用于生产脂肽的工程菌株及其构建方法

专利名称：用于生产脂肽的工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明要求保护的技术方案涉及一种引入外来遗传材料修饰的细菌，具体地说是一种用于生产脂肽的工程菌株及其构建方法。
背景技术：
一般来说，油水界面上界面张力(γL)太高是造成石油采收率低的重要原因之一。当原油——水体系的γL降至0.07mNm-1时，采收率将陡增。在此临界值以下，γL稍有降低会使石油采收率大幅增加。当前几乎所有用于降低油水界面上界面张力的表面活性剂都是以石油产品为原料合成的，其工业需求量在过去十年内增长了300％，每年世界广泛使用的化学合成表面活性剂已超过4×106吨。随着生物技术的快速发展和环保意识的增强，人们希望用无污染可降解的生物表面活性剂能作为化学合成表面活性剂的替代物。脂肽正是这一类重要的生物表面活性剂，其分子中亲水基团由短肽或氨基酸组成，疏水基团由脂肪酸组成，现在发现的脂肽主要来自芽孢杆菌属Bacillus sp.(1.Muriel H.A 13C solid-state NMR study of the structure and auto-oxidationprocess of natural and synthetic melanins.Biochimica et Biophysica Acta.1994.120419-27.2.Laurence T.Selective esterification of surfactinpreparation and properties of surfactin methyl esters.Biotechnol.Appl.Biochem.1994，20415-423.)。脂肽的最重要应用在于其具有高表面活性，特别是在三次采油中的应用潜力巨大。除此以外，脂肽类生物表面活性剂在环境生物工程领域也有着极大的应用潜力。在受烷烃和原油污染的土壤中加入它们，能够提高憎水性化合物的亲水性和生物可利用性，增加土壤微生物含量，提高烷烃降解速度，因而被认为是现代生物修复技术的一部分。同时，在食品工业中，由于脂肽类生物表面活性剂符合功能性食品和绿色食品添加剂的要求，随着人们对于健康的日益重视，将成为一种应用广泛的食品添加剂。
Bacillus licheniformis BAS50产生的JF-2脂肽类表面活性剂，室内实验表明脂肽类表面活性剂具有增产原油的作用(Cooper D.G.Surface active compounds frommicroorganisms.Adv.Appl.Microbiol.1980，26229-256)。目前报道的仅有Bacilluslicheniformis JF-2和JF-86菌株以及Bacillus subtilis产生的surfactin脂肽。但是这些菌株产生的脂肽类表面活性剂的产率较低，致使脂肽类表面活性剂的生产成本过高，以致影响其广泛应用(Georgiou，G.Surface active compounds from microorganisms.Biotechnol.1992，1060-65)。
CN1240482和日本专利03-098595都是公开了利用Bacillus subtilis生产多肽的方法。这些报道与本发明的技术主题虽然有关联，但是并不属于同一技术领域，也无法作为本发明专利性的对比文献。总之，通过对国内外文献数据库的检索尚未发现脂肽高产工程菌株的报道。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过基因工程手段构建高产脂肽类生物表面活性剂工程菌株，以提高脂肽类生物表面活性剂的产量。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是一种用于生产脂肽的工程菌株，其特征在于名称为Bacillus subtilis NK-LRL068，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.1080。
用于本发明Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中表达comA基因的质粒是pHTCOM系列质粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，pHTCOMA质粒的构建如图4所示，pHTCOMS-a质粒的构建如图5所示，pHTCOMS-b质粒的构建如图6所示。
本发明的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株的构建方法是将包含启动子区及上游序列的全长comA基因克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒，如图4所示；将comA序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，如图5、6所示，将上述pHTCOM系列质粒转化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，获得Bacillussubtilis NK-LRL068工程菌株，将包含启动子区及上游序列的全长comA基因克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒，如图4所示；将comA序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，如图5、6所示，将上述pHTCOM系列质粒转化至Bacillussubtilis MO-L010菌株，获得Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株，参考Bacillussubtilis全基因组、comA、Psrf序列，以及质粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析软件进行辅助设计，上海Sangon或BioAsia合成获得扩增引物分别如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’。
本发明的有益效果是利用本发明提供的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株生产脂肽类表面活性剂的产率较高，其脂肽产量较Bacillus subtilis MO-L010菌株提高50％(见实施例)，利用本发明提供的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株产生的脂肽类表面活性剂也已经在原油乳化实践中得到应用。


下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1 pUCCOMA质粒的构建图2 pMUTIN-COMA1质粒的构建图3 pMUTIN-COMA2质粒的构建图4 pHTCOMA质粒的构建图5 pHTCOMS-a质粒的构建图6 pHTCOMS-b质粒的构建具体实施方式
