专利名称：用于预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒及所用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒及所用引物。更具体讲，本发明涉及利用精神分裂症易感基因COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA的六个单核苷酸多态性(SNP)位点组合，设计的预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA四个基因在制备预测偏执型精神分裂症易感性的诊断剂中的应用，及对偏执型精神分裂症的预防和治疗的指导作用。
背景技术：
精神分裂症是最严重的精神疾病之一，其终身患病率高达1％。这样大的患病群体，不仅给家庭和社会带来沉重的经济负担，而且还严重威胁社会的安全和稳定。因此，确定精神分裂症的病因，建立有效的防治方法，已成为整个医学界乃至整个社会需迫切解决的问题。
大量流行病学资料表明，精神分裂症是一种具有明显遗传倾向的复杂多基因疾病，但其致病机理尚未阐明。最初，许多研究者致力于通过应用筛选单基因病致病基因的方法——定位克隆，来寻找精神分裂症易感基因，即寻找患病家系成员间共享的染色体DNA区域间的连锁，发现本病与包括染色体3p26-24，5p13，6q24-22，8p22-21，9p23，13q14-32，20p12，和22q12-13在内的许多位点都有一定的连锁关系。这进一步证实了本病是一种多基因疾病。但是，单纯利用定位克隆的策略来确定多基因病易感基因的成功报道还很少，目前对多基因病的易感基因研究还有一种方法——候选基因法，即直接研究疾病候选基因的变异与疾病之间的关系，主要基于对病例-对照的关联分析。关联分析不需要大的家系研究，而是比较某个或某一套标记在患者和正常个体的分布程度。某种标记如果在患者个体中分布十分明显，那么就可以认为该标记与疾病表型相关联。由于绝大多数多基因病(包括精神分裂症)很可能并非一个基因缺陷所致，而是多个微效基因联合作用的结果，因此，在做关联分析时，不能只观察某一个基因或某一个遗传标记在病例和对照两组人群中的分布，还应更进一步地分析不同基因型组合的分布情况。在候选基因法中，对候选基因的选择比较关键，一般主要针对与复杂疾病发生发展相关的一些通路上的基因进行研究。具体到精神分裂症，一些重要神经递质的通路成为研究的热点。
几十年来“多巴胺(DA)功能亢进假说”一直在精神分裂症发病机理研究中占主导地位。其最基本的观点是皮层下多巴胺能神经传递过度导致精神分裂症症状。在临床所使用的各种高效价抗精神病药物，大多是强有力的DA受体阻滞剂。另一方面，一些可以增加受体部位局部DA含量的药物(如苯丙胺)，可诱发类精神分裂症的症状。高香草酸(HVA)是DA的主要代谢产物之一，它在精神分裂症患者的血浆、脑脊液中均较正常人升高。另外，对脑组织DA受体结合力、密度的测定及脑成相技术CT、核磁共振成像(Magneticresonance imaging，MRI)、正电子发射断层扫描(Positron emission tomography，PET)的应用，均从不同角度证实了精神分裂症发病的“DA功能亢进假说。”本发明人对精神分裂症发病与DA功能的关系比较感兴趣，因此进行了DA代谢通路与精神分裂症之间的关系研究。基本策略是在精神分裂症患者和正常对照两组人群中，对DA代谢途径上涉及的酶的基因进行系统地单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)检测，然后用这些SNP数据进行关联分析，来寻找易感的SNP型组合。在DA代谢通路上一共涉及58种代谢酶，其中可在美国国家生物技术信息中心(National center for biotechnologyinformation，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查到人基因序列的有23种。本发明在83个偏执型精神分裂症患者和108个正常对照中，对这23个基因中的85个已知SNPs进行了检测，最终发现了四个偏执型精神分裂症的易感基因(即COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA基因)，以及这四个基因上的6个与中国北方汉族人偏执型精神分裂症相关的SNPs位点及它们之间的组合作用。由此经过深入研究完成了本发明。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒，所述试剂盒包含基于SEQ ID NO15-21的序列设计的用于PCR扩增的特异引物以及通过核酸扩增进行检测的试剂盒所含的常规组件。所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18-26个核苷酸。优选地，所述引物选自SEQ IDNO1-14组成的一组。
根据本发明的另一方面，提供了用于预测偏执型精神分裂症易感性的引物，所述引物为基于SEQ ID NO15-21的序列设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18-26个核苷酸。优选地，所述引物选自SEQ ID NO1-14组成的一组。
根据本发明的再一方面，提供了COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA基因作为偏执型精神分裂症易感基因在制备用于精神分裂症诊断的诊断剂中的应用。COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO15-18所示。
本发明的另一目的在于，揭示COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA基因在偏执型精神分裂症发生中重要作用的同时，指导偏执型精神分裂症的预防和治疗。
