专利名称：用RFLP法检测人体组织微量样品中线粒体12s rRNA基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及检测药物性耳聋易感基因的高灵敏度方法，具体说是用RFLP法检测人体组织(如血液、毛发、上皮细胞等)微量样品中线粒体12s rRNA基因中第1555位点碱基突变的方法。
背景技术：
药物性耳聋与线粒体12s rRNA基因1555位点碱基的突变有关。1555A→G突变是显示出与药物性耳聋疾病独特相关性的突变。对线粒体12s rRNA基因1555G点突变进行基因检测的方法是由Fischel-Ghodsian和Prezant TR等人于1993年首先发展起来的，他们当时采用的是测序法，即利用PCR法扩增出包含待检测位点在内的DNA片段，通过对该片段进行的测序，直接确认1555A是否发生了A-G突变。随着分子生物学技术的发展，RFLP(restriction fragmentlength polymorphism)技术在基因检测领域得到应用，由于与测序法相比，该方法具有成本低廉、仪器设备相对简单、操作简便易行、便于普及等优点，因此逐渐成为基因检测领域中一种重要的常用检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供利用RFLP检测药物性耳聋易感基因的方法。本发明的方法同时具备灵敏度高、结果可靠、成本低廉、操作简单等优点，用本发明的方法检测230个样品，结果，经测序法验证其符合率为100％，没有假阳性和假阴性的出现。
RFLP(restriction fragment length polymorphism)称为限制性片段长度多态性，是指用某一种限制性内切酶切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段，表明在这种被切割的不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有差异，这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。如果当DNA分子中的核苷酸发生了改变，改变的核苷酸正好位于限制性内切酶的识别序列内，用这种酶切割DNA时，这个酶切位点将因核苷酸的改变而消失，于是酶切后产生的DNA片段的数目和长度都会发生改变。对于线粒体12s rRNA基因1555位点来说，由于正常基因在该位点是A，形成了限制性内切酶Alw26 I的作用位点，而在突变基因中该位点是G，使得Alw26 I的作用位点消失，这样就具备了对12s rRNA基因1555位点进行RFLP分析的分子基础。
本发明的方法包括以下步骤(A)利用PCR扩增体外微量组织样品中线粒体12s rRNA基因片段；(B)用限制性内切酶Alw26 I消化PCR反应产物(801bp的DNA片段)；(C)用RFLP法分析酶切片段，其中12s rRNA基因1555位点为A的样品显示长度分别为321bp和480bp的2条带，而1555位点为G的样品显示长度为801bp的1条带。
所述微量组织样品可以为微量血、毛发、上皮细胞等。
本发明的方法可以用于筛查药物性耳聋的易感性，为临床医师提供适合的治疗方案的选择，避免易感个体因为使用耳毒性药物，例如氨基糖甙类抗生素，如庆大霉素、链霉素等而导致耳聋。与现有药物性耳聋易感性的检测方法相比，本发明的方法具有操作简单，灵敏度高，对受检者的伤害小，成本低等特点，因此，极具应用前景。
可以通过设计特定引物扩增出目标DNA。这种引物包括足够长度和适宜序列的寡核苷酸，可以特异启动目标序列的合成，延伸核苷酸链。引物设计成与目标DNA充分互补。在以下PCR反应中，本发明利用上游引物5’-cgatcaacctcaccacctct-3’和下游引物5’-tggacaaccagctatcacca-3’扩增出目标序列。
限制性内切酶Alw26 I可以将1555位点是A的线粒体12srRNA基因扩增产物切割成长度分别为321bp和480bp的两种长度的DNA链，而在突变基因中，该位点是G，使得Alw26 I的作用位点消失，因此，在用Alw26 I酶切时，只出现长度为801bp的一种长度的DNA链。在电泳检测时，线粒体12s rRNA基因1555位点是A的样品显示出两条清晰的带，而线粒体12s rRNA基因1555位点是G的样品只显示出一条带，从而可以对PCR产物的突变进行特异性检测。与测序法相比，本发明的方法省去了繁琐的测序工序，可以节约时间和简化操作，同时在经济上也是有利的。
