，WO 99/59615，WO96/40191中描述了这类肽。在美国专利号6,093,794；6,060,065；6,020,459；6,017,536；6,013,263；5,464,933；5,656,480中和在WO 96/19495中描述了另外的抑制融合相关事件的肽来源于抑制病毒融合的HIV-Igp-41胞外域的线性肽的实例是DP-107和DP-178。DP-107是靠近N-末端融合肽的gp-41的一部分并已经显示为螺旋状的，它以与卷曲螺旋结构一致的方式强烈寡聚化(Gallaher，W.R.，等，Aids Res.Hum.Retrovirus 5(1989)431-440，Weissenhom，W.，等，Nature387(1997)426-430)。DP-178是源于gp-41胞外域的C-末端区域。(Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430)。尽管在溶液中没有可辨别的结构，该肽和从此约束的类似物采取一种螺旋状结构，与gp41 N-末端卷曲螺旋三聚体的一个沟结合并且因而防止gp41转化为融合态(Judice，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)13426-13430)。
该短链肽通常是通过化学合成制备。例如Mergler，M.，等，TetrahedronLetters 29(1988)4005-4008和4009-4012；Andersson，L.，等，Biopolymers 55(2000)227-250；和由Jones，J.H.，J.Pept.Sci.6(2000)201-207描述了化学合成。在WO 99/48513中描述了另外的方法。
然而，化学肽合成经受几个缺点。最重要的是外消旋化，其导致不充分的光学纯度。在肽化学中，外消旋化也就意味着在几个手性中心中的一个处的差向异构化。如果对于单个偶联步骤仅仅发生1％的外消旋化，那么在100个偶联步骤将收到仅仅61％的目标肽(Jakubke，H.D.，肽，Spektrum Akad.Verlag，Heidelberg(1996)，198页)。明显的是杂质的数量随增长的链长增大并且它们的去除是越来越困难和昂贵。
高费用和作为原材料的保护氨基酸衍生物实用性的缺乏限制了大规模化学合成。一方面，这些原材料应该过量使用以使完成反应，另一方面，由于成本原因，安全性和环境方面它们的使用应该是均衡的(Andersson等，Biopolymer 55(2000)227-250)。
Lepage，P.，等，在Analytical Biochemistry 213(1993)40-48中描述了用于生产HIV-1Rev肽的重组方法。该肽表达为具有金黄色葡萄球菌蛋白A的合成免疫球蛋白类型G(IgG)结合结构域的融合蛋白。该肽具有大约20个氨基酸的长度，而Ig-G结合部分具有大约170个氨基酸的长度，所以表达的融合蛋白具有大约190个氨基酸的总长。表达该融合蛋白，以可溶的形式分泌在培养基中，并通过亲和层析纯化。作者报道使用该方法可能以每升培养物几百毫克的数量生产重组蛋白。然而，由于在信号肽序列中的备选处理和融合蛋白及切割肽中的几种翻译后修饰导致该方法体系是受限制的。假定一个氨基酸的平均分子量为110道尔顿，期望的肽具有大约2,000-5,000道尔顿的分子量，然而如果将金黄色葡萄球菌蛋白A的IgG结合域用作该融合尾部，则融合尾部具有至少170个氨基酸的长度(大约19,000D)。因此，只有10-25％的重组生产的蛋白是想要的肽。
Uhlen，M.，和Moks，T.，Methods Enzymol.185(1990)129-143，T.J.R.Expression of eukaryotic genes in E.coli.InGenetic Engineering(Williamson，R.编辑)，Academic Press，London，4卷，127-185(1983)；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704.Ningyi，L.，等，Gaojishu Tongxun 10(2000)28-31描述了在大肠杆菌中重组表达p24 gag基因。
国际申请WO 02/103026描述了在原核宿主细胞中生产作为大约14至70个氨基酸长度的融合肽的抗融合肽的方法，其特征在于，在该条件下形成所述融合肽的内含体，在所述宿主细胞中表达编码所述融合肽的核苷酸，所述融合肽包括N-末端与另一个4-30个氨基酸长度的肽连接的长度约为10-50个氨基酸的所述抗融合肽；培养所述宿主细胞；形成所述内含体，将其回收和溶解；分离所述融合肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法，其通过内含体的途径高产率重组生产抗融合肽，并且适合这类肽的大规模工业生产。
本发明因此提供一种通过在微生物宿主细胞中，优选在原核宿主细胞中，将编码所述抗融合肽的核苷酸表达为重复肽，分离含有所述重复肽的内含体，溶解该内含体，和在切割后分离抗融合肽而重组生产抗融合肽的方法，其特征在于使用一种变性剂在pH6.5或低于pH6.5的pH值下洗涤内含体，在至少pH9的pH值下溶解含有重复肽的所述内含体和切割所述重复肽以获得所述抗融合肽。
