专利名称：中国汉族人血管内皮生长因子基因重组、表达、纯化及其医学应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中人体基因的重构后表达、纯化方法，特别是人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组、表达和纯化；在肝癌医学诊断、治疗方面的应用。
背景技术：
恶性肿瘤转移是一个连续、复杂、多因素参与的多阶段过程。血管生成是肿瘤生长、发生转移的关键。VEGF是目前已知最强的血管生成因子之一。VEGF在许多动物及人类肿瘤均有表达，研究表明，循环血中VEGF高表达是确定HCC转移复发的有效指标。有人将肝癌患者分为高转移倾向组和低转移倾向组，同时检测VEGF表达水平，前者显著高于后者，也说明VEGF高表达与肝癌转移复发密切相关。临床测定肝癌患者外周血VEGF含量对于早期预测、判别肿瘤的复发转移非常有效。
发明内容
为了稳定地获得足量的蛋白，同时为制备用于研究蛋白的高效的抗VEGF抗体，本发明的发明人通过基因重组的方法，获得了重组人VEGF基因，为了加强其抗原性，发明人同时稳定、高效的表达了人重组VEGF蛋白。
本发明的目的是提供上述汉族人基因重组VEGF基因、表达和蛋白纯化的方法。同时揭示的血浆VEGF含量和组织含量与肝癌复发转移、早期预测的内在关系。
本发明的技术方案为克隆、重组、表达纯化人VEGF蛋白的方法，包括以下步骤(1)克隆人VEGF的基因，用反转录PCR法扩增VEGF的基因；(2)将上述扩增的VEGF基因与克隆载体连接，构建人VEGF克隆质粒；(3)将上述人VEGF克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)表达人VEGF基因a、将上述带有人VEGF基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基(含抗生素)培养瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌。
(5)纯化人VEGF蛋白a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人VEGF；d、用离子交换和镍柱层析法进行纯化。
本发明专用引物的序列为引物1 5′GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG 3′引物2 5′GGCTCCTTCCTCCTGCCCGGCTC 3′
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为人VEGF基因表达的蛋白电泳(SDS-PAGE)2，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳分析呈现一条带具体实施方式
一、人VEGF基因cDNA的获得1、取肝癌组织200毫克，采用美国Promega公司生产的TrizolRNA抽提试剂盒推荐方法提取总RNA，将总RNA走变性胶，确认总RNA的质量可靠；2、设计引物如下引物1 5′GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG 3′引物2 5′GGCTCCTTCCTCCTGCCCGGCTC 3′3、将上述总RNA为模版，反转录合成人VEGF的cDNA，PCR扩增，PCR反应体系参照文献(Scarf S.J.，In PCR ProtocolA Guide toMethod and Application，and ed.New York，Academic Press，USA 1990)进行，反应条件为94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃保温10分钟4、PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收；二、构建VEGF基因克隆质粒1、将PCR产物用胶回收纯化。
2、将A-T克隆载体(任何克隆载体均可以，如T-easy，pGEX等)和PCR产物连接，连接反应体系如下A-T克隆载体 1ul5x连接缓冲液 2ulT4 DNA连接酶 1ulPCR产物 4ulH2O 2ul以上混合物在16℃连接反应12小时；3、将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，涂布含氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆，用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA进行测序。将测序结果和基因库(genbank)发表的序列进行基因同源性比较，证实基因序列正确无误。
三、表达质粒pQE30-VEGF的构建1、将上述克隆载体中人VEGF的基因片段用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切下，经1％琼脂糖电泳，回收VEGF基因片段；2、将上述基因片段与相同酶切的pQE30表达载体(表达载体也可为其它载体如pET，pGST等)连接，连接反应体系如下pQE30(BamHI，HindIII酶切后) 1ul5x连接缓冲液 2ulT4 DNA连接酶 1ulVEGF基因片断 5ulH2O 1ul以上混合物在16℃连接反应12小时3、将连接产物转化M15感受态细胞，涂布卡那霉素和青霉素LB板，挑取阳性克隆；4、用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用BamHI和HindIII双酶切鉴定出重组质粒pQE30-VEGF含有VEGF基因片断。
四、pQE30-VEGF在大肠杆菌中的表达1、将筛选出的带有重组质粒pQE30-VEGF基因工程菌接种10ml LB(含卡那霉素和氨苄青霉素)试管内，37℃，300r/min摇床培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时终止培养。
2、将上述10ml菌液放入装有1000ml LB培养基(含卡那霉素和氨苄青霉素)的培养瓶中，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值，当其OD值为0.6-0.8时，向菌液内加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；
3、收集细菌，以5000转/分，4℃，离心20分钟，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃冻溶，并取样品用SDS-PAGE分析，如图1所示。
五、VEGF的分离纯化1、用超声破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使细菌裂解，4℃条件下12,000r/min离心10min，沉淀重悬于30ml基础缓冲液(8M尿素，10mM Tris，pH 8.0)。12,000r/min离心20min，取上清液；2、上清液经DEAE离子交换层析分别以基础液加100mM、200mM、400mM NaCl进行洗脱。各组分经12.5％SDS-PAGE分析。含所需蛋白的组分进行Ni-NTG-His柱亲和层析，分别以基础液加15mM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脱。将收集的各组份作12.5％SDS-PAGE分析。
如图2所示，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳分析呈现一条带。
在上述实施例中，表达质粒的构建还可以用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人VEGF克隆质粒DNA为模板，将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。
权利要求
1.一种表达纯化人VEGF基因和重组VEGF的方法，其特征在于包括以下步骤(1)克隆人VEGF的基因，用反转录PCR法扩增VEGF的基因；(2)将上述扩增的VEGF基因与克隆载体连接，构建人VEGF克隆质粒；(3)将上述人VEGF克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)表达人VEGFa、将上述带有人VEGF基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，接种LB培养基培养瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)纯化人VEGF蛋白。a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、超声裂解细菌，离心，将沉淀加8M尿素悬浮，离心，取上清液；c、纯化人用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。
2.根据权利要求1所述的表达纯化重组人VEGF基因和方法，其特征在于所述反转录PCR法扩增VEGF的基因和VEGF所用的引物为引物1 5′GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG 3′引物2 5′GGCTCCTTCCTCCTGCCCGGCTC 3′
3.VEGF血浆和组织含量与肝癌早期诊断和复发转移过程的相关性1).定量检测肝癌患者外周血中VEGF浓度是协助诊断肝癌的参考指标，其临界值为＞220pg/ml。2).治疗前检测周围血中VEGF的水平能够作为预测肝癌复发转移的较好的指标；其值为＞500pg/ml若超过此值预示肝癌复发和转移。3).治疗前外周血VEGF高水平的肝癌患者可考虑在介入或手术等局部治疗前后给与系统化治疗，预防其转移的发生，以期提高治愈率。
全文摘要
本发明涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及VEGF蛋白及其类似物、衍生物在肝癌临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的中国汉族人肝癌组织RNA，用PCR方法获得人VEGF基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取VEGF蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步观察肿瘤病人体内VEGF水平的变化，奠定了物质基础。
文档编号C12Q1/68GK1629304SQ20031011686
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者胡敬群, 杨建国 申请人:胡敬群, 蔡建强, 赵平