本发明另外通过优化PCR反应条件，即模板DNA的用量、反应循环数、引物用量这三个参数，使PCR体系能同时满足如下三项要求(1)使非特异扩增处于极低水平，使非特异扩增产物无法在电泳检测结果中出现，从而避免了检测结果出现假阳性的可能；(2)确保靶序列产物的产量，使其能满足后续工作的需要；(3)在保证引物相对过量的前提下，使得引物被消耗至电泳检测不可见的水平，从而保证最终检测结果中图象显示的高质量。另外在限制性内切酶反应中，通过优化酶切反应体系的酶用量、反应温度和消化时间，使底物被完全消化，同时达到了减少酶用量、缩短反应时间的目的，从而，达到进一步优化该检测方法的目的。
在一个方案中，控制PCR反应体系，使之符合以下条件之一、之二或之三A、模板DNA在反应体系中的用量为50-100ng，优选50ng/μl；B、反应循环数为20-30，优选25；C、引物在反应体系中的用量为5-25pmol，优选25pmol。
在优选的方案中，控制PCR反应体系，使之符合以下条件之一、之二或更优选之三A、模板DNA在反应体系中的用量为50ng；B、反应循环数为25；C、引物在反应体系中的用量为25pmol。
在还更优选的方案中，PCR反应体系包括50ng模板DNA，25pmol引物，200μM dNTPs，2.5U Taq酶，50μl反应体积，25个反应循环。
另外，在优选的实施方案中，酶切反应体系的设置为2-4U酶，优选2U酶，37℃，消化1-2小时，优选1小时。
在优化PCR扩增反应中，本发明分别使用0.5ng、1ng、2.5ng、5ng、10ng、25ng、50ng模板DNA，0.5pmol、1pmol、5pmol、25pmol、50pmol引物，以及15、20、25、30个反应循环，考察模板DNA用量、引物用量和反应循环数对PCR产物产量以及非特异产物产量的影响，结果发现50ng以上的模板DNA，尤其50ng模板，5-25pmol引物，尤其25pmol引物，以及20-30个反应循环，尤其25个反应循环，既可获得足够的产物量，又能使非特异产物的形成量非常少。从而使检测的灵敏度大大提高。
在酶切反应中，本发明使用0.25U、0.5U、1U、2U、4U的内切酶Alw26 I，1-2小时的消化时间，考察不同酶量和不同消化时间对底物的作用的影响，结果发现，2U或4U酶作用1小时或2小时均可以完全消化底物，而0.25U、0.5U、1U酶则不能完全消化底物，底物残留量随酶量减少而增加。消化时间并没有对结果造成明显影响，在各试验组中，酶作用1小时和2小时的结果基本一致。
本发明的方法可以用微量血(例如一滴)来进行，例如可以通过采指尖血来获得样品，而不象其它方法，如测序法那样需要大量待测样品(通常4-5ml静脉血)。同样，在以其它类型的人体组织为样品进行检测时，也可以使用微量的样品。
微量血样品优选预先进行DNA的提取。例如该提取可以包括以下步骤将全血与纯化树脂混和，室温下放置，离心，收集沉淀；用DNA结合液悬浮，混匀，离心，收集沉淀；漂洗，混匀，离心，收集沉淀；用无水乙醇悬浮，离心，去除乙醇，用离心纯化柱洗脱，收集纯化液体。
本发明的另一个目的是提供用RFLP法检测人体组织微量样品中线粒体12s rRNA基因1555位点突变的试剂盒，该试剂盒包括PCR反应体系和Alw26 I酶切反应体系，其中PCR反应体系可以包括DNA纯化树脂，DNA结合液，DNA漂洗液，离心纯化柱，PCR扩增引物，阴性对照模板DNA，阳性对照模板DNA。酶切反应体系可以包括Alw26I内切酶，阴性对照DNA，阳性对照DNA，和DNA分子量标准。
本发明的试剂盒提供了检测药物性耳聋的易感性的方便手段。这种试剂盒可以通过如下步骤来操作1、在离心管中加入1ml纯水，取一片血斑滤纸片放入管中，盖紧管盖；2、用振荡器将离心管振荡5秒钟，插入离心管架，放置10分钟，其间每隔2分钟振荡混合一次，每次5秒钟；3、在室温下(下同)用离心机以最高速度离心2分钟，用移液器吸取并弃去上清；4、用移液器吸取100μl纯化树脂加入管中，用振荡器将离心管振荡5秒钟。
5、将离心管插入离心管架，放置3分钟；6、用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；7、用移液器吸取200μl结合液加入管中，将离心管上下颠倒10次，用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；8、用移液器吸取100μl漂洗液加入管中，将离心管上下颠倒10次，用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；9、重复第8步一次。