令人惊奇地发现，具有抗融合活性的重复多肽内含体(下文也称为融合多肽)在6.5和低于6.5的pH值下具有对变性条件的抵抗力。基于此，可通过按照本发明的条件以一种高效方式从宿主细胞多肽和其它源于宿主细胞的杂质中纯化含有这类重复肽的内含体，因为在该变性条件下包含在内含体中的所有物质的大多数是易于溶解的，因而可以通过在这类变性条件下简单洗涤内含体而去除。
在随后步骤中，为了回收可溶的重复肽，在9和更高的pH值下将内含体溶解，由此不需要加入去污剂或变性剂。在溶解后，化学切割或酶切割重复以获得想要的抗融合肽。
在本发明的一个优选实施方案中，切割序列位于重复的抗融合肽之间，并且该重复肽包含于融合多肽之中，所述融合多肽的特征在于该重复用优选大约1-10个氨基酸长度的所述切割序列连接在一起。抗融合肽本身具有10-100个氨基酸的长度，由此(关于稳定表达和形成内含体)融合多肽长度优选是至少大约50个氨基酸。
因此，本发明提供由内含体途径通过简单洗涤内含体和随后在不同pH值下将它们溶解来重组生产抗融合肽的一种极其简单的方法。
发明详述在此使用的“抗融合”和“抗膜融合”指相对于膜融合的水平，肽抑制或降低在两种或更多结构，例如细胞膜或病毒包膜或菌毛之间的融合事件水平的能力，所述膜融合是在不存在该肽时在所述结构之间发生。关于这个的实例是慢病毒属如人免疫缺陷病毒(HIV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPV)，麻疹病毒(MEV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的肽抑制剂。这类抗融合肽是来源于慢病毒属病毒包膜融合蛋白的跨膜亚基C螺旋，并且结合于各个病毒跨膜亚基的中心卷曲螺旋。
特别优选HIV-1抗融合肽，优选gp41 C-肽的片段。表1描述源于gp41C-肽的HIV-1抗融合肽实施例。这些抗融合肽和其片段在本发明中特别有用。
表1
*对于N-末端乙酰化和/或C-末端酰胺化肽；T-20(与DP178同义)和T-1249是源于I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，T-118源于呼吸道合胞病毒(RSV)，T-257源于麻疹病毒(MV)1)WO 99/596152)Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-9933)Lambert，D.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191抗融合肽的长度不是关键性的。然而优选使用大约10-100个氨基酸的长度。该长度必须足以提供在酸性pH值下抗变性剂的稳定性。最大长度主要取决于在溶解，切割和纯化过程中融合多肽的适当处理。
在本发明的一个优选实施方案中，按照本发明的重复肽在它的N-末端与另一个大约4-30个氨基酸的肽连接。另一个肽的目的是赋予抗融合肽以另外的性能，例如改善表达(例如具有高表达率的多肽如干扰素-α-2a的N-末端片段)，纯化(例如组氨酸标记；参见例如，Zhang，J.-H.，等，Nanjing Daxue Xuebao，Ziran Kexue 36(4)(2000)515-517)或允许随后类似乙酰化或聚乙二醇化(PEGylation)的N-末端修饰。
另一个肽是一段包含至少四个氨基酸(用于切割和/或表达目的的蛋氨酸和三个其它氨基酸)至大约30个氨基酸，优选10至约20个氨基酸(关于核苷酸密码子水平)的短肽序列。另一个肽的长度对于本发明不是关键性的。然而，为了提高抗融合肽的产率优选另一个肽是非常短的。特别优选另一个肽包含一些适于高水平表达或促进切割蛋白酶接近(避免空间位阻)的氨基酸的适当切割位点和/或一些氨基酸如纯化或固定标记如组氨酸标记(对于纯化方法；Hengen，P.，Trends Biochem.Sci.20(1995)285-286))和必需的和由起始密码子编码的蛋氨酸。
按照本发明的另一个肽也优选在融合肽中使用以在表达、溶解、纯化和肽修饰过程中保护抗融合肽的N-末端。这类融合肽在用于生产N-末端修饰的抗融合肽的方法中特别有价值。该方法涉及形成重组多肽作为一种融合肽，其融合部分保护N-末端。然后可以用化学保护试剂与重组融合肽反应以选择性保护活性侧链基团。接着使用至少一种切割试剂在肽和融合部分之间切割融合肽以形成一个未保护的末端氨基酸活性基团。此后，为了N-末端乙酰化可以使用一种化学修饰试剂如乙酐或N-羟基琥珀酰亚胺乙酯修饰未保护的末端氨基酸的活性基团。然后选择性地将侧链去保护以形成N-末端修饰的肽。例如在WO 94/01451；美国专利号5,635,371；和美国专利号5,656,456中描述了这类方法。
另一个肽部分优选具有一种结构以促进融合肽的纯化和/或固定化。为了这个目的另一个肽优选含有一种“亲和标记”(参见Pandjaitan，B.，等，Gene 237(1999)333-342)，如聚组氨酸(约6个组氨酸残基)等。另外，另一个肽优选含有一个N-末端蛋氨酸(由ATG编码)和C-末端编码切割位点的一个或多个氨基酸。
特别优选按照本发明的另一个肽是人干扰素-α-2a的N-末端片段，优选具有一个包括的组氨酸标记(标准单字母代码形式的氨基酸)
MCDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO5)MSDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO6)MSDLPQTHHHHHHSLGSR (SEQ ID No7)按照本发明，融合多肽含有一个或多个切割位点，其在内含体溶解后可被专一性切割蛋白酶(限制性蛋白酶)酶切或通过化学方法切割。考虑待生产的抗融合肽的氨基酸序列来选择蛋白酶。如果可能，必须注意限制性蛋白酶的识别/切割序列不出现在抗融合肽之中，并且优选也不在另一个肽中，即，它应该只出现在切割区域(接头区域)。合适的专一性切割内切蛋白酶是，例如Xa因子，凝血酶，枯草蛋白酶，枯草蛋白酶的BTN变体，遍在蛋白蛋白酶，凝乳酶，肠激酶，胶原酶，精确蛋白酶(precision protease)，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，内切蛋白酶Lys-C，激肽释放酶(Carter，P.在Ladisch，M.R.；Willson，R.C.；Painton，C.C.；Builder，S.E.，编辑.，Protein PurificationFrom Molecular Mechanisms toLarge-Scale Processes；ACS Symposium Series No.427，American ChemicalSociety，181-193页(1990)，TEV蛋白酶(Parks，T.D.，等，Anal.Biochem.216(1994)413-417)，IgA蛋白酶(Pohlner，J.，等，Nature 325(1987)458-462)，Kex2p蛋白酶(EP-A 0 467 839)或金黄色葡萄球菌V8蛋白酶。
另一个肽的序列可优选采用其它设计策略，其促进在预选的切割环境中的有效切割。具体地如果预选切割试剂是一种内肽酶，优选另一个肽在含水的环境中是可溶的。因此，优选具有带电侧链基团和亲水性质的氨基酸包含在另一个肽中以增进溶解性或促进切割蛋白酶接近的任何其它氨基酸。这类氨基酸是，例如，Glu和Asp(阴离子)，Arg和Lys(阳离子)，和Ser和Thr(中性，亲水性的)。如果使用精氨酸和/或赖氨酸，必须考虑到精氨酸和赖氨酸构成胰蛋白酶切割位点。
典型地选择切割位点以使切割结果产生没有附加序列的游离的和所需的抗融合肽(例如，胰蛋白酶在Arg后切割，然后通过羧肽酶B去除Arg)。因此，切割位点位于每个重复的一个末端，优选在肽重复的N-末端。这在融合多肽不包含如上定义的另一个肽的情形下同样优选，因为该切割位点在肽的化学修饰过程中可用于N-末端的中间保护。例如在WO92/01707和WO 95/03405中描述了化学和酶切割位点以及用于实现靠近位点中一个的肽键的切割的相应试剂。
在下面表2中描述关于切割酶和切割序列的实例表2
化学切割
1)单字母代码的氨基酸优选使用胰蛋白酶，其在精氨酸和赖氨酸的C-末端专一性地切割蛋白和肽。这类酶已知是例如来源于猪，牛或人的胰腺或重组酵母或大肠杆菌(WO 99/10503)。如果赖氨酸残基被保护，胰蛋白酶特别适合产生所需的多肽。
在本发明的意义中将能够被内切蛋白酶切割的肽序列理解为一条短链肽序列，其优选包含1-20个氨基酸，优选1-3个氨基酸，并且含有一个适于期望内切蛋白酶的C-末端切割位点。这个另外的肽优选在N-末端和期望的内切蛋白酶识别序列之间另外含有几个氨基酸的组合(第一部分)，优选选自亲水性氨基酸如Gly，Thr，Ser，Ala，Pro，Asp，Glu，Arg和Lys。优选将其中两至八个这些另外的氨基酸是带负电的氨基酸Asp和/或Glu的一种氨基酸一段序列用作第一部分。
只要抗融合肽不含蛋氨酸可使用BrCN切割(化学切割)。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗融合肽在它的C-末端含有一个甘氨酸。该甘氨酸用于随后的酶促C-末端酰胺化的目的(Bradbury，A.F.，和Smyth，D.G.，Trends Biochem.Sci.16(1991)112-115)。
因此，融合多肽的元件优选是-抗融合肽，-切割位点，-用于促进表达和/或纯化的另一个肽，-在C-末端的甘氨酸。
切割位点对于抗融合肽从融合多肽的其它元件的释放是必需的。因此切割位点位于在融合多肽中的抗融合肽之间，优选作为一个N-末端保护基团。
按照本发明，抗融合肽重复在形成含有所述肽和其它多肽的不溶性蛋白的内含体的条件下在微生物，如原核生物中过量表达。用抗融合肽的单重复(两段相同的抗融合肽序列)已经发现按照本发明的性质。然而，还可使用具有多于一个重复的融合多肽，即，五个，十个或高达二十个相同的抗融合肽序列。待生产的融合肽必须具有适于在宿主细胞中稳定表达和形成内含体的足够的长度。通常，编码至少约80个氨基酸，优选＞100个氨基酸的基因是以稳定的方式表达，不降解并且作为内含体沉淀。没有真正的重复上限。然而，表达编码多于3,000个氨基酸的基因是困难的并且实际上是不常见的。
埃希氏菌属，沙门氏菌属，链霉菌属或芽孢杆菌属例如作为原核宿主生物是合适的。酵母(例如酵母菌属，毕赤酵母属，汉逊酵母属，克鲁维酵母菌属，裂殖酵母)是优选的真核宿主生物。为了生产按照本发明的融合多肽，以通常方式用含有编码该肽的DNA的载体转化微生物并且随后以通常方式发酵。
内含体发现在胞质中存在并且含有在水中不溶的聚集形式的重复肽。通常，这类内含体蛋白是变性的形式(例如，随机连接的二硫键)。例如通过在细胞裂解后离心将这类内含体与其它细胞组分分离。
