专利名称：一种制备人载脂蛋白a－ⅰ的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备人载脂蛋白A-I的方法。具体涉及利用毕赤酵母系统，通过构建重组工程菌株、表达、分离纯化获得高效生产人载脂蛋白A-I的方法。
背景技术：
高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)是血浆中重要的脂蛋白，HDL参与胆固醇的逆向转运，将肝外细胞的胆固醇转运至肝脏，并加以转化和清除，因而具有抗动脉粥样硬化作用。另外HDL还具有抗炎、抗内毒素、促进细胞分裂、连接脂多糖、改善动脉血管的异常收缩、减少血管内皮细胞分泌表皮因子、刺激内皮细胞合成前列环素并延长其半衰期等功能。
人载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)是HDL的主要载脂蛋白，是HDL功能的主要执行者。有研究表明，ApoA-I还具有抗内毒素、抗病毒、抗氧化、抗凝、和抗炎作用，以及调节细胞黏附因子的表达、介导细胞内信号传导等功能。因此ApoA-I在胆固醇的转运、代谢、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗病毒及抑制急性相炎症反应造成的组织损伤中起重要作用，目前其已成为脂类代谢研究的重点之一。
目前已从肝及周围组织细胞的细胞膜上相继分离到高亲和力的ApoA-I和HDL受体，并发现肝脏选择性摄取HDL胆固醇酯。因此游离的HDL和ApoA-I具有肝脏靶向的特点，这一特点使得ApoA-I在靶向药物研究中有着良好的应用前景。
从人血清提取的ApoA-I的蛋白分子量为28.3kD，由243个氨基酸组成，无糖基化修饰。目前HDL主要从人血清分离提取，但由于人血液供应短缺和难以解决的血液污染等问题，很难实现产业化，大大限制了其开发和应用。为进一步探索ApoA-I的结构与功能及其在新药开发中的应用，可利用基因工程技术制备，实现ApoA-I的高效表达。
已知用于重组ApoA-I的表达系统有大肠杆菌表达系统、P.pastoris甲醇酵母表达系统、昆虫表达系统等。应用较多的为大肠杆菌原核系统，但在大肠杆菌中，ApoA-I的mRNA极不稳定，表达的成熟蛋白易被降解，一般以融合蛋白的形式表达，难以获得成熟的ApoA-I，且表达水平低(20mg/L)。Robert O，Ryan等将ApoA-I的cDNA通过定点突变进行修饰，获得了突变修饰的ApoA-I cDNA编码序列，然后在大肠杆菌的BL21(DE)pLysS进行了表达，表达水平达100mg/L左右。有研究在昆虫杆状病毒表达系统表达了ApoA-I，表达水平接近100mg/L。由于是胞内表达，给分离纯化造成困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备人载脂蛋白A-I的方法。具体涉及一种是通过构建重组工程菌株获得高效、大批量生产ApoA-I的方法。
本发明采用DNA重组技术将来源于天然的ApoA-I基因在毕赤酵母中既实现了高效分泌表达，又可用新的分离方法快速地获得电泳纯度的ApoA-I。纯化的ApoA I经蛋白质谱检测、N端氨基酸测序和分子量测定与人血清提取的ApoA-I一致，竞争性结合试验显示毕赤酵母工程菌制备的ApoA-I保持天然血浆ApoA-I的细胞结合活性。
本发明通过下述方法和步骤进行将apoA-I基因装入P.pastoris的分泌型表达载体上，线性化后转化P.pastoris甲醇酵母宿主菌，利用重组菌进行高效表达，用冷丙酮分级沉淀后经Q-Sepharose柱进一步分离，得到电泳纯的ApoA-I蛋白，包括下述步骤，1，构建重组质粒以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然apoA-I基因片段，在apoA-I基因编码序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Xhol I和EcoR I，双酶切后装入P.pastoris的分泌性表达载体pPIC9k上，获得重组表达质粒。