10、用移液器吸取160μl无水乙醇加入管中，轻轻吹吸一次混匀沉淀，再全部吸出移入空的离心纯化柱中；11、用离心机以最高速度离心1分钟，倒掉废物收集管里的乙醇，再离心1分钟，用100μl移液器吸尽残留乙醇；12、将纯化柱套入一个新的离心管中，用移液器吸取30μl TE缓冲液滴在纯化树脂上(注意不要粘在管壁上)，放置3分钟；13、用离心机以最高速度离心2分钟，用移液器吸取20μl TE缓冲液滴在纯化树脂上(注意不要粘在管壁上)，放置3分钟；14、用离心机以最高速度离心2分钟，弃去纯化柱，将离心管做好标记后放置到4℃冰箱中有相应编号的离心管架上。
15、取3个PCR反应管，分别标记为“T”、“P1”、“N1”，分别加入48μl纯水和1μl引物。
16、按标记向3个管中分别加入待测样品DNA、阳性对照模板DNA、阴性对照模板DNA溶液各1μl。
17、将3个管分别插入PCR样品孔中，设置参数为94℃，5min；(95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec)cycles；72℃，2min。
18、取5个酶切反应管，分别标记为“T”、“P1”、“N1”、“P2”、“N2”，分别加入17μl纯水和1μl Alw26I酶，再依次分别加入“T”、“P1”、“N1”的PCR产物、阴性对照2、阳性对照2各2μl。
19、在37℃水浴中保温1小时。
20、制备2％的琼脂糖凝胶，将上述5管产物各取2μl上样，60mA稳流电泳1小时。
21、在凝胶成像系统中对凝胶进行拍照并保存图象文件。
附图简述
图1是不同用量的模板DNA的PCR结果电泳图，其中Lane 1-250ng模板DNA的产物(1μl)Lane 3-425ng模板DNA的产物(1μl)Lane 5-610ng模板DNA的产物(1μl)Lane 7-85ng模板DNA的产物(2μl)Lane 9-102.5ng模板DNA的产物(2μl)Lane 11-121ng模板DNA的产物(2μl)Lane 13-140.5ng模板DNA的产物(2μl)Lane MMW marker DL 2000(10ng/band)。
图2是不同反应循环数的PCR产物电泳分析图，显示了不同反应循环数对PCR产物量的影响，其中Lane 1-230 cycles的产物，Lane3-425 cycles的产物，Lane5-620 cycles的产物，Lane 7-815 cycles的产物，Lane MMW marker DL 2000 10ng/band。
图3是不同引物用量获得的PCR产物电泳分析图，显示了引物用量的不同对PCR产物量的影响，其中Lane 1-250pmol primers时的产物(1μl)，Lane 3-425pmol primers时的产物(1μl)，Lame 5-65pmol primers时的产物(1μl)，Lane 7-81pmol primers时的产物(2μl)，Lane9-100.2pmol primers时的产物(2μl)，Lane MMW marker DL2000(10ng/band)图4是不同酶量和不同消化时间对底物的作用结果图，其中Lane14U酶-37℃-1hr的结果Lane22U酶-37℃-1hr的结果Lane31U酶-37℃-1hr的结果Lane40.5U酶-37℃-1hr的结果Lane50.25U酶-37℃-1hr的结果Lane64U酶-37℃-2hr的结果Lane72U酶-37℃-2hr的结果Lane81U酶-37℃-2hr的结果Lane90.5U酶-37℃-2hr的结果Lane100.25U酶-37℃-2hr的结果
Lane MMW marker DL 2000(10ng/band)。
图5是特异引物PCR反应的产物(示801bp片段)的电泳图，其中Lane1-6不同样品；MMW marker DL 2000图6是Alw26 I消化801bp PCR产物的结果，(-)代表1555G野生型个体，(+)代表1555G突变型个体，MMW markerDL 2000；Lane1-6不同样品。
图7是Alw26 I消化801bp PCR产物的结果(示192个样品)。
图8是Alw26 I消化801bp PCR产物的结果(示1555G野生型个体及突变型个体)。MMW marker DL 2000；Lane11555G野生型个体；Lane21555G突变型个体。
