专利名称：人神经系统特异表达基因bri的制作方法
技术领域：
本发明为利用酵母双杂交技术筛选人神经系统特异表达蛋白BRI3的相互作用蛋白，在此基础上发现了BRI3的新的生物学功能，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。
背景技术：
FBD(Familial British Dementia)和FDD(Familial Danish Dementia)是两种和阿尔茨海默病相类似的家族性痴呆症，其致病基因及相应的分子生物学机制最近得到阐明。这两种疾病都是由BRI2基因的突变造成的。BRI2基因编码蛋白是整合型膜蛋白BRI蛋白家族的一个成员，该蛋白家族至少包括3个成员，即BRI1，BRI2和BRI3。BRI1基因主要在成骨和软骨形成组织、皮肤表达，在心脑的表达量极低。BRI2基因在人和小鼠的各个组织都有表达，在心脏、胎盘、肾和胰腺的表达水平较高。Northern结果显示，BRI3基因主要在脑表达，特别是在大脑皮层、延脑、杏仁核、海马、丘脑、尾状核和脊髓高表达。目前，没有任何有关BRI家族蛋白亚细胞定位和生物学功能方面的研究报道。
本实验方法是利用酵母双杂交体系寻找BRI3蛋白在体内环境中可能的作用配体，研究该蛋白质在神经系统中的正常生理功能。并试图在此基础之上，进一步揭示其与神经突起生长和神经退行性疾病的关系。
发明目的利用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库，获得了与BRI3的N端相互作用的全长SCG10蛋白。在此基础上利用GST pull-down实验和亚细胞定位实验进一步验证二者的相互作用。
利用体外微管组装/去组装实验，进一步研究BRI3对SCG10引起的微管去组装(解聚)过程的影响。通过体内过表达实验研究BRI3和SCG10对PC12细胞微管组织的影响。对BRI3蛋白正常生理功能的阐述，为深入了解该蛋白在神经元发育、可塑性、老化及退化过程中的作用奠定了基础。
内容与要求揭示BRI3在神经细胞中的功能。应用RT-PCR、分子克隆、酵母双杂交、基因表达与蛋白纯化、蛋白体外相互作用、细胞免疫组化、原位杂交、哺乳动物细胞转染等生物化学和分子生物学技术，获得了与BRI3的N端相互作用的SCG10蛋白的全长cDNA克隆。在验证相互作用的基础上，对其抑制微管去组装过程的生物学活性进行了鉴定。通过原位杂交和细胞免疫组化对其组织表达谱和亚细胞定位进行了表达分析。
该方法及发现的新基因/蛋白质达到的技术指标为1.成功地利用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库，获得了与之相互作用的、编码SCG10蛋白的全长cDNA。
2.在此基础上利用GST pull-down和细胞共定位实验进一步验证了二者的相互作用。
3.对小鼠的中枢神经系统组织切片和整体胚胎进行原位杂交分析，证实了mBRI3在中枢神经系统的特异性分布及神经元高表达。
4.体外微管组装/去组装实验，证实BRI3能够抑制由SCG10引起的微管去组装(解聚)现象，并且呈现量效关系。
5.体内过表达实验研究BRI3和SCG10对PC12细胞微管组织的影响，结果表明BRI3能够拮抗SCG10对细胞微管的崩解破坏作用，具有稳定细胞微管结构的功能。
6.BRI3蛋白可能具有稳定细胞微管结构的功能，可用于某些神经系统退行性疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于治疗退行性疾病的新药的设计与开发。