按照本发明，在pH值低于6.5，优选在约pH3-5下，在变性条件下洗涤内含体。该变性条件奇怪地不能使融合多肽溶解到相当大的程度，但是能够溶解很多包括多肽的其它源于宿主细胞的杂质。这类变性剂在技术水平上是众所周知的，并且例如是高度浓缩的盐酸胍溶液(例如大约6mol/l)或脲(例如大约8mol/l)。将变性剂优选用作缓冲溶液。
在洗涤后，优选不加去污剂或变性剂，在大约pH9或更高的碱性pH值下溶解内含体。另外令人惊奇地发现该碱性条件能够以充分的方式溶解融合多肽。在溶解后，可以切割融合多肽以回收抗融合肽。
在溶解后，可以以一种简单的方式，例如通过大小排阻层析，离子交换层析或反相层析纯化融合肽或抗融合肽。
构建合适表达载体和基因表达的方法中的所有另外的步骤是当今技术水平的并且对于本领域的技术人员是熟悉的。例如在Sambrook等，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社，纽约，美国中描述了该方法。
存在大量的描述通过内含体途径在微生物/原核生物中重组生产蛋白的出版物。该综述的实例是Misawa，S.，等，Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie，H.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney，R.C.，TrendsBiotechnol.12(1994)456-463。
按照本发明的肽在微生物/原核生物中过量表达。过量表达导致内含体的形成。由起始密码子编码的和在上述实例中提及的蛋氨酸主要在宿主细胞中表达/翻译过程中去除。用于在微生物/原核生物中过量表达蛋白的常规方法在当今技术水平已经众所周知很长时间。在该领域中的出版物的实例是Skelly，J.V.，等，Methods Mol.Biol.56(1996)23-53；Das，A.，Methods Enzymol.182(1990)93-112；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704。
在原核生物中过量表达意味着使用具有启动子如tac或lac启动子(EP-B 0 067 540)的优化的表达盒(美国专利号6,291,245)。通常，通过使用含有化学诱导启动子或通过温度改变诱导的启动子的载体可以进行过量表达。适于大肠杆菌的有用启动子是温度-敏感的λPL启动子(参见EP-B 0 041 767)。另一个有效的启动子是tac启动子(参见美国专利号4,551,433)。这类用于原核生物如大肠杆菌的强调节信号通常来源于攻击细菌的噬菌体(参见Lanzer，M.，等，Proc.Natl.，Acad.Sci.美国85(1998)8973-8977；Knaus，R.，和Bujard，H.，EMBO Journal 7(1988)2919-2923；对于λT7启动子Studier，F.W.，等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)；对于T5启动子EP-A 0 186 069；Stüber，D.，等，System for high-levelproduction in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunologicalMethods IV(1990)121-152)。
通过使用该过量生产的原核生物细胞表达系统，在至少构成细胞总表达蛋白的10％，典型地30-40％，偶尔高达50％的水平上生产按照本发明的肽。
在此使用的“内含体”(IBs)指在微生物/原核生物中过量表达编码核苷酸之后重组生产的一种不溶形式的多肽。该现象在本领域中是广泛了解的并且例如由Misawa S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)；Guise，A.D.，等，Mol.Biotechnol.6(1996)53-64；和Hockney等，Trends Biotechnol.12(1994)456-463综述。
优选通过使用具有大约9或更高pH值的水溶液进行内含体的溶解。最优选的是10.0或更高的pH值。对于溶解不需要加入去污剂或变性剂。按照实施例7可以容易地确定优化的pH值。因为强碱条件可使多肽变性，明显的存在一个优化的pH值范围。发现这个优化的范围在pH9和pH12之间。
按照在本领域已知的方法可以制备编码融合肽的核酸(DNA)。更优选用另外的调节和转录元件扩展核酸序列以优化在宿主细胞中的表达。优选通过化学合成生产适合表达的核酸(DNA)。该方法对于本领域的技术人员是熟悉的，并且例如在Beattie，K.L.，和Fowler，R.F.，Nature 352(1991)548-549；EP-B 0 424 990；Itakura，K.，等，Science 198(1977)1056-1063中描述。修饰按照本发明的肽的核酸序列也可能是有利的。
该修饰是例如-为了引入限制性酶的各种识别序列以易化连接，克隆和突变的步骤而修饰核酸序列；-修饰核酸序列以引入适于宿主细胞的优选的密码子；-为了优化在宿主细胞中的基因表达使用另外的调节和转录元件扩展核酸序列。