图9是1555G野生型个体的测序结果线粒体基因组上的12S rRNA1555位点的碱基为A，如图所示。在1555A上游的序列为TATAGAGGAG，1555A下游的序列为CAAGTCGTAA。
图10是1555G突变型个体的测序结果在线粒体基因组上的12S rRNA1555位点的碱基为A由碱基G替代，如图所示。在1555G上游的序列为TATAGAGGAG，1555G下游的序列为CAAGTCGTAA。
本发明的实施方式一、PCR反应条件的优化1、材料与方法1.1作为PCR模板的基因组DNADNA提取试剂(1)纯化树脂(于GN结合液中) 50ml(2)结合液 50ml(3)漂洗液 50ml(4)离心纯化柱(空柱子) 50个(5)废液收集管 50个(6)无水乙醇(7)TE缓冲液其中，纯化树脂购自北京赛百胜公司，离心纯化柱和废液收集管购自北京三博远志公司。
所需仪器1、台式高速离心机；2、1.5ml或2ml离心管及离心管架；3、100μl、1000μl移液器及吸头操作程序在1.5ml离心管中将50μl全血与100μl纯化树脂混和。室温下放置3分钟，5,000rpm离心3秒，收集沉淀。用200μl结合液悬浮，摇匀，5,000rpm离心3秒，收集沉淀。用100μl漂洗液洗两次，摇匀，5,000rpm离心3秒，收集沉淀。用160μl无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱(空柱子)，12,000rpm离心1分钟，倒掉废物收集管里的乙醇，再离心1分钟，尽量除尽乙醇。将纯化柱套入一个干净的1.5ml离心管中，加入20μl TE缓冲液于纯化树脂上(不能粘在管壁上)，室温下放置3分钟，12,000rpm离心2分钟。离心管中收集的液体即是洗脱下来的基因组DNA，取2μl电泳(0.8％琼脂糖，120V，20分钟)检测。
实验结果描述时间整个过程30-40分钟完成；回收率从50μl全血中可提取约1μg DNA；DNA质量6个样品的提取结果OD260/OD280平均值为1.92。
将微量提取法从外周血细胞中提取的总DNA，溶解于TE溶液中，浓度为50ng/μl，OD260/OD280＝1.912。
1.2特异引物RFPL方法中PCR反应所使用之引物与测序法中使用的PCR引物相同。上游引物5’-cgatcaacctcaccacctct-3’，下游引物5’-tggacaaccagctatcacca-3’，由赛百胜公司合成。用无菌双蒸水溶解并稀释至25pmol/ul。
1.3工具酶及试剂Taq酶、dNTPs和DNA MW marker DL 2000，购自Takara公司。
1.4模板DNA的拷贝数对PCR产物量的影响PCR反应体系如下10×PCR buffer 5.0μl10mmol/L dNTPs 4.0μl5U/μl Ampli Taq polymerase0.5μl50m mol/L primer 1.0μl/pair梯度稀释的总DNA1.0μl无菌去离子水 加至50μl
总DNA稀释后的浓度分别为0.5ng/μl、1ng/μl、2.5ng/μl、5ng/μl、10ng/μl、25ng/μl、50ng/μl。
PCR反应条件为94℃，5min；(95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec)30循环；94℃，2min1.5引物的数量对PCR产物量的影响PCR反应体系如下10×PCR buffer 5.0μl10mmol/L dNTPs 4.0μl5U/μl Ampli Taq polymerase0.5ul梯度稀释的primer 1.0μl/pair50ng/μl gDNA 1.0μl无菌去离子H2O 加至50ulprimer稀释后的浓度分别为0.5pmol/μl、1pmol/μl、5pmol/μl、25pmol/μl、50pmol/μl。
PCR反应条件为94℃，5min；(95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec)30循环；94℃，2min。
1.6反应循环数对PCR产物量的影响PCR反应体系如下10×PCR buffer 5.0μl10mmol/L dNTPs 4.0μl5U/μl Ampli Taq polymerase0.5μl50mmol/L primer1.0μl/pair50ng/μl gDNA 1.0μl无菌去离子H2O 加至50μlPCR反应条件为94℃，5min；(95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec)循环数分别为30、25、20、15个；94℃，2min。