图1示出本发明所检测的DA代谢通路上所涉及的58个代谢酶1.1.1.1.1Alcohol dehydrogenase；ADH2.1.1.1.222(R)-4-Hydroxyphenyllactate dehydrogenase；3.1.1.1.237Hydroxyphenylpyruvate reductase；4.1.1.1.90Aryl-alcohol dehydrogenase；5.1.10.3.1Catechol oxidase；6.1.11.1.8Iodide peroxidase；TPO7.1.13.11.153，4-Dihydroxyphenylacetate 2，3-dioxygenase；8.1.13.11.274-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase；9.1.13.11.29Stizolobate synthase；10.113.11.30Stizolobinate synthase；11.1.13.11.4Gentisate 1，2-dioxygenase；12.1.13.11.5Homogentisate 1，2-dioxygenase；HGD13.1.14.13.184-Hydroxyphenylacetate 1-monooxygenase；14.1.14.13.34-Hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase；15.1.14.13.41Tyrosine N-monooxygenase；16.1.14.13.42Hydroxyphenylacetonitrile 2-monooxygenase；17.1.14.16.2Tyrosine 3-monooxygenase；18.1.14.17.1Dopamine beta-monooxygenase；DBH19.1.14.18.1Monophenol monooxygenase；TYR
20.1.2.1.16Succinae-semialdehyde dehydrogenase(NAD(P)+)；21.1.2.1.29Aryl-aldehyde dehydrogenase；22.1.2.1.454-Carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase；23.1.2.1.5Aldehyde dehydrogenase(NAD(P)+)；ALDH24.1.2.1.534-Hydroxyphenylacetaldehyde dehydrogenase；25.1.2.1.605-Carboxymethyl-2-hydroxymuconic-semialdehyde dehydrogenase；26.1.2.3.1Aldehyde oxidase；27.1.4.3.2L-Amino-acid oxidase；28.1.4.3.4Amine oxidase(flavin-containing)；MAO29.1.4.3.6Amine oxidase(copper-containing)；DAO30.1.4.99.4Aralkylamine dehydrogenase；31.2.1.1.25Phenol O-methyltransferase；32.2.1.1.27Tyramine N-methyltransferase；31.2.1.1.28Phenylethanolamine N-methyltransferase；34.2.1.1.6Catechol O-methyltransferase；COMT35.2.3.1.14Glutamine N-phenylacetyltransferase；36.2.3.1.140Rosmarinate synthase；37.2.4.1.178Hydroxymandelonitrile glucosyltransferase；38.2.6.1.1Aspartate transaminase；GOT39.2.6.1.49Dihydroxyphenylalanine transaminase；40.2.6.1.5Tyrosine transaminase；TAT41.2.6.1.57Aromatic-amino-acid transaminase；42.2.6.1.9Histidinol-phosphate transaminase；43.3.7.1.2Fumarylacetoacetase；FAH44.3.7.1.5Acylpyruvate hydrolase；45.4.1.1.25Tyrosine decarboxylase；46.4.1.1.28Aromatic-L-amino-acid decarboxylase；DDC47.4.1.1.62Gentisate decarboxylase；48.4.1.1.685-Oxopent-3-ene-1，2，5-tricarboxylate decarboxylase；49.4.1.99.2Tyrosine phenol-lyase；50.4.3.1.11Dihydroxyphenylalanine ammonia-lyase；51.4.3.1.5Phenylalanine ammonia-lyse；52.5.2.1.2Maleylacetoacetate isomerase；GSTZ53.5.2.1.4Maleylpyruvate isomerase；54.5.3.2.1Phenylpyruvate tautomerase；PPT55.5.3.3.105-Carboxymethyl-2-hydroxymuconate delta-isomerase；56.5.4.3.6Tyrosine 2，3-aminomutase；57.6.2.1.30Phenylacetate--CoA ligase；图2示出本发明所检测的SNPs位点及其附近DNA序列2ACOMT基因rs174682位点(K)的上下游部分序列，K代表G/T多态性；2BALDH3B1基因rs581105位点(K)的上下游部分序列，M代表A/C多态性；2CADH1B基因rs1042026(R1)、rs1789882(R2)、rs1229982(K3)和rs1229984(R4)四个位点的上下游部分序列，Y1、R2、K3、Y4分别代表T/C、G/A、T/G和C/T多态性；2DMAOA基因rs1801291位点(Y)的上下游部分序列，Y代表T/C多态性。
具体实施例方式
定义单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。
疾病易感性(精神分裂症易感性)人群对疾病(精神分裂症)容易感受的程度。
病例-对照关联分析是一种由因及果的回顾性研究。它是先按疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差异而获得该标志与疾病间关联的信息。