图1表明以Bacillus subtilis MO-L010基因组DNA为模板扩增出comA序列，并将该序列亚克隆于pUC19载体上，构建pUCCOMA质粒。
图2表明将PCR扩增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4质粒，构建pMUTIN-COMA1整合质粒。
图3表明将PCR扩增的comA response regulatory序列和HTH-LUXR区的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4构建重组质粒pMUTN-COMA2整合质粒。
图4表明将全长comA基因(包含启动子区及上游序列)克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒图5表明将comA的编码序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a质粒，图6表明将全长comA基因克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-b质粒，实施例1将全长comA基因(包含启动子区及上游序列)克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒，如图4所示；将comA序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，如图5、6所示，将pHTCOM系列质粒转化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，获得本发明的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株。
实施例2用于本发明Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中高效表达comA基因的pHTCOM系列质粒的制备方法如下第一步，Bacillus subtilis MO-L010基因组DNA的提取按照下列Bacillus基因组DNA的提取方法，对Bacillus subtilis MO-L010基因组DNA进行提取，得到DNA片断大小为23kb；Bacillus基因组DNA的提取方法①挑取LB培养基平板上新鲜活化的单菌落于5ml LB培养基中，于37℃震荡培养12小时，②转移3ml菌液于5ml离心管中，4℃，转速为12000r/min，用离心机离心5分钟，弃掉上清液，③将细菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，尽量空干上清液，④将沉淀重悬于pH＝8.0的50mM Tris缓冲液1ml中，然后加入新鲜配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris缓冲液中的浓度为10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混匀后于37℃放置1小时，再加入200μl 10％SDS溶液，混匀后于55℃下放置5分钟，⑤加入体积比为1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混匀，转速为12000r/min，用离心机离心10分钟，形成上下两相，⑥转移⑤中上相至一新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小时，⑧加入体积比为1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混匀，转速为12000r/min，用离心机离心10分钟，形成上下两相，⑨转移⑧中上相至一新的离心管中，加入1/10体积的pH＝5.2的3mol/L NaAc溶液和2倍体积的冷无水乙醇，于-70℃下放置30分钟，⑩将⑨的液体于4℃下，转速为12000r/min，用离心机离心10分钟，弃上清液，用70％乙醇洗两次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存备用；第二步，全长comA序列的扩增及测序按照下列引物设计及合成方法，获得全长comA序列扩增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物设计及合成方法参考Bacillus subtilis全基因组、comA、Psrf序列，以及质粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析软件进行辅助设计，上海Sangon或BioAsia合成；按照下列DNA扩增方法，以Bacillus subtilis MO-L010基因组DNA为模板扩增出全长comA，由上海生工测序，全长comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCA
DNA扩增方法①在200μl薄壁离心管中依次加入下列试剂，成分 体积 说明(μl)H2O 33.75按顺序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq5.00Buffer(Mg2+free)25mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP5.00Mixture20pmol/μl上游引物1.0020pmol/μl下游引物1.00DNA模板 1.00 15ng/μl基因组DNA或0.5ng/μl质粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暂离心，使液体集中在管的底部，③将薄壁管放在PCR仪中按如下程序开始循环，热盖103℃热变性 94℃ 5min 保温 72℃ 9min4℃ 无限长第三步，构建pUCCOMA质粒按照第二步的引物设计及合成方法，获得comA编码序列扩增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA扩增方法，以Bacillus subtilis MO-L010基因组DNA为模板扩增出comA编码序列，并将该序列亚克隆于pUC19载体上，构建如图1所示的pUCCOMA质粒，pUCCOMA质粒的扩增、提取都按照以下E.coli感受态细胞的制备、转化及质粒DNA的提取等方法进行，