2、结果与分析2.1模板DNA的拷贝数对PCR产物量的影响模板拷贝数不同将对PCR产物的量造成影响，如图1所示。
在实际的电泳检测结果中，除第1、2与第3、4条带亮度相同外，其他条带则依模板量的递减而亮度依次减弱，根据与DNA分子量Marker相对比而大致估计的各条带中DNA含量，可以认为条带中实际含量与理论计算值基本吻合。
对于扩增产物的特异性而言，根据上述计算结果，由于非特异扩增产物的量很少，在电泳条带中的载量最大也不超过5ng，这在EB染色的DNA荧光检测中是不可见的，由此可见电泳检测显示的DNA只能是靶序列产物。因此可以认为在对PCR扩增产物进行电泳检测时，只要出现可见的801bp DNA条带，就表示该产物一定是以线粒体12srRNA为模板而获得的，以nDNA为模板而获得的非特异产物在电泳检测中是不可见的。
在一个白细胞中，核基因组DNA(nDNA)为2个拷贝，质量约为6.4×10-12g，线粒体DNA(mtDNA)约为1300个拷贝，质量约为2.3×10-14g。mtDNA与nDNA拷贝数之比为650∶1，质量比为1∶278，根据此进行计算，可知50ng总DNA中含有nDNA和mtDNA的拷贝数分别为31130和10120106。由于每个mtDNA分子中含有一个12s rRNA基因，因此12s rRNA基因的拷贝数与mtDNA的拷贝数相同。根据如下计算方法可计算出各PCR反应体系中PCR产物的理论产量(1)根据模板的起始拷贝数计算产物拷贝数，应用计算公式Nf＝N0×(1+Y)n其中Nf为靶序列的最终拷贝数，N0是起始拷贝数，Y是每轮循环引物延伸效率(一般使用值为0.7)，n是PCR指数扩增条件下的PCR循环数。
(2)根据产物的拷贝数计算产物质量，应用计算公式
计算结果如下 2.2反应循环数对对PCR产物量的影响由2.1可知，在50μl的PCR反应体系中，以nDNA为模板而获得的非特异产物还是有相当数量的，为了尽量减少非特异产物产量，以便能更好的消除它们对最终检测结果的影响，采取适当的减少PCR反应循环数的策略，可以更大程度上降低非特异产物产量，而同时保证有足够的靶序列产物可用于后续工作的需要。
不同反应循环数对PCR产物量的影响如图2所示。
使用2.1中PCR产物的计算公式，可以得出各PCR反应体系中PCR产物的理论产量 在实际的电泳检测结果中，各条带则依反应循环数的递减而亮度依次减弱，根据与DNA分子量Marker相对比而大致估计的各条带中DNA含量，可以认为条带中实际含量与理论计算值基本吻合。
在反应循环数为25的PCR体系中，靶序列产物总量为5μg，完全可以满足后续工作的需要，而在同样条件下，非特异产物的总量只有15.5ng，根据2.1中的相关分析，可以认为在反应循环数为25的PCR体系能更好地保证扩增产物的特异性。同时，减少反应循环数对于缩短整体检测工作的工作周期也是具有积极意义的。
2.3引物的数量对PCR产物量的影响在进行一般的PCR反应体系设计时，引物的数量一般都远过量于模板DNA的数量，其目的在于保证退火过程中引物与模板结合的特异性和速度。但在本实验中，终浓度为1.0μM(50μl反应体系中含量为50pmol)的引物显然对检测产生了不良影响，其原因在于在进行电泳检测时明亮的引物条带影响了电泳图象的视觉效果。为了消除电泳检测时的引物带，同时又保证PCR反应的速度和特异性，可以对引物用量进行调整，使其在保持过量的同时又能在反应结束时剩下不多，在电泳检测时不足以产生可见的条带。
如图所示，当引物用量为5-25pmol时，结果较好，尤其当引物用量为25pmol时，在对PCR产物进行的电泳检测中引物条带几不可见，而在此条件下，靶序列产物的量在5μg以上，完全能满足后续工作的需要。
3.结果根据以上实验现象及其分析结果，最优选PCR反应体系包括50ng模板DNA，25pmol引物，200μM dNTPs，2.5U Taq酶，50μl反应体积，25个cycles。最终反应结果中，靶序列产物产量约为5μg，非特异产物产量约为15.5ng，二者比例约为322∶1。在进行电泳检测时，由于仅取1μl上样电泳，其中含靶序列产物100ng，含非特异产物0.31ng，因此只要出现扩增产物，就可以认为必定是来源于线粒体12s rRNA的靶序列产物，从而确保了PCR产物在检测结果上的特异性。