为在DA代谢通路上寻找偏执型精神分裂症易感基因，本发明人先自“京都基因及基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库”(http://www.genome.ad.jp/kegg)查找到DA代谢通路上所涉及的所有58个代谢酶名称，接着采用生物信息学方法在NCBI中查找这些酶的基因序列，共查找到23个有人类基因序列的代谢酶。通过NCBI的SNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)，在这23个基因中选择了85个SNPs位点，通过PCR扩增结合限制性内切酶酶切或测序的方法，对上述SNPs位点在病例组和对照组进行检测，获得个体基因型，并进行病例-对照关联分析。SNP的信息可通过生物信息学方法从公共数据库中获取。目前有多个公共数据库储存了几百万条SNP信息，并有许多生物医学网站开辟了专门的SNP网页，人们可以很方便地通过多种方式，如以基因名、登记号、染色体号、功能级别等，进行查寻。但是，这些数据库中的SNPs绝大多数只是“候选者”，是利用计算机在对多个克隆序列进行比对时发掘出来的，而非经过验证的真正SNPs，其中必然存在一部分假阳性SNPs。如以下实施例所详细讨论的，所选择的85个SNPs位点中只有58个在病人组(83人)和对照组(108人)中有多态性，在这58个SNPs位点中，发现[COMT(rs174682)，ALDH3B1(rs581105)]＝[(T/G)，(A/C)]和[ADH1B(rs1042026)，ADH1B(rs1789882)，ADH1B(rs1229982)，ADH1B(rs1229984)]＝[(T/C)，(G/G)，(G/G)，(T/T)]与偏执型精神分裂症发病的高风险相关；[性别，MAOA(rs1801291)]＝[男性，(T/C)]和[COMT(rs174682)＝[(G/G)]与偏执型精神分裂症发病的低风险相关。进一步得出结论，这6个SNPs位点所在的COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA四个基因为中国北方汉族人偏执型精神分裂症的易感基因。
因此，本发明的一个方面涉及偏执型精神分裂症易感基因COMT、ALDH3B1、ADH1B和MAOA四个基因在预测精神分裂症易感性中的应用。基于这四个基因，可以获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测精神分裂症的易感性。
COMT的基因组序列见NCBI数据库中NT 011519.10的3087059-3109080位核苷酸，全长22022bp，本发明所揭示的SNP位点rs174682位于该序列的第3000-4000位核苷酸，其上下游的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。图2A示出COMT基因的部分基因组序列，其中K为SNP位点，其代表碱基G/T多态性，即该位点可以为G，也可以为T。
ALDH3B1的基因组序列见NCBI数据库中NT 033903的12950859-12969783位核苷酸，全长18924bp，本发明所揭示的SNP位点rs581105位于该序列的第12958597位核苷酸，其上下游的核苷酸序列如SEQ ID NO16所示。图2B示出ALDH3B1基因的部分基因组序列，其中M为SNP位点，其代表碱基A/C多态性，即该位点可以为A，也可以为C。
ADH1B的基因组序列见NCBI数据库中NT 016354的24722364-24737262位核苷酸，全长14898bp，本发明所揭示的SNP位点rs1042026、rs1789882、rs1229982和rs1229984分别位于该序列的第24723170位、第24729757位、第24738636位和第24734023位核苷酸，这四个位点上下游的核苷酸序列如SEQ IDNO17-20所示。图2C示出ADH1B基因的部分基因组序列，其中Y1、R2、K3和Y4分别为这四个SNP位点，其分别代表碱基T/C、G/A、T/G和C/T多态性，即Y1位点可以为T，也可以为C；R2位点可以为G，也可以为A；K3位点可以为T，也可以为G；Y4位点可以为C，也可以为T。
MAOA的基因组序列见NCBI数据库中NT 011568的329-13447位核苷酸，全长13118bp，本发明所揭示的SNP位点rs1801291位于该序列的第12781位核苷酸，其上下游的核苷酸序列如SEQ ID NO21所示。图2D示出ADH1B基因的部分基因组序列，其中Y为SNP位点，其代表碱基T/C多态性，即该位点可以为T，也可以为C。
本发明还涉及用于预测精神分裂症的引物。优选地，所述引物基于SEQ IDNO15-21的序列而设计，由此，PCR扩增后的产物经检测可以直接测得SNP位点。当然，本发明的引物也可基于SEQ ID NO15-21的互补序列设计，这样PCR扩增后的产物经检测将得到上述SNPs的互补碱基。本发明的引物的长度可为18-26个核苷酸。优选地，本发明的引物具有SEQ ID NO1-14所示的序列。本领域技术人员能够理解，本发明的引物不限于这些列出的引物及其组合。
本发明进一步涉及包含本发明的一种或多种引物的试剂盒，该试剂盒用于检测精神分裂症的易感性。除了本发明的引物之外，所述试剂盒还包含运用PCR扩增、限制性内切酶酶切和测序而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
根据本发明，可对未表现精神分裂症临床症状的人群进行如实施例所示方法的筛查，[COMT(rs174682)，ALDH3B1(rs581105)]＝[(T/G)，(A/C)]和[ADH1B(rs1042026)，ADH1B(rs1789882)，ADH1B(rs1229982)，ADH1B(rs1229984)]＝[(T/C)，(G/G)，(G/G)，(T/T)]的个体则组成偏执型精神分裂症的易感人群。对此类人群在日常生活中应尽量减少诱发因素，如环境因素的刺激，可降低精神分裂症的发病率。这是本发明的一个重要用途。
根据本发明，可进一步深入研究由于这些易感基因的变异有可能导致的蛋白质产物的结构与功能的缺损或改变，对特定生化通路中生物大分子的相互作用的阻碍或干扰。本发明为进一步检测相关蛋白质功能，开发新型治疗药物，开展基于遗传学背景的个体化药物治疗奠定了基础。
以下将参照实施例进一步描述本发明。这些实施例应视为说明性的而非限制性的。
实施例1 偏执型精神分裂症散发病例样本采集鉴于精神分裂症的临床分型复杂、其本身的异质性及其与相关疾病之间的重叠可能会干扰最终的分析结果，发明人只选用偏执型精神分裂症作为研究对象，并在入组病人时采用了严格的纳入和排除标准，来保证入组样本的相对特异性。
全部病例均采自北京大学精神卫生研究所2000年3月-2001年3月期间住院的北方汉族住院患者，均经过副主任医师以上检查确诊(CCMD-II-R诊断标准)。采用神经精神病学临床评定表(SCAN)对患者进行半定量式精神科检查，所有检查均由受过SCAN培训的发明人完成(具体操作参照SCAN检查手册和说明手册中要求)，并使用配套的CATEGO诊断软件进行诊断，选取同时符合国际疾病分类第十版(ICD-10)中F20有关偏执型精神分裂症的诊断标准，不包括紧张型和单纯型的病人入组。年龄限定16-45岁，发病年龄＜40岁(排除晚发精神分裂症)，性别不限。
排除标准1)脑器质性或躯体疾病所致精神障碍，或体格检查、实验室检查发现有严重的躯体疾病指征、异常生化指标或脑电图(排除癫痫患者)、心电图异常者；2)符合ICD-10中情感障碍和分裂情感障碍诊断标准的患者；3)药物或酒精依赖的患者(排除尼古丁、咖啡因、酒精等影响)；4)有家族性遗传疾病者；5)妊娠或哺乳期妇女；6)有严重自杀自伤倾向的患者；7)严重的兴奋、冲动不合作者；8)一个月内参加过其它科研治疗的患者。