提供下列实施例，参考文献，图1和序列表以帮助理解本发明，其真正的范围在后附的权利要求中阐明。应当理解可以在未背离本发明的精神的条件下对阐明的程序进行修改。
图1显示表达载体pBRori-URA3-LACI-RFN-Edel。
原材料在美国专利号6,291,245中描述了用于表达按照本发明的多聚体肽前体蛋白的大肠杆菌宿主/载体系统(大肠杆菌宿主菌株和基本载体)。常规方法重组DNA技术如在Sambrook，J.，等，分子克隆实验手册；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中所描述使用标准方法来操作DNA。按照制造厂商的说明书使用分子生物学试剂。
蛋白测定使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数[T-重复ε＝148680cm2/mol；IFN-α-2a；ε＝18020cm2/mol；F9a＝44650cm2/mol]，通过测定在280nm处的光密度(OD)测定多聚体T-重复融合蛋白的蛋白浓度。
具体实施例方式
实施例1合成T-重复融合基因1.1T-重复融合基因的基因设计人工T-重复融合基因编码具有27,242D分子量的217个氨基酸的融合蛋白。该融合蛋白由人干扰素-α-2a N-末端的13个氨基酸(MCDLPQTHSLGSR｜SEQ ID NO5)；载体肽)和通过胰蛋白酶可切割的肽接头(GR)连接的5个拷贝的抑制性HIV肽T-1357(WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO1)，目标肽)组成。
为了将T-重复结构基因插入大肠杆菌表达质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(生产和描述参见实施例2)，在5’末端上游插入一个合成的核糖体RBSII结合位点和单个EcoRI内切酶切割位点并在3’末端上游插入单个的CelII限制性内切核酸酶切割位点。
1.2T-重复融合基因的基因合成通过化学合成从寡核苷酸制备RBSII T-重复基因，其是大约690bp长并被单个EcoRI和CelII限制性内切核酸酶切割位点侧接。通过寡核苷酸的退火和连接装配双链RBSII T-重复基因并随后作为一个长度为691bp的EcoRI/CellI片段克隆于一种大肠杆菌质粒中。将想要的质粒命名为pT-重复。通过DNA测序证实克隆的RBSII T-重复基因预先确定的DNA序列。
实施例2大肠杆菌表达质粒的构建2.1起始质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel的构建质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel是用于在大肠杆菌中表达干扰素-α-2a(IFN-α-2a)的一种载体。它是基于IFN-α-2b的表达质粒OripBR-URA3-EK-IFN(美国专利号6,291,245)。pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel与OripBR-URA3-EK-IFN区别在一个另外存在的lacI抑制基因和一个IFN-α-2a基因而不是一个IFN-α-2b基因。IFN-α-2a和IFN-α-2b只区别在位置21处的一个氨基酸(Lys21Arg交换)。lacI抑制基因来自质粒pUHA1(Stüber，D.，等，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152)。使用引物N1(SEQ ID NO12)和N2(SEQ ID NO13)，NotIN1 5′-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3′NotIN2 5′-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG-3′按照由Mullis，K.B.，和Faloona，F.A.，在Methods Enzymol.155(1987)335-350中描述的方法，通过多聚酶链式反应(PCR)扩增它，并且随后作为大约1210bp长度的NotI片段连接于OripBR-URA3-EK-IFN单一的NotI切割位点中。
2.2表达载体pBRori-URA3-LacI-T-重复的构建从质粒pT-重复(参见实施例1.2)分离作为大约690bp长度的EcoRI/CelII片段的T-重复基因，并随后连接至用EcoRI和CelII消化的大约3.1kbp长的pBRori-URA3-LacI-RFN载体片段中。通过限制性酶切图谱鉴定期望的质粒pBRori-URA3-LacI-T-重复，并且通过DNA测序再次证实亚克隆的T-重复基因。
实施例3在大肠杆菌中表达T-重复基因为了表达按照本发明的融合基因，采用一种大肠杆菌宿主/载体系统，其通过互补大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)(美国专利号6,291,245)能够进行不含抗生素的质粒选择。