二、优化限制性内切酶反应体系缩短检测周期的研究通过对Alw26 I酶反应体系中酶量和消化时间与酶切产物之间关系的对比研究，确定酶切反应体系的设置为2-4U酶，优选2U酶，37℃，消化1-2小时，优选1小时。在该体系的反应结果中，底物被完全消化，同时达到了减少酶用量、缩短反应时间的目的。
1、材料与方法
1.1作为酶反应底物的PCR产物PCR产物来自于如下反应体系50ng模板DNA，25pmol引物，200μM dNTPs，2.5U Taq酶，50μl反应体积，25个cycles。取2μl作为酶反应底物，其中含有801bp的靶序列产物DNA约200ng。
1.2工具酶及试剂Alw26 I限制性核酸内切酶及其反应缓冲液购自三博远志公司，DNA MW marker DL 2000，购自Takara公司。
1.3Alw26 I酶反应体系的设置设置如下10个酶切反应体系，分别观察不同酶量和不同消化时间对底物的作用结果。
10×Y+/TAnqobuffer 2.0μlPCR反应物 2μl梯度稀释的Alw26 I酶 1μl无菌去离子H2O加至20μlAlw26 I酶稀释后的浓度分别为0.25U/μl、0.5U/μl、1U/μl、2U/μl、4U/μl。
酶切反应条件分别为(1)37℃，1小时；(2)37℃，2小时。
结果与分析不同酶量和不同消化时间对底物的作用结果在Alw26 I酶切反应体系中，不同酶量和不同消化时间对底物的作用结果有所区别，如图4所示。
如图4所示，2U或4U酶作用1小时或2小时均可以完全消化底物，而0.25U、0.5U、1U酶则不能完全消化底物，底物残留量随酶量减少而增加。消化时间并没有对结果造成明显影响，在各试验组中，酶作用1小时和2小时的结果基本一致。
三、药物性耳聋易感基因检测从已进行过测序分析的mtDNA样品中随机选取了230个进行RFLP分析，通过比较RFLP法与测序法在检测结果上的对应性，从检测结果的准确性方面探讨了以RFLP法进行线粒体12s rRNA基因1555G点突变基因检测的可行性。实验结果表明，RFLP法与测序法在检测结果上完全一致。
1.材料与方法1.1待测样品经测序法进行过检测分析的DNA样品，本室自存，共230个。
1.2特异引物RFPL方法中PCR反应所使用之引物与测序法中使用的PCR引物相同。上游引物5’-cgatcaacctcaccacctct-3’，下游引物5’-tggacaaccagctatcacca-3’，由赛百胜公司合成。
1.3工具酶及试剂Taq酶、dNTPs和DNA MW marker DL 2000购自Takara公司，Alw26 I内切酶购自三博远志公司。
1.4特异引物的PCRPCR反应体系如下10×PCR buffer 5.0μl10mmol/L dNTPs 4.0μl5U/μl Ampli Taq polymerase 0.5μl10μmol/L primer1.0μl/pair50ng/μl gDNA 1.0μl无菌去离子H2O 加至50μlPCR反应条件为94℃，5min；95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec，25循环；94℃，2min。
1.5Alw26 I内切酶消化PCR产物Alw26 I酶反应体系如下10×Y+/TANqo buffer 2.0μl8U/ul Alw26 I 1.0μlPCR产物 1.0μl无菌去离子H2O加至20μlAlw26 I内切酶反应条件为37℃，1小时。
1.6琼脂糖凝胶电泳制备2％琼脂糖凝胶，60mA，电泳1小时。
2.结果与分析
2.1特异引物PCR反应结果PCR扩增反应的引物是根据线粒体基因组序列(序列号J01415)进行设计的。上游引物2F5’-cgatcaacctcaccacctct’，下游引物2R5’-tggacaaccagctatcacca，PCR产物为801bp的DNA片段。如图5所示。
2.2Alw26 I内切酶消化结果对于基因型正常的DNA样本来说，由于801bp的PCR产物在第321位处形成一个Alw26I酶切位点，酶切可产生长度分别为321bp和480bp的两个DNA片段，因此琼脂糖凝胶电泳时将显示出两条带。
而当线粒体12s rRNA基因第1555位的A突变为G时，在801bp的PCR产物上位于第330位点的A为G所替代，导致Alw26I酶切识别位点消失。因此，对于基因型异常的DNA样本来说，801bp的PCR产物不能被Alw26I酶酶切，电泳时只能显示长度为801bp的一条带。如图6和7所示，图6是Alw26 I消化801bpPCR产物的结果，(-)代表1555G野生型个体，(+)代表1555G突变型个体。图7是Alw26 I消化PCR产物801bp DNA片段的结果(示192个样品)。