共有83个偏执型精神分裂症患者符合以上条件，他们的相关统计学数据如表1所示。
表1 偏执型精神分裂症散发病例的相关统计学数据Item 数据(x±SD)性别 40.6％(男性)年龄(岁) 24.9±5.9(16-37)首发年龄(岁) 22.7±5.5(16-36)病程(年) 2.2±3.4(0-14)取入组病人每一成员外周血样备用。
实施例2 偏执型精神分裂症核心家系的收集收集中国北方汉族人群中偏执型精神分裂症患者和他们健康父母双亲组成的核心家系(Trios)。患者均谷2000年-2002年间入院，诊断和排除标准与上述散发病例相同。共收集95个符合标准的家系。取所有家系每一成员外周血样备用。
在采集散发病例和家系前，确保所有成员都了解采血目的，即有知情权，血样提供人在了解所有情况并同意后，经其在“知情同意书”上签字后，再实施抽血和其它情况调查。
实施例3 健康对照样本采集全部样本来自医院工作人员和健康献血者，要求身体健康，无严重的躯体疾病，无家族性遗传病史，无现患和既往精神疾病及精神疾病家族史，无药物滥用史。征求本人同意并签署“知情同意书”后，留取其外周血样备用。
实施例4 基因组DNA的提取所有患者、家系成员和健康对照，均单次空腹采集外周静脉血5ml，EDTA抗凝。DNA提取步骤如下①在外周血中加入红细胞裂解液，摇匀后室温静置10分钟，此过程中轻轻摇动数次；②离心(2000rpm，4℃，10分钟)后弃上清，加入RNA酶10u，蛋白酶K 0.25mg，白细胞裂解液10ml，充分混匀后37℃水浴2小时；③加入预冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后离心(3000rpm，4℃，15分钟)，将上清取出，加入异丙醇15ml，轻轻混匀，析出絮状沉淀；④吸出DNA沉淀，用75％的冷乙醇洗两次，吸干乙醇后，加入TE溶液溶解DNA，注明样品编号、所属家系等资料，-20℃保存备用。
实施例5 聚合酶链式反应(PCR)根据所要检测的SNP位点上下游的DNA序列，使用Primer 3软件(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgi)设计引物，在本发明中存在多态性的58个SNPs位点及其上下游引物和PCR退火温度如表2所示。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50ml KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)gelatin，200μM dNTPs，上下游引物各0.4μM，0.5u Taq DNA聚合酶，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃，5min②94℃，30s③退火温度，30s④72℃，30s-1min(第②至第④步骤循环35次)⑤72℃，10min。取PCR产物5μl用2％琼脂糖凝胶电泳，以DNA marker DL 2000为分子量标准品。所扩增片断长度如表2所示。
实施例6 限制性内切酶酶切在PCR扩增后的反应体系中，加入适量相对应的限制性内切酶及其酶切缓冲液，在适当的酶切温度下保温2h。所选用的内切酶名称及反应温度如表2所示。经12％聚丙烯酰胺电泳，根据酶切图谱判断基因型。一般存在三种基因型完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。
表2 检测的58个SNPs位点及相应引物PCR/酶切反应条件基因所在 SNP ID SNP PCR PCR 限制性基因名称 EC编号 引物序列(5′→3′)染色体区域编号*形式 退火温度产物长度内切酶名称ADH1B 1.1.1.1 4q22 rs1693425C/TFACCAGTCGAAAATCCACAGC59℃236bp Hae IIIRTCCTGTCTCATGCCTTTGTGADH1B 1.1.1.1 4q22 rs1042026G/AFTGTGGGGCATTTTATTTGAG58℃235bp Hpy188 IRGAGGGGACCCTTTTACTTGCADH1B 1.1.1.1 4q22 rs1789882G/AFGCCTATCTGCTGTTATGGGC59℃185bp ScrF IRCGAAAAATCCACACCTCCATADH1B 1.1.1.1 4q22 rs1229982G/TFAGGGCGACCTTGTCCTAGAT57℃327bp Fnu4H IRGGCACTGAGACTCACACCAAGADH1B 1.1.1.1 4q22 rs1229984A/GFTGGTGGCTGTAGGAATCTGTC 59℃238bp Msl IRTGTGCAAGCACTTTCGTCTCADH1C 1.1.1.1 4q22 rs1042758A/GFCAGAGCGAAGCAGGTCAAATC 58℃391bp Ssp IRGCTCCTTAACCTTGGGCATAACADH4 1.1.1.1 4q22 rs1800760A/TFTTAAATGGGCGATTCTGAGG58℃402bp Apo IRCTTGCTTACTTTGCCCTTGGADH5 1.1.1.1 4q21-q25 rs1154413A/CFTTGATTTGAACGTCACCCAG59℃224bp Bts IRACTGACGCATATGCAGCTTGADH5 1.1.1.1 4q21-q25 rs1154414T/CFCACCAGCATTGTATGGGAGAT 59℃224bp Psi IRCACAAAGAACCCATCACCACTADH5 1.1.1.1 4q21-q25 rs1154411C/TFACATACTGGCTCATGCTCCC59℃419bp Hae IIIRTGTGTATGGGTTGCAAAGGACADH7 1.1.1.1 4q23-q24 rs729147 A/GFACTCCTCGAGTTCATGCCAC58℃203bp Mwo IRGTTGAAGCGCCTGAAAACATADH7 1.1.1.1 4q23-q24 rs971074 A/GFACTCAGTGGCACCTACAGCC58℃166bp DPn IIRTCCTCTCCACAGGTCAAACCADH7 1.1.1.1 4q23-q24 rs284786 A/TFATGCTGGCAAATAGCCTTGT56℃467bp BSaB IRAAGTCTTGTGAGCACCTGGG