3.1转化和通过在选择性培养基中互补一种pyrF营养缺陷型的细胞培养为了表达T-重复基因，用在实施例2.2中描述的表达质粒pBRori-URA3-LacI-T-重复转化大肠杆菌K12菌株[命名为UT5600(ΔpyrF)]。转化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重复细胞首先在37℃下在琼脂平板上生长，随后在含有0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中振荡培养直至在550nm处的光密度(OD550)为0.6-0.9，然后用IPTG(1-5mmol/l的最终浓度)诱导。在37℃诱导4-16小时后，通过离心收获细胞，用50mmol/l的磷酸钾缓冲液，pH6.5，洗涤，并储存在-20℃直至进一步的处理。
3.2表达分析为了表达分析，将源于3OD550nm单位(1OD550nm＝在550nm处OD为1的1ml细胞悬浮物)离心培养基的细胞沉淀重悬浮在0.25ml 10mol/ml的磷酸钾缓冲液，pH6.5中，并且通过超声处理(在50％强度两个30秒的脉冲)使细胞裂解。沉淀不溶的细胞成分(14,000rpm，5min)并且将上清液与1/5体积(体积)5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚蓝)混合。将不溶解的细胞残渣部分(沉淀)重悬浮在0.3ml 1×SDS样品缓冲液中，将样品在95℃温育5min并再次离心。随后，通过SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)(Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685)分离蛋白并用考马斯亮蓝R染料染色。
合成的T-重复融合蛋白是均一的并且发现是以不溶解的蛋白聚集体，所谓的内含体(IBs)的形式全部在不溶解的细胞残渣部分中。在所有克隆中表达产率在测量准确范围内是可比较的并且是相对于总大肠杆菌蛋白的30-60％。
实施例4为重组生产T-重复的大肠杆菌101高细胞密度发酵预培养物为了制备预培养物，在一个1000ml的三角烧瓶中用1ml大肠杆菌UT5600ΔpyrF pBRori-URA3-LacI-T-重复甘油储存物接种于300ml M9+培养基(用0.5％酪蛋白氨基酸和每个0.9g/l的Trp，Pro和Leu补充的M9培养基)。培养物在150rpm的外心摇床上在37℃温育大约6小时直至OD578nm达到3.0。
101补料分批主发酵在发酵开始，将预培养物转移至10升发酵罐中。主要培养物在限定的M9盐培养基中生长直至OD578nm达到20，所述限定的M9盐培养基含有1.4％甘油而不是葡萄糖，2％酪蛋白氨基酸和每个0.1％的氨基酸Trp，Leu和Pro。随后，开始使用一个甘油酵母剂量(母液30％酵母提取物和33％甘油)进料培养物，根据培养物pH值的发展其流速在0.8-3.5ml/min之间变化，从而避免了任何另外的校正助剂(H3PO4，KOH)的加入。pH保持在pH7.0，通过控制rpm将pO2保持在50％。
在OD578nm为70时加入1.5mmol/l的IPTG，并诱导基因/蛋白表达。整个发酵耗费大约36小时并且在OD578nm为160-180时终止。
收获生物量用无逆流离心机(13,000rpm，13l/h)将发酵罐的内容物离心，并将收获的生物量储存在-20℃直至进一步处理。
实施例55.1标准方法细胞裂解和制备IBs在0℃将200g大肠杆菌细胞(湿重)悬浮在110.1mol/l Tris-HCl，pH7.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃温育20分钟。随后，通过高压分散的方法将细胞完全机械裂解并通过加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分钟。此后，将500ml 60mmol/l EDTA，6％Triton X-100和1.5mol/l NaCl，pH7.0与裂解溶液混合并在0℃温育另外30分钟。随后，通过离心沉淀不溶解的组分(细胞残渣和IBs)。
将沉淀悬浮在110.1mol/l Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH6.5中，25℃温育30分钟并通过离心分离IB制剂。
5.2按照本发明的方法细胞裂解和制备IBs将200g大肠杆菌细胞(湿重)悬浮在110.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃温育20分钟。随后，通过高压分散的方法将细胞完全机械裂解，通过加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分钟，并且通过离心沉淀不溶解组分(细胞残渣和IBs)。
此后，用0.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.0，洗涤沉淀两次。为此，将沉淀在110.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.5中悬浮两次，在搅拌同时在25℃温育30分钟，并且通过离心分离。
5.3按照本发明的方法细胞裂解和制备高纯度IBs。
在0℃将200g大肠杆菌细胞(湿重)悬浮在110.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.0之中，加入300mg溶菌酶并在0℃温育20分钟。随后，通过高压分散的方法将细胞完全机械裂解，通过加入2ml 1mol/l MgCl2和10mg DNAse在25℃消化DNA 30分钟，并且通过离心沉淀不溶解组分(细胞残渣和IBs)。