图1.BRI3(N)初步筛选阳性克隆的β-半乳糖苷酶活性检测图2.阳性克隆(108#)的β-半乳糖苷酶活性检测ASFY526(pAS2-1-BRI3(N)+108#)BSFY526(pAS2-1+108#)CSFY526(108#)图3.Western Blot检测BRI3多克隆抗体的反应性和特异性1HeLa细胞裂解液2SH-SY5Y细胞裂解液M蛋白预染Marker图4.Western blot检测ΔSCG10蛋白与SH-SY5Y细胞内源BRI3蛋白的体外结合1SH-SY5Y细胞裂解液(positive control to indicate the position of BRI3)2从GST-ΔSCG10蛋白柱上收集到的SH-SY5Y细胞裂解液成分3从GST蛋白柱上收集到的SH-SY5Y细胞裂解液成分图5.BRI3和SCG10在SH-SY5Y细胞中的共定位A瞬时表达GFP-BRI3蛋白的SH-SY5Y细胞B瞬时表达RFP-SCG10蛋白的SH-SY5Y细胞C图象A和B的叠加(Bar＝10μm)图6.mBRI3mRNA在大小鼠脑组织中的表达分布A，BmBRI3mRNA在小鼠小脑(cerebellum)的明显分布CmBRI3mRNA在小鼠海马(hippocampus)齿状回(dentate gyrus)的高表达DmBRI3mRNA在小鼠大脑皮层(cerebrum cortex)中的分布EmBRI3mRNA在小鼠蒲根野细胞层(purkenje cell)的高表达FmBRI3mRNA在小鼠桥脑(pons)面神经核(facial nucleus)中的分布GmBRI3mRNA在小鼠颞叶皮层(temporal cortex)中的分布HmBRI3mRNA在大鼠海马(hippocampus)齿状回(dentate gyrus)的高表达
LmBRI3mRNA在大鼠脊髓(spinal cord)前角神经元的明显表达MmBRI3mRNA在大鼠大脑皮层顶叶(parietal)的分布图7.小鼠整体胚胎原位杂交AmBRI3mRNA在16.5天的小鼠胚胎中的表达分布BmBRI3mRNA在10天的小鼠胚胎中的表达分布图8.从猪脑提取的微管蛋白的SDS-PAGE结果1，2，3猪脑微管蛋白(～55kDa)M低分子量蛋白Marker图9.比浊法研究微管蛋白的体外组装/去组装A温度升高过程中，微管蛋白随时间变化的吸光度曲线B加入SCG10蛋白后，微管蛋白在温度升高过程中随时间变化的吸光度曲线C加入SCG10蛋白后，微管蛋白在37℃随时间变化的吸光度曲线D加入BRI3和SCG10蛋白后，微管蛋白在温度升高过程中随时间变化的吸光度曲线E加入BRI3和SCG10蛋白后，微管蛋白在37℃随时间变化的吸光度曲线图10.体内过表达实验研究BRI3和SCG10对PC12细胞微管结构的影响A未转染正常PC12细胞的微管结构BBRI3的过表达对PC12细胞微管结构的影响CSCG10的过表达对PC12细胞微管结构的影响DBRI3和SCG10的共同过表达对PC12细胞微管结构的影响(Bar＝16μm)图11.BRI3和SCG10对NGF诱导的PC12细胞突起生长的影响实施例1.应用RT-PCR技术扩增人和小鼠的BRI3cDNA首先利用GIBCO公司的TRIZOL试剂成功提取了人胎脑和鼠脑的总RNA。以RNA为模板，采用GIBCO公司SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒合成了人胎脑和鼠脑组织的cDNA。参照BRI3cDNA的5’和3’端序列，设计合成如下四条引物5’-gaattccgcgggccggcgcagccatg-3’和5’-ctcgagggggttctgggggaggaggg-3’(人)；5’-aagcttgatccaaacttccggtgcctgc-3’和5’-gaattcccactaccatggagcacccaagtc-3’(鼠)。以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增。
2.BRI3cDNA的克隆及测序经PCR扩增后的目的片段经琼脂糖凝胶电泳切胶回收后，连接到pGEM-T载体，对酶切鉴定的阳性克隆进行序列测序。测序结果显示，我们所获得的hBRI3与mBRI3cDNA序列与NCBI公布的序列完全一致。