续表2基因所在 SNP ID SNP PCR PCR 限制性基因名称 EC编号 引物序列(5′→3′)染色体区域编号* 形式退火温度 产物长度内切酶名称ADH7 1.1.1.1 4q23-q24 rs894369C/G FATGCTGGCAAATAGCCTTGT 56℃ 467bp Hinc IIRAAGTCTTGTGAGCACCTGGGADH7 1.1.1.1 4q23-q24 rs284787C/T FTTTCAGGCGCTTCAACACTTT56℃ 438bp Dde IRTTAAGGGACGGGCACATTTTTALDH3A 1.2.1.5 17p11.2 rs887241C/T FTCCTCCAACATCTCAGCAACTC 61℃ 358bp Bts IRCCTGGAGGGCAACTCACCTTGTALDH3A 1.2.1.5 17p11.2 rs917520G/T FATCACTGCCCACTCCGTGTC 61℃ 290bp Hinf IRTGCCTGCATTTGCTGAGTTAGAALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs2010404 G/T FGAGAAATAGCCAGAAGACCTTG 56℃ 726bp Sph IRTGACCACGGTCCTAAGCAGAGALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs105147A/G FGAAGTTGTTCAGGCAAAGAGGG 55℃ 268bp Bsp 1286 IRGAGGTTCACGGTGATTGCAACTALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs598156A/C FGAAAGTGAGAACGCTGACGGCT 60℃ 407bp Hha IRACCCTAAGTCAGATCCCATCCCTGALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs581105T/G FGAAAGTGAGAACGCTGACGGCT 60℃ 407bp Ahd IRACCCTAAGTCAGATCCCATCCCTGALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs475325G/A FAGACCCGAATCAATAGGGACATT 59℃ 252bp Hha IRTGGGCTTCGCTGGTCCTCTALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs15518 T/C FATTACAGAATTGTTACCCAACGCC 59℃ 356bp Hpy188 IRTCTCACCTCCCAAGTCCCACTTALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs1003777 G/A FGGCTGGGGGAATTTATCACT 59℃ 387bp ECoR IRGAACCTTCACTACCGGGTCAGALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs1551888 C/T FCTGATGATCCCCTCCACCTAC59℃ 558bp Tsp509 IRCCCTGGAACTACCCACTGAACALDH3B 1.2.1.5 Chr.11rs1871031 A/G FAGACACGGACTTCTGCCATT 59℃ 262bp Pst IRGTGTGTCTGCGTGTGGACTT
续表2基因所在SNP ID SNP PCR PCR产物 限制性内切基因名称EC编号 引物序列(5′→3′)染色体区域 编号* 形式退火温度长度酶名称AOX11.2.1.5 17q25 rs1405984 C/TFATAGGAAGCACCCACACCAG 59℃195bp Alu IRCCAATATGCCAGGCTTCACTAOX11.2.1.5 17q25 rs1527945 C/TFGGACTGTCCAGTTCATCCGT 59℃314bp HpyCH4 IVRCTTGGTACCCGCAATATCGTCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs4818 C/GFTCGTGGACGCCGTGATTCAGG 64℃217bp Bcl IRAGGTCTGACAACGGGTCAGGCCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs165688G/AFTCGTGGACGCCGTGATTCAGG 64℃217bp Nla IIIRAGGTCTGACAACGGGTCAGGCCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs165599A/GFTCCTTCTCAACTGCCATTCC 59℃664bp Hpa IIRTATCCATAGGAGTGGGCTGGCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs933269C/TFCGGGACCATCTGTTGAGACT 59℃572bp Aci IRTACCAATGCCTATGCCATCATCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs740603A/GFTTAGAGCCAGAGGTGTCAAGCC61℃207bp BsaA IRCCCGTGAGGTCCACATTCCCTCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs174694G/TFTGGAGGGCCTTGTGAGGTGG 63℃317bp Bgl IRAGTGTCTCCCAGGGCCTAGTGGCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs174682T/GFAACAGAAGGCTCACACGCTT 60℃294bp Ase IRAATTTGTGGGCAGCAAGTCCOMT2.1.1.6 22q11.2 rs165656C/GFTCGCCAGGTTAGGGTTTATG 59℃467bp Fau IRTGGCATAGGAGATCCCACTCDAO 1.4.3.6 12q24 rs1049748 T/CFAGCAGACGCAGTACTCCTGG 61℃246bp Dde IRACACACTGAGGGAAGCCACTDAO 1.4.3.6 12q24 rs1049793 C/GFCAGCAGCATCTACCACCAGAACG 60℃253bp PPuM IRGTGACCTCTGAACTTGCCGTDBH 1.14.17.1 9q34rs2007153 A/GFAGCAGCTTCGTTTGGACAATTC58℃300bp BsaA IRAGGGCCCTTCTTAGATTCCATAT