此后，用5.5mol/l盐酸胍(和8mol/l脲，分别地)和10mol/l EDTA，pH3.0洗涤细胞两次。为此，将沉淀在5.5mol/l盐酸胍(和8mol/l脲，分别地)和10mol/l EDTA，pH3.0中悬浮两次，在搅拌同时在25℃温育10-30分钟，并且通过离心分离。
此后，用0.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.0洗涤细胞两次至三次。为此，将沉淀在110.1mol/l磷酸钾缓冲液，pH5.5中悬浮两至三次，在搅拌同时在25℃温育30分钟，并且通过离心分离。
实施例6在酸性范围内在变性剂存在的条件下T-重复IBs的溶解度与“标准”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比较将待测的IBs[IFN-α-2a如在实施例2.1，3.1，4和5.1中描述制备，然而使用UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel细胞而不是UT5600(△pyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重复细胞；F9a如在WO 97/47737中所描述制备；T-重复如在实施例2.2，3.1，4和5.2中所描述制备]在搅拌的同时在室温下以1g/20ml的浓度各自重悬浮于a)5.5mol/l盐酸胍和10mmol/l EDTA，pH3.0和
b)8mol/l脲和10mmol/EDTA，pH3.0在12-24小时后，在各种情形中取200μl样品，通过离心(Eppendorf5415离心机，14.000rpm，10min)沉淀不溶解组分，并且用20μl 5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚蓝)与80μl上清液混合。在SDSPAGE前将含有5.5mol/l盐酸胍的上清液对8mol/l的脲透析。用200μl磷酸钾缓冲液，pH5.0洗涤不溶解的沉淀一次，然后重悬浮于250μl1×SDS样品缓冲液中。在通过SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法分离蛋白并用考马斯亮蓝R染料染色前将所有的样品在95℃温育5分钟。此后，为了测定多肽的含量光密度分析相关的凝胶带(表3)。
表3a5.5mol/l盐酸胍，10mmol/l EDTA，pH3
表3b8mol/l脲，10mol/l EDTA，pH3
实施例7
在碱性范围内在含水溶液中T-重复IBs的溶解度与“标准”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比较在搅拌的同时室温下在待测试的pH值(8.0，9.0，10.0，11.0和12.0)下，将待溶解的IFN-α-2a，F9a-和T-重复IBs(依照实施例6中的描述生产)分别温育于a)50mmol/l Tris HCl和b)50mmol/l NaHCO3。
4小时后，在各种情形中取200μl样品，通过离心(14.000rpm，15min)沉淀不溶解组分。用20μl 5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚蓝)与80μl上清液混合。用200μl 50mmol/l的磷酸钾缓冲液，pH6.5洗涤不溶解的沉淀一次，并重悬浮于250μl 1×SDS样品缓冲液中。在通过SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法分离蛋白并用考马斯亮蓝R染料染色前将样品在95℃温育5分钟。此后，为了测定多肽的含量光密度分析相关的凝胶带(表4)。
表4aIFN-α-2a
表4bF9a
表4cT-重复
实施例88.1标准方法在变性条件下溶解IBs通过在25℃搅拌两小时将20g IB沉淀(湿重)悬浮在200ml 50mmol/lTris-HCl缓冲液，6mol/l盐酸胍(和8mol/l脲，分别地)，10mmol/l EDTA，pH7.0之中。通过离心分离不溶解的组分并且进一步处理透明的上清液。
8.2按照本发明的方法将IBs溶解于含水微碱性缓冲液中通过在25℃搅拌4-16小时将10g IB沉淀(湿重)悬浮在200ml 50mmol/l Tris-HCl缓冲液，pH9(和50mmol/l NaHCO3缓冲液，pH9-10，分别地)之中。通过离心分离不溶解的组分并且通过用胰蛋白酶酶切进一步处理[任选地，在用柠康酸酐衍生化T-重复融合蛋白的伯氨基基团(赖氨酸的ε-氨基基团)之后]透明的上清液。
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<223>人工序列的描述肽T1357<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽T680<400>2