E.coli感受态细胞的制备和转化方法E.coli JM109感受态的制备和转化参照Promega公司pGEM-T Easy Vector SystemsTechnical Mannual；E.coli DH5α感受态的制备和转化①在LB液体培养基中接入单菌落，于37℃下振荡培养至OD600为0.3～0.4，在4℃，转速为5000r/min，用离心机离心10分钟，收集菌体，②用原体积1/10的PIPES缓冲液轻悬，冰浴30分钟，PIPES缓冲液的组成为PIPES2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，转速为5000r/min，用离心机离心10分钟，弃尽上清液，轻缓地用1/25PIPES缓冲液重悬，即成感受态细胞，④每100μl感受态细胞加入4μl DNA连接产物，弹匀后冰浴30分钟，⑤于42℃准确热激45秒，立即放置在冰上2分钟，加入200μl LB培养基重悬，在37℃，100r/min振荡预培养1小时，⑥将预培养物涂布于含相应抗生素的LB培养基平板，20分钟后倒置平皿，在37℃下正置培养16～20小时，⑦挑选单菌落，用下列方法提取质粒，然后进行电泳，酶切和PCR鉴定，E.coli质粒DNA提取方法E.coli质粒提取使用经典的碱裂解法提取，参照MolecuLar Cloning A laboratoryMannual，3rded；第四步Bacillus subtilis MO-L010菌株comA基因敲除实验1.按照第二步的引物设计及合成方法，获得扩增comA response regulatory序列355bp的引物分别如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’将PCR扩增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4质粒，构建pMUTIN-COMA1质粒，如图2所示，2.按照第二步的引物设计及合成方法，获得扩增comA response regulator序列和HTH-LUXR区的5’端序列共482bp的引物分别如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’将PCR扩增的comA response regulator序列和HTH-LUXR区的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4构建质粒pMUTN-COMA2质粒，如图3所示，构建时将pMUTIN4的lacZ基因与comA基因的读框融合，发生同源重组后lacZ基因则完全依赖于PcomA转录和表达，lacZ基因本身的RBS被置换为Bacillus subtilis 168 spoVG基因的RBS，保证lacZ基因在Bacillus subtilis细胞保持很高的表达活性；3.按照Bacillus subtilisMO-L010菌株感受态细胞的制备方法，制备感受态细胞，Bacillus subtilis MO-L010菌株感受态细胞的制备方法①挑单菌落接种于5ml LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养过夜，全部转移到含0.5M山梨醇的100ml LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养至OD600为0.7～0.75，②冰上预冷20分钟后，在4℃，转速为5000r/min，用离心机离心10分钟，用预冷的含0.5M山梨醇、0.5M甘露醇和10％甘油的电击缓冲液洗四次，③将沉淀重悬于2ml的预冷的电击缓冲液中，终细胞浓度为1.3～1.4×1010cfu/mL，即得感受态细胞，直接存储于-70℃下，该感受态细胞转化自主复制质粒的效率达到108个转化子/μgDNA，转化整合质粒的效率达到1～10个转化子/μgDNA，4.按照下列Bacillus subtilis MO-L010感受态细胞的电转化方法，将pMUTIN-COMA1与pMUTIN-COMA2各1μg混匀后，电转化Bacillus subtilis MO-L010，筛选红霉素抗性菌株，获得comA基因敲除菌株，pMUTIN-COMA1与pMUTIN-COMA2与Bacillus subtilisMO-L010染色体有一段几百bp的同源序列，同源重组则发生在这段序列之间，造成comA基因失活的机理为Campbell-type(single cross-over)整合模型；Bacillus subtilis MO-L010感受态细胞的电转化方法①60μl感受态细胞与1μl质粒DNA混合，自主复制质粒，浓度25～50ng/μL，整合质粒浓度1～5ug/μl，以不加质粒的感受态细胞作阴性对照，②将①的混合物和阴性对照分别转移至预冷的电转化杯中，冰上放置1～5分钟，③1mm electrode gap转化杯，采用2kV/mm，4.5～5.9ms电击，2mm electrode gap转化杯，采用2.5kV/mm，4.0～5.9ms电击一次，所用仪器为BioRad，MicropμLserTM，④立即加入500μl含有0.5M山梨醇和0.38M甘露醇的LB培养基，⑤转移至无菌的1.5ml离心管，于37℃，100r/min，预培养3小时，⑥将培养液铺在1/2含相应抗生素的LB培养基平板上，正置2小时后倒置培养，1/2 LB培养基包括胰蛋白胨0.5％、NaCl0.25％、酵母粉0.25％，pH＝7.0～7.2，⑦挑选单菌落，提取质粒进行电泳、酶切、PCR鉴定。
采用以上方法进行感受态细胞制备和转化，转化自主复制质粒效率为108个转化子/μgDNA，整合载体的转化率为1～10个转化子/μgDNA。
5.按照下列提供的脂肽发酵方法、培养基和测定方法，将Bacillus subtilisMO-L010与其comA基因敲除菌株的脂肽合成能力进行比较，由发酵结果可见，comA基因断裂失活使细胞几乎完全丧失了产生脂肽和降低表面张力的能力，本实验为comA基因是脂肽合成酶基因转录与表达的必需基因提供了一个有力的证据，脂肽发酵方法和培养基①挑取2环菌落接种于50ml LB液体培养基中，于37℃180r/min振荡培养至OD600为1.2，②接种①中种子培养液4ml至110ml发酵培养基中，于37℃ 180r/min振荡培养48小时，1升脂肽发酵培养基含葡萄糖10g、MgSO4.7H2O 0.2g、KH2PO44.1g、NH4NO34g、Na2HPO414.3g、酵母粉0.1g、0.4mol/l的FeSO42μl、0.7mol/l的CaCl24μl，pH＝7.0；脂肽产量的测定方法取样后，于30℃，转速为10000r/min，用离心机离心15min，彻底去掉菌体，上清液再离心一次，弃沉淀，取上清液调节pH＝2.0，于4℃下放置12小时，转速为10000r/min，离心10min，弃上清液，沉淀干燥后称干重，此干重即为脂肽粗品产量。
第五步，构建pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b质粒将包含启动子区及上游序列的全长comA基因克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒，如图4所示；将comA序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，如图5、6所示，按照上述第二步中提供的引物设计及合成方法，获得扩增引物分别如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’实施例3脂肽高产工程菌株Bacillus subtilis NK-LRL068的构建comA基因敲除实验证实，comA基因是Bacillus subtilis MO-L010脂肽合成的必需基因。但是，comA基因的表达却在脂肽合成酶基因lps的大量转录与表达的时期下降，因此如果增加平衡期的comA表达量，应当能够提高lps基因的表达水平。