续表2基因所在SNP ID SNP PCR PCR产物 限制性内切基因名称EC编号引物序列(5′→3′)染色体区域 编号*形式退火温度长度酶名称DBH 1.14.17.1 9q34rs2005663A/TFAGCAGCTTCGTTTGGACAATTC58℃300bp Hph IRAGGGCCCTTCTTAGATTCCATATDDC 4.1.1.28 7p11rs921450 C/TFCCTTCATCCTGTAGGCCAAA 59℃331bp MSL IRTCTTGGTTCAGTTGTGCAGCDDC 4.1.1.28 7p11rs1451374A/GFGAGGCCCTTAGCACATGAGT 59℃243bp HpycH4 VRAGGGATGGGAGTGCATCATADDC 4.1.1.28 7p11rs1451373G/AFGAGGCCCTTAGCACATGAGT 59℃243bp Hha IRAGGGATGGGAGTGCATCATADDC 4.1.1.28 7p11rs6263 A/GFCTGTGCCGTTAAGAGGGACCTT52℃222bp Nla IIIRCAAGTGCTGCCGAACTTACAFAH 3.7.1.2 15q23-25rs1370274A/GFACCACGTGCTTCTCACCACT 54℃195bp 测序RGGGATACTCCCTGGGTTTTCGSTZ1 5.2.1.2 14q24.3 rs1046428C/TFCAGCTGGCCATCATTGAGTAT 56℃172bp Afl IIIRAGTGTGTCAGGTGTGCAAGGGOT22.6.1.1 16q21 rs1803168C/TFAGTAATGTCCCTGGTGCGAG 56℃290bp Hpa IIRTTGGTGCGATGACTTTCTTGHGD 1.13.11.5 3q21-23 rs2042482A/TFCAACATGTGAACGCTTGGTT 56℃289bp EcoR VRGATTGTAGGGGCAGACCTGAGMAOA1.4.3.4 Xp11.23 rs6323 G/TFTGCAGCTCACATCTGAGGTA 58℃210bp Fnu4H IRGCCTACCCTTCTTCTTCCAGMAOA1.4.3.4 Xp11.23 rs1801291T/CFGCACAGAGACTGCCACAAAG 59℃213bp ECoR VRAGTGCCCAGAGTCACCAAACMAOB1.4.3.4 Xp11.23 rs1040399C/TFATGCAGTTCCTTGCCTTCACTAC 59℃265bp Taq IRATGAAAACTGACGGTGGGAGPPT 5.3.2.1 1p32rs140185 A/GFGCCTAACCCAGAAACGACTG 59℃597bp Mse IRAATGTCACTACAGGTGGCCC
续表2基因所在 SNP ID SNP PCR PCR产物 限制性内切基因名称EC编号 引物序列(5′→3′)染色体区域编号* 形式退火温度 长度酶名称PPT 5.3.2.11p32 rs140186 G/AFGCCTAACCCAGAAACGACTG 59℃ 597bp EcoN IRAATGTCACTACAGGTGGCCCPPT 5.3.2.16p21.3rs140184 A/GFTCAAGGAAGCACACACCAACAC58℃ 381bp BstX IRTCCATTGACCACACTTTGGATTAT 2.6.1.516q22.1 rs2032921 C/TFTCAAGTATTCAACGGCCACTT 56℃ 197bp Rsa I-q22.3 RCCTCCCTGCATTCTCATTTTTPO 1.11.1.8 2p25 rs1399390 G/AFAGAAGAACCCGAGTGGGAGT 60℃ 311bp Aci IRGAGTTACACAGGGTCCGCATTPO 1.11.1.8 2p25 rs938328 G/AFGTCAAAAGTTTGGGCGTAGC 59℃ 472bp Hpy188 IRAATAAGACACCAAGCCCACGGTYR 1.14.18.1 11q14-q21 rs1042602 C/AFCTCTGGCAACTTCATGGGAT 62℃ 533bp DPn IIRAGAATGATGCTGGGCTGAGT*SNP ID编号是指这些SNPs在NCBI数据库中的编号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)
实施例7 测序当被检测的SNP位点不处于已有的限制性内切酶识别序列中时，通过对PCR产物直接测序的办法来检测该位点。本发明中对于FAH基因的rs1370274位点检测，就是使用ABI 3700测序仪对其相应PCR产物进行测序所得。
实施例8 数据处理经检测，58个SNPs位点在均符合Hardy-Weinberg平衡。将这些58个SNPs位点进行随机组合，观察各种组合的频率在病例和对照两组中的分布情况，经SPSS统计软件10.0版分析，发现有4种组合在两组中的差异有统计学意义，如表3所示。
从表3中可以看出，[COMT(rs174682)，ALDH3B1(rs581105)]＝[(T/G)，(A/C)]和[ADH1B(rs1042026)，ADH1B(rs1789882)，ADH1B(rs1229982)，ADH1B(rs1229984)]＝[(T/C)，(G/G)，(G/G)，(T/T)]在病例组中的出现频率显著高于对照组，因此这两种基因型组合与偏执型精神分裂症发病的高风险相关；而[性别，MAOA(rs1801291)]＝[男性，(T/C)]和[COMT(rs174682)＝[(G/G)]在对照组中的出现频率显著高于病例组，因此这两种基因型组合与偏执型精神分裂症发病的低风险相关。
表3 四种阳性SNPs型在病例组和对照组的分布及统计分析结果SNP型 病例组 对照组 P值 对应疾病[COMT(rs174682)，ALDH3B1(rs581105)]56 23 ＜0.001 高风险＝[(T/G)，(A/C)][ADH1B(rs1042026)(rs1789882)(rs1229982)16 0＜0.001 高风险(rs1229984)]＝[(T/C)，(G/G)，(G/G)，(T/T)][性别，MAOA(rs1801291)]＝[男性，(T/C)] 0 28 ＜0.001 低风险[COMT(rs174682)＝[(G/G)]6 50 ＜0.001 低风险序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所清华大学北京大学精神卫生研究所<120>用于预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒及所用引物<160>18<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1aacagaaggc tcacacgctt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2aattttgtgg