Tyr Thr Ser Leu I1e His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽RSV118<400>3Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu1 5 10 15Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly20 25 30Lys Ser Thr35<210>4<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽MY257<400>4Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp1 5 10 15Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys20 25 30Glu Leu Leu35<210>5
<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>5Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>6Met Ser Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>7<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽<400>7Met Ser Asp Leu Pro Gln Thr His His His His His His Ser Leu Gly1 5 10 15Ser Arg<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列
<400>8Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>9Ile Glu Gly Arg1<210>10<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>10Gly Pro Arg1<210>11<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述切割序列<400>11His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物N1<400>12aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg35<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物N2<400>13aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg3权利要求
1.用于通过在微生物宿主细胞中表达一种编码作为重复肽的所述抗融合肽的核酸，分离含有所述重复肽的内含体，溶解所述内含体，并在切割后分离所述抗融合肽来重组生产一种抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一种变性剂洗涤所述内含体，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重复肽的所述内含体并切割所述重复肽以获得所述抗融合肽。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于洗涤是在pH3-5的条件下进行。
3.依照权利要求1或2的方法，其特征在于所述重复肽是在溶解所述内含体过程中或之后被切割。
4.一种编码一种融合多肽的核酸，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一种作为至少两个相同抗融合肽序列的重复肽的抗融合肽；b)一个位于所述抗融合肽之间的切割位点。
5.依照权利要求4的核酸，其特征在于所述抗融合肽包括10-100个氨基酸。
6.依照权利要求4或5的核酸，其特征在于所述重复包括2-20个相同的抗融合肽序列。
7.一种含有一种融合多肽的内含体制剂，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一种作为大约10-100个氨基酸长度的重复肽的抗融合肽；b)一个位于所述抗融合肽之间的切割位点。
全文摘要
用于通过在微生物宿主细胞中表达一种编码作为重复肽的所述抗融合肽的核酸，分离含有所述重复肽的内含体，溶解所述内含体并在切割后分离所述抗融合肽来重组生产一种抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一种变性剂洗涤所述内含体，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重复肽的所述内含体并切割所述重复肽以获得所述抗融合肽。
文档编号C12P21/00GK1502698SQ200310116190
公开日2004年6月9日 申请日期2003年11月19日 优先权日2002年11月19日
发明者卡奇马雷克·亚历山德拉, 科佩茨基·埃哈德, 尚茨·克里斯蒂安, 泽贝尔·斯特凡, 斯特凡, 克里斯蒂安, 卡奇马雷克 亚历山德拉, 基 埃哈德 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司