2.3RFLP检测结果与测序检测结果的比较以往对12s rRNA基因1555位点的检测主要用测序法。现在用RFLP发检测该位点，发现RFLP检测结果与测序检测结果是一致的。如图8，9，10对比所示。图8为Alw26 I消化801bp PCR产物的结果，分别显示了1555G野生型个体及突变型个体的酶切结果。图9，10分别为1555G野生型个体及突变型个体的测序结果。为了进一步证明RFLP检测结果的可靠性，对230个样品同时进行RFLP检测与测序检测。所得结果如表1所示。
表1 230个样本的RFLP检测结果与测序检测结果
表1中A表示测序法中的野生型，a/g表示测序法中的突变型，(-)表示RFLP法中的野生型，(+)表示RFLP法中的突变型。
更详细地，步骤S58中所示的稳态流对应于稳态流SF1～SF4或SF5～SF8中的一个。稳态流SF1～SF4或SF5～SF8被预定为使用通过划分地磁传感器信号的一个周期而已经生成的多个状态S1～S4来确定地磁传感器信号是否表示稳态信号输入命令。
如果定时器42的当前时间(t)短于最大校准有效时间T2，则控制器44继续检查状态变化。在此情形下，当以一个方向，例如顺时针或逆时针方向旋转地磁传感器时，建立其中校准处理被完成的一个有效状态。在下面的表2中示出有效状态变化。
参见上面的表2，如果根据未定义的流，例如“S1→S2→S1”或是“S1→S3→S2”来改变状态，除了八个稳态流，即四个顺时针稳态流SF1～SF4以及四个逆时针稳态流SF5～SF8外，控制器44确定输入信号不对应于一稳态流，而使得校准处理返回到步骤S52。
此后，如果提供了稳态流，则在步骤S59，控制器44确定是否收到表示地磁传感器的一次旋转的1-闭合回路信号。更详细地，如果确定了状态变化是有效的，则控制器44确定该地磁传感器是否被旋转了一次以上。
12、阴性对照2 50个13、阴性对照2 50个14、DNA分子量标准 50μl(二)、试剂配置方法1、DNA纯化树脂购自北京赛百胜公司2、DNA结合液 6M硫氰酸胍，20mM EDTA.Na2，10mMTris-HCl，40g/L Triton X-100，10g/L DTT3、DNA漂洗液 25％异丙醇，25％乙醇，100mM NaCl，10mMTris-HCl(pH 8.0)4、离心纯化柱 购自北京赛百胜公司5、废液收集管 购自北京赛百胜公司6、PCR反应管 购自北京赛百胜公司7、PCR扩增引物由北京赛百胜公司合成，稀释至50pmol/μl8、阴性对照模板DNA 自制，稀释至50ng/μl9、阳性对照模板DNA 自制，稀释至50ng/μl10、Alw26 I内切酶购自北京三博远志公司，稀释至2U/μl11、酶切反应管 自制，含1×Y+/TAnqo缓冲液20μl12 阴性对照DNA 自制，阴性标本PCR产物，稀释至50ng/μl13、阳性对照DNA 自制，阳性标本PCR产物，稀释至50ng/μl14、DNA分子量标准购自大连宝生物公司，稀释至5ng/μl(三)、实验室配套使用的其他物品1、PCR仪GeneAmp PCR System 97002、台式高速离心机3、稳压稳流电泳仪4、水平电泳槽5、1.5ml离心管及离心管架6、10μl、100μl、1000μl移液器及吸头7、琼脂糖8、无水乙醇9、TE缓冲液10、0.5×TBE电泳缓冲液(四)、操作步骤
1、在离心管中加入1ml纯水，取一片血斑滤纸片放入管中，盖紧管盖；2、用振荡器将离心管振荡5秒钟，插入离心管架，放置10分钟，其间每隔2分钟振荡混合一次，每次5秒钟；3、在室温下(下同)用离心机以最高速度离心2分钟，用移液器吸取并弃去上清；4、用移液器吸取100μl纯化树脂加入管中，用振荡器将离心管振荡5秒钟。
5、将离心管插入离心管架，放置3分钟；6、用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；7、用移液器吸取200μl结合液加入管中，将离心管上下颠倒10次，用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；8、用移液器吸取100μl漂洗液加入管中，将离心管上下颠倒10次，用离心机以5,000rpm离心3秒，用移液器吸取并弃去上清；9、重复第8步一次。