gcagcaagtc20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3gaaagtgaga acgctgacgg ct 22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4accctaagtc agatcccatc cctg 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>5tgtggggcat tttatttgag20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gaggggaccc ttttacttgc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gcctatctgc tgttatgggc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8cgaaaaatcc acacctccat20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9agggcgacct tgtcctagat20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10ggcactgaga ctcacaccaa g 21<210>11
<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11tggtggctgt aggaatctgt c 21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtgcaagca ctttcgtctc 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13gcacagagac tgccacaaag20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14agtgcccaga gtcaccaaac20<210>15<211>2100<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15tttttaggtt tttttttttt tttttttttg agacagagtc ccgctgtgtt gctcaggctg 60gagtgcagtg gcacgatctc ggctcactgc aacctccgcc tcctgggctc aagcgattct 120cctgcctcag ccccccaagt agctgggatt acaggtgtgc accatcacac ccagctaatt 180tttgtatttt tagtagagat ggggtttcac cacactggcc aggctggtct tgaactcctg 240accccaggtg acctgcccac cttggccttc caaagtgttg ggattacagg cgtgagtcac 300cgcgtccggc cctaaataac attttttatt tgacagcacc ttgcatgaaa ttctgtaggg 360
tccagcccta cagggtctgt gggtttttct ccccgtgtgc agagatgaga gatcgtagaa 420atgaagacac aagacaaaga gatagaagaa aagacagctg ggcccgggga ccactaccac 480caagatgcgg agaccagtag tggccccgaa tgccaggctg cgctgttatt tattggatac 540aagacaaggg ggcagggtaa ggagtgtgag ccatctccag tgacaggtaa ggtcacatgg 600gtcacgtgtc cactggacgg gggcccttcc ctgtttggca gccgaggcgg acagcgagag 660gagacagctt atgtcattat ttctgtattt cagagacctt tagtactttc actaattttg 720ttactgctag ttagaaggca tagccaggta cagggtggaa catgaaagcg gaccaggagc 780gtgactgctt aagcacagca tcacagggag acggttaggc ctccggataa ctgtgggcag 840acctgacact ccacaagagg tggttgagca gagtcttctc taactcccac agggaaaggg 900agacttcctt tcccggtctg ctaagtaacg ggtgcttttt ctaggcactg acgcaactgc 960tagaccaagg tccgctaagt aacaggcgtc ttcccaggcg ctgacgttac cactagacca 1020aggagccctc tagtggccct gtccgggcat aacagaaggc tcacacgctt gtcttctggt 1080cacttctcac cgtgtccctt cagctcttat cactgtatgg cctggtttct cctaggttat 1140aattgtagag cgaagattat tataatattg gaataaagat taattgctac aaactaatga 1200ttaacaatat tcatatataa tcatatctat gatctatatc taatgtaact attcttattt 1260tatatatttt ctttattata ctggaacagc tcgtgccctc ggtctcttgc ctcggcacct 1320gggcgacttg ctgcccacaa aattcaccat tgaaataaac ctaattagtt taacatctct 1380cttataaggt cacaggacag atcctttgag gtcttccagg ggccctccag gaaatctcaa 1440gtcagtctga gatcaagaca atgtcacagg ccacatgcag tggttcacgc ctataatccc 1500aacactttgg gagtccgagg agggaggact ccttgagccc aggagtttga gaccagcctg 1560agaaacatgc tgaggccctg tctctacaaa acaaaaagtt gaaaaattag ctgggcatgg 1620tggtacatgt ctgtagtccc atgtactctg aagactgagg cgggaggatc acttgagccc 1680aggagttcaa