1.将pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b分别电转化Bacillus subtilis MO-L010感受态细胞，通过增加选择压力的方式保持质粒稳定，erythromycin 25μg/ml。从comA表达量来看，pHTCOMS质粒明显优于pHTCOMA质粒菌株，其中pHTCOMS-a质粒的蛋白表达效率高于pHTCOMS-b质粒，将带有pHTCOMS-a质粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株命名为Bacillus subtilis NK-LRL068。
2.Bacillus subtilis MO-L010和Bacillus subtilis NK-LRL068的发酵动态按照上述第四步中提供的脂肽发酵方法、培养基和测定方法，将Bacillussubtilis MO-L010与Bacillus subtilis NK-LRL068菌株的脂肽合成能力进行比较，发现，质粒pHTCOMS-a转化入Bacillus subtilis MO-L010菌株后，重组菌株仍保持了原菌株的生长态势，它们的生长动态、pH值和表面张力变化趋势相同，因此可以看出重组质粒转化入Bacillus subtilis MO-L010菌株后，对菌株的生长能力影响很小。
比较两菌株的脂肽合成过程，在对数生长中期以前，Bacillus subtilis NK-LRL068菌株脂肽合成量低于不携带质粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株，但随着细胞的生长，却发生了反转，前者脂肽产量增加的速度与总量明显高于后者，最终产量高出50％左右，如表1所示，表1 Bacillus subtilis MO-L010和Bacillus subtilis NK-LRL068脂肽合成量的比较
权利要求
1.用于生产脂肽的工程菌株，其特征在于名称为Bacillus subtilisNK-LRL068，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.1080。
2.根据权利要求1所述的用于生产脂肽的工程菌株，其特征在于用于Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中表达comA基因的质粒是pHTCOM系列质粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，pHTCOMA质粒的构建如图4所示，pHTCOMS-a质粒的构建如图5所示，pHTCOMS-b质粒的构建如图6所示。
3.权利要求1所述的用于生产脂肽的工程菌株的构建方法，其特征在于将包含启动子区及上游序列的全长comA基因克隆于pHT315穿梭质粒，构建pHTCOMA表达质粒，如图4所示；将comA序列克隆于Pspac强启动子下游，同时用spoVG基因的核糖体结合位点序列取代comA本身的RBS，构建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b质粒，如图5、6所示，将上述pHTCOM系列质粒转化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，获得Bacillus subtilisNK-LRL068工程菌株，参考Bacillus subtilis全基因组、comA、Psrf序列，以及质粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析软件进行辅助设计，上海Sangon或BioAsia合成获得扩增引物分别如下上游引物5’ CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’ TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’ CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’ CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’ AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’ GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’ TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’ GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’。
4.根据权利要求3所述的用于生产脂肽的工程菌株的构建方法，其特征在于将pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b分别电转化Bacillus subtilis MO-L010感受态细胞，通过增加选择压力的方式保持质粒稳定，erythromycin 25μg/ml，其中带有pHTCOMS-a质粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株命名为Bacillus subtilisNK-LRL068。
全文摘要
本发明涉及用于生产脂肽的工程菌株及其构建方法，用于生产脂肽的工程菌株名称为Bacillus subtilis NK－LRL068，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.1080，用于Bacillus subtilis NK－LRL068工程菌株中表达comA基因的质粒是pHTCOM系列质粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS－a和pHTCOMS－b质粒，pHTCOMA质粒的构建如图4所示，pHTCOMS－a质粒的构建如图5所示，pHTCOMS－b质粒的构建如图6所示，利用本发明提供的Bacillus subtilis NK－LRL068工程菌株生产脂肽类表面活性剂的产率较高，其脂肽产量较Bacillus subtilis MO－L
文档编号C12N15/74GK1554747SQ200310122140
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者顾晓波, 黄英, 刘如林, 梁凤来, 马建芳 申请人:南开大学