3.抗hBRI3多克隆抗体的制备利用纯化的GST-BRI3(N)蛋白免疫新西兰大白兔。实验采用背部多点皮内注射的方法，第一次免疫使用完全弗氏佐剂，然后每隔两周使用不完全佐剂对实验组进行加强免疫。从第二次免疫后开始，在每次免疫后一周由耳缘静脉取血和分离血清，ELISA检测抗体滴度。Western Blot检测抗体特异性(图3)。
4.酵母双杂交筛选与BRI3相互作用的蛋白质分子用400-500ug人胎脑pACT2文质粒转化带有诱饵质粒pAS2-1-BRI3(N)的酵母菌株Y190，铺于SD/-Leu/-Trp/-His+5mM 3-AT平板上，共得到转化子约2.8～5.0×106。转化子总数接近或大于胎脑文库的独立克隆数，可满足筛库要求。
30℃培养3-4天，菌落开始在SD/-Leu/-Trp/-His+5mM 3-AT培养基上陆续出现。7-10天时，少数菌落直径大于2mm，颜色粉红或乳白，认为属于阳性。将符合上述条件的克隆，用牙签点种于划格的新鲜SD/-Leu/-Trp/-His+5mM 3-AT平板上。经48小时培养后，印迹到滤纸上进行β-半乳糖苷酶活性检测(图1)。结果得到29个Trp+/Leu+/His+/LacZ+阳性克隆。
5.阳性克隆的验证将初筛得到的酵母阳性克隆涂布在含放线菌酮的SD/-Leu/-His平板上，长出的克隆是只含有AD质粒的阳性酵母菌。提酵母质粒，电转化大肠杆菌DH5α，铺于氨苄青霉素平板上。提大肠杆菌质粒，在酵母SFY526中进行双转验证。
6.阳性克隆的测序结果及同源性比较将阳性克隆全部进行了序列测定，然后借助DNAMAN软件对所得到的cDNA序列进行了编码蛋白的预测。用BLASTP软件对氨基酸的同源性进行比较发现，我们所获得的108#克隆的cDNA序列与神经元特异表达的、与生长相关的、stathmin蛋白家族的一个成员——SCG10(superior cervical ganglia，neural specific 10；stathmin-like 2)的全编码序列完全相同。SCG10蛋白由N端34个氨基酸组成的膜结合结构域和C端的stathmin结构域构成。
7.BRI3和SCG10的体外结合验证我们先将GST-tagged-ΔSCG10蛋白或GST蛋白挂柱(Gluathione Sepharose 4B)，然后再与含BRI3蛋白的SH-SY5Y细胞的细胞裂解液孵育结合，经漂洗后，用谷胱苷肽洗脱法分别收集结合到柱床上的蛋白，最后再利用anti-BRI3的多克隆抗体对所收集的样品进行Western blot检测(图4)。
8.BRI3和SCG10蛋白在真核细胞中的共定位将纯化的pEGFP-N1-BRI3和pDsRed-N1-SCG10质粒对SH-SY5Y细胞进行共转染，转染后的细胞经固定、透化和封片处理后，利用激光共聚焦显微镜进行观察和照相，结果显示，两种蛋白均定位于细胞核周缘的一个区域。将发绿色荧光的BRI3的图象(图5A)与发红色荧光的SCG10的图象(图5B)进行叠加后，两种荧光基本上完全重叠，呈现黄色荧光(图5C)，从而表明GFP-BRI3和RFP-SCG10蛋白在SH-SY5Y细胞中呈共定位关系。
9.猪脑微管蛋白的提取采用阴离子交换树脂(DE52 cellulose)纯化和温度循环相结合的方法，从新鲜猪脑中提取得到3～4mg/ml的微管蛋白，纯度高达95％以上(图6)。
10.比浊法研究BRI3对SCG10引起的微管解聚过程的影响微管蛋白在温度升高(4℃→37℃)过程中发生聚合反应，反应体系吸光值升高。SCG10蛋白能抑制这一反应的发生。将一系列浓度(0，10，20，30μM)的GST-tagged-BRI3(N)蛋白与10μMHis-tagged-ΔSCG10事先混合，分别加入到反应体系中，观察微管蛋白随时间变化的吸光度曲线(图7D)。