ggttgcagtg agctgtaatt gcaccactgc actccagcct cagtaacaga 1740gtgagactct gtcactaaaa aaaatttagg ctgggtgcag cggctcacgc ctataatccc 1800agcattttgg gaggtcaagg tggacagatc acctgagatc aggagttcaa gaccaggctg 1860gccaacatgg caaaacccca cctgtactaa aaatacaaaa attagctggg cgtggtgcca 1920tgtgcctgtg gtcccagcta cttgggaggc tgagacagca gaattgctta agcctgggag 1980gcagaggtta cagtgagccc agatcacacc atggcactcc agcctgggta acagagcgag 2040actctgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatttaa agaaacttta tacataaatc 2100<210>16<211>2100<212>DNA
<213>Homo sapiens<400>16gcatctgccc agcgtcacgt gcaccctctc agttaaccct ttggtgaatc tggttgggca 60accacaccca gtggccccca gaagaggctc agagagagtg tgttcttgcc caagggcatg 120cagccaggaa gagcagagcc agagtttgaa cctggctcaa aatagcccag tctcccaaag 180tcaggtccca ggtgacctag gaggtgtggc gggcaggcca ccaggctcat ggggccagag 240cacaggctgt gggaaagtcc gtgtggaagg caccttcccc cagcctcagt ggctaggagg 300tgccagtggg cgtggcgtct tcctccctct tggggctcag ctgtagccct ggccttgccc 360ctggttcgct gagtgacctc aggcagggca tctccttctc tgggcttcgc tggtcctctg 420gcccatccag caccccactg gcccgtcccc ctctgccctg acccgggaga gcctgcaccc 480cataacctca ggcgctgcct cagccaggga gccagcctgg ccccagtgtc cctgacctgt 540tctccagcgg cctgcagcct gctgcctggc tggtctctcc tcccttgggg cgcagagggc 600agggagcact ggctagccga gagcaggaca atgtccctat tgattcgggt ctcctcactc 660ctgcttagaa gcctgacagt ggccctggcc cctgggctgt gggaactgac agcatttacc 720taggggtggc tgtgcctgtg tctcctgtgg accaatctcc accctgctct ttgggagact 780gaggtgggag gattgtttga ggccaggagt tcaagaccta cctaggcaac acagcaaggc 840actctgcaaa aaatcaaaac aaactttttt tgaaattaaa aaaaaacaaa accctaagtc 900agatcccatc cctgctcttc tcaggagtcc ttgcctggct gcctggcccc ctcaccttgc 960ccactctgct tcttgctaaa caggagcaga gcaagcgcac agccacctcg gggcctttgc 1020agccgccagg gcctctgccc aaagtatgcc gcctcccagt acccacgact tgcttgttcc 1080ttgacttcag gtcactgctc caatgtgacc gccgcctgga gacctgcact gaccgctttg 1140taaaaacagc acacacacac atgctcatgt ggatgtatac atgtgcacac ctgtgcacgc 1200ccacagccac acgctccagc agtctccacc cccaccctgc tccatgattt ccctagcaca 1260
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权利要求
1.偏执型精神分裂症易感性的预测方法，其特征在于体外检测COMT、ALDH3B1、ADH1B、MAOA四个基因中单核苷酸多态性(SNP)特定组合型的存在。
2.用于预测偏执型精神分裂症易感性的引物，所述引物为基于SEQ ID NO15-21的序列而设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图2中所示的SNP位点而设计，长度为18-26个核苷酸。
3.如权利要求2所述的引物，其包含选自SEQ ID NO1-14组成的一组的任一种序列。
4.用于预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒，其包含如权利要求2-3任一项所述的引物。
5.COMT、ALDH3B1、ADH1B、MAOA四个基因在制备用于预测偏执型精神分裂症易感性的诊断剂中的应用。
6.根据权利要求3的试剂盒用于偏执型精神分裂症易感性的预测。
7.根据权利要求1的方法用于偏执型精神分裂症的遗传定性。
8.根据权利要求1的方法用于偏执型精神分裂症的诊断。
9.根据权利要求1的方法用于偏执型精神分裂症的药物开发。
全文摘要
本发明涉及用于预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒及所用引物。更具体地，本发明涉及利用精神分裂症易感基因COMT、ALDH、ADH和MAO的六个单核苷酸多态性(SNP)位点组合，设计的预测偏执型精神分裂症易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及COMT、ALDH、ADH和MAO四个基因在制备预测偏执型精神分裂症易感性的诊断剂中的应用。
文档编号C12Q1/68GK1635142SQ20031012249
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者许琪, 沈岩, 计宏凯, 季梁, 原岩波, 沈渔邨 申请人:中国医学科学院基础医学研究所, 清华大学, 北京大学精神卫生研究所