10、用移液器吸取160μl无水乙醇加入管中，轻轻吹吸一次混匀沉淀，再全部吸出移入空的离心纯化柱中；11、用离心机以最高速度离心1分钟，倒掉废物收集管里的乙醇，再离心1分钟，用100μl移液器吸尽残留乙醇；12、将纯化柱套入一个新的离心管中，用移液器吸取30μl TE缓冲液滴在纯化树脂上(注意不要粘在管壁上)，放置3分钟；13、用离心机以最高速度离心2分钟，用移液器吸取20μl TE缓冲液滴在纯化树脂上(注意不要粘在管壁上)，放置3分钟；14、用离心机以最高速度离心2分钟，弃去纯化柱，将离心管做好标记后放置到4℃冰箱中有相应编号的离心管架上。
15、取3个PCR反应管，分别标记为“T”、“P1”、“N1”，分别加入48μl纯水和1μl引物。
16、按标记向3个管中分别加入待测样品DNA、阳性对照模板DNA、阴性对照模板DNA溶液各1μl。
17、将3个管分别插入PCR样品孔中，设置参数为94℃，5min；(95℃-30sec，58℃-30sec，72℃-90sec)30cycles；72℃，2min。
18、取5个酶切反应管，分别标记为“T”、“P1”、“N1”、“P2”、“N2”，分别加入17μl纯水和1μl Alw26 I酶，再依次分别加入“T”、“P1”、“N1”的PCR产物、阴性对照2、阳性对照2各2μl。
19、在37℃水浴中保温1小时。
20、制备2％的琼脂糖凝胶，将上述5管产物各取2μl上样，60mA稳流电泳1小时。
21、在凝胶成像系统中对凝胶进行拍照并保存图象文件。
权利要求
1.检测药物性耳聋易感基因的方法，该方法包括以下步骤(A)利用PCR扩增体外微量组织样品中线粒体12s rRNA基因片段；(B)用限制性内切酶Alw26 I消化PCR反应产物(801bp的DNA片段)；(C)用RFLP法分析酶切片段，其中12s rRNA基因1555位点为A的样品显示长度分别为321bp和480bp的2条带，而1555位点为G的样品显示长度为801bp的1条带。
2.根据权利要求1的方法，其中微量组织样品包括微量血、毛发或上皮组织样品。
3.根据权利要求1的方法，其中控制PCR反应体系，使之符合以下条件之一、之二或之三A、模板DNA在反应体系中的用量为50-100ng；B、反应循环数为20-30；C、引物在反应体系中的用量为5-25pmol。
4.根据权利要求2的方法，其中控制PCR反应体系，使之符合以下条件之一、之二或之三A、模板DNA在反应体系中的用量为50ngB、反应循环数为25；C、引物在反应体系中的用量为25pmol。
5.根据权利要求3的方法，其中控制PCR反应体系，使之同时满足条件A、B和C。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(A)的PCR反应体系包括50ng模板DNA，25pmol引物，200μMdNTPs，2.5UTaq酶，50μl反应体积，25个反应循环。
7.根据权利要求1-5的任一项的方法，其中步骤B的酶切反应体系的设置为2-4U酶，优选2U酶，37℃，消化1-2小时，优选1小时。
8.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中微量组织样品预先进行DNA的提取，包括以下步骤将微量样品与纯化树脂混和，室温下放置，离心，收集沉淀；用DNA结合液悬浮，混匀，离心，收集沉淀；用DNA漂洗液漂洗，混匀，离心，收集沉淀；用无水乙醇悬浮，离心，去除乙醇，用离心纯化柱洗脱，收集纯化液体。
9.检测药物性耳聋易感基因的试剂盒，包括PCR反应体系和Alw26 I酶切反应体系，其中PCR反应体系包括DNA纯化树脂，DNA结合液，DNA漂洗液，离心纯化柱，PCR扩增引物，阴性对照模板DNA，阳性对照模板DNA；酶切反应体系可以包括Alw26 I内切酶，阴性对照DNA，阳性对照DNA，和DNA分子量标准。
全文摘要
本发明涉及用RFLP法检测人体组织微量样品中线粒体12srRNA基因突变的方法，包括以下步骤(A)利用PCR扩增体外微量组织样品中线粒体12srRNA基因；(B)用限制性内切酶Alw26I切割PCR反应产物801bp的DNA片段；(C)用RFLP法分析切割片段，其中12srRNA基因1555位点为A的样品显示长度分别为321bp和480bp的2条带，而1555位点为G的样品显示长度为801bp的1条带。
文档编号C12Q1/68GK1624154SQ20031011687
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月1日 优先权日2003年12月1日
发明者魏宏泉, 唐晓琳, 林岳, 沈岩 申请人:北京诺赛基因组研究中心有限公司