微管蛋白在37℃时处于聚合状态，SCG10蛋白能促进聚合状态微管的解聚，导致反应体系吸光值降低。将一系列浓度(0，10，15，20，25，30μM)的GST-tagged-BRI3(N)蛋白与10μMHis-tagged-ΔSCG10事先混合，分别加入到反应体系中，观察微管蛋白随时间变化的吸光度曲线(图7E)。
11.体内实验研究BRI3的过表达对SCG10引起的微管解聚过程的影响为了在活细胞体系中，进一步了解BRI3对SCG10引起的微管解聚过程的影响，将纯化的pDsRed-N1-BRI3、pDsRed-N1-SCG10或pDsRed-N1-BRI3和pDsRed-N1-SCG10质粒分别转染PC12细胞，48小时后，对细胞进行固定、透化和封闭处理，并用特异标记细胞微管结构的抗体(anti-β-tubulin)对细胞进行一抗孵育，随后进行FITC标记的二抗的孵育。最后利用激光共聚焦显微镜进行观察和记录。
12.利用原位杂交技术对BRI3基因mRNA水平上的表达谱进行分析设计如下引物5’-atgaagagccgggccgccct-3’和5’-gaattcccactaccatggagcacccaagtc-3’，将小鼠BRI3基因3’非编码区的长为300bp的特异探针用PCR方法扩增出来，连入pGEM-T载体中(插入片段的上游和下游分别有T7和SP6启动子，可用T7和SP6转录酶进行体外转录)。PCR鉴定发现mBRI3片段反向插入，即，T7转录的RNA是可识别mBRI3mRNA的反义探针，而SP6转录的RNA是可作阴性对照的正义探针。首先将转录模板线形化，分别用SalI和EcoRI处理质粒模板，所得的片段可分别用T7和SP6转录酶在体外进行转录。用T7 RNA聚合酶转录的非同位素DIG标记的cRNA探针，在大、小鼠脑组织切片和小鼠整体胚胎上进行原位杂交。
13.BRI3和SCG10对NGF诱导的PC12细胞突起生长的影响为了研究BRI3和SCG10对神经细胞突起生长的影响，将纯化的pDsRed-N1-BRI3、pDsRed-N1-SCG10或pDsRed-N1-BRI3和pDsRed-N1-SCG10质粒分别转染PC12细胞，24小时后，加入100ng/ml的NGF诱导PC12细胞分化。分别统计诱导后48小时和72小时，不同组的细胞突起生长情况。重复3次，每次统计至少100个细胞。结果代表了3次实验的平均值±S.D.。
权利要求
1.本发明涉及利用酵母双杂交技术筛选人神经系统特异表达蛋白BRI3的相互作用蛋白。筛选得到的阳性克隆之一编码全长的SCG10(superiorcervical ganglia，neuralspecific 10)蛋白。基于二者的相互作用，本发明阐释了BRI3的生物学功能。
2.根据权利要求1所述之BRI3基因/蛋白，其特征在于该基因的表达具有组织特异性，即该基因主要在脑表达，在大脑皮层、海马齿状回、杏仁核和脊髓的神经元高表达。
3.根据权利要求1、2所述之BRI3基因/蛋白，其特征在于该基因编码蛋白通过与SCG10蛋白的相互作用，在神经元细胞的微管组装与去组装过程中发挥作用，具有稳定细胞微管结构的生物学功能。
4.根据权利要求1、2、3所述之BRI3基因/蛋白，其特征在于该基因编码蛋白通过与SCG10蛋白的相互作用，抑制神经生长因子NGF诱导的PC12细胞的神经突起生长。
5.根据权利要求1、2、3、4所述之BRI3基因/蛋白，其特征在于某些神经退行性疾病与神经细胞骨架的异常、神经细胞突起生长的异常有关。因此，BRI3基因/蛋白可用于某些神经系统退行性疾病的基因诊断和基因治疗，还可用于治疗退行性疾病的新药的设计与开发。
全文摘要
本发明涉及神经系统特异表达的、BRI蛋白家族的一个成员BRI
文档编号C12N15/63GK1632118SQ20031012242
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月23日 优先权日2003年12月23日
发明者袁建刚, 强伯勤, 彭小忠, 吴静, 池志凯, 谈昕煜 申请人:中国医学科学院基础医学研究所