本发明将带有天然apoAI基因的质粒(钟江生物工程学报，2003，19692-697。)用定点突变法(TaKaRa公司)消除基因内的两个XhoI位点，并在基因地5’端添加XhoI位点，在基因的3’端添加EcoRI位点。并通过基因突变去除apoA-I基因片段内的两个XholI位点。
2，构建表达菌株，上述apoA-I基因片段经Xhol I和EcoR I双酶切装入P.pastoris的分泌型表达载体(购自Invitrogen公司)上获得表达质粒。表达质粒经BglII酶切，电转化P.pastoris GS115(构自Invitrogen公司)电感受态细胞。转化子经抗性筛选、表达能力鉴定，获得高表达菌株，表达的蛋白经Western-blot鉴定，结果证实为ApoA-I蛋白。
3，发酵、培养、分离ApoA-I蛋白将上述所得高产菌株在试管活化后接入优化的BMGY培养基(其中含蛋白胨20％，酵母粉10％，1M磷酸缓冲液10％，甘油10％，YNB 13.6g/L)，28-30℃，220rpm培养24-28h，发酵液离心(6000rpm，6min)，菌体用优化的BMMY(其中用5ml/L甲醇替代BMGY中的甘油)诱导培养基重悬，同样条件下培养84-96h，每24h补甲醇1％(V/V)。上清液经SDS-PAGE检测，表达水平达200mg/L。发酵上清液搅拌下加入-20℃丙酮，使丙酮浓度达20％，-4℃放置5h，离心，收集上清液。上清液中加丙酮至终浓度40％，-10℃。离心，收集上清液。上清液中加入丙酮至终浓度60％，并调pH至5.8，-10℃放置5h，离心收集沉淀。
Q-Sepharose离子交换柱平衡，上述沉淀用5mmol/L PBS的溶解后上柱，0-1.0M NaCl的PBS洗脱，用分布收集器收集洗脱液，280nm检测，收集主峰，透析后浓缩冻干。
4产物鉴定及蛋白活性检测将纯化产物进行蛋白质谱检测和N末端测序分析蛋白质谱(上海基康生物技术有限公司，基康编号S40520001)，检测结果表明基因工程表达的ApoA-I分子量为28.06kD，人血清提取的ApoA-I分子量为28.165kD。N末端测序分析结果基因工程表达的ApoA-I与人血清提取的ApoA-I完全一致。所述基因工程表达ApoA-I N末端氨基酸序列DEPPQ SPWDR VKDLA，人血清提取的ApoA-I人血清提取的ApoA-IDEPPQ SPWDR VKDLA。
本发明通过FITC标记基因工程ApoA-I与天然血浆HDL竞争结合肝细胞实验进行蛋白活性测定，结果显示基因工程表达的ApoA-I保持天然血浆ApoA-I的细胞结合活性。
图1是本发明的包含apoA-I基因的重组质粒构建图。
图2是本发明的基因工程表达的ApoA-I SDS-PAGE电泳图谱其中1为阳性重组菌的胞内蛋白；2为空载体pPIC3.5k转化的重组菌表达的产物；3为低分子量标准蛋白。
图3是本发明Western-blot照片。其中，1为血清提取ApoA-I，2为摇瓶表达ApoA-I，3为发酵罐表达ApoA-I，4为阴性对照。
图4是本发明的毕赤酵母重组菌株表达ApoA-I蛋白量与时间关系，其中，A为摇瓶1，2，3，4，5，分别表示摇瓶内诱导72，84，96，120，132h时ApoA I表达量，6为低分子量标准蛋白，B为发酵罐1，2，3，4，5，6，7，8，分别表示发酵罐内诱导24，36，48，60，72，84，96，108h时ApoA I表达量，9为低分子量标准蛋白。
图5是本发明纯化后ApoA-I的SDS-PAGE电泳图谱，其中，1为纯化后ApoA-I，2为低分子量标准蛋白。
图6是本发明纯化基因工程ApoA-I与天然血浆ApoA-I的质谱检测图谱比较，其中1为重组ApoA-I蛋白质谱图，2为人血来源ApoA-I蛋白质谱图。
图7是本发明纯化基因工程ApoA-I与天然血浆ApoA-I肝细胞竞争结合图谱。
具体实施例方式
实施例1 获得重组apoA-I表达质粒根据apoA-I基因序列，以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然片段，并在N端和C端分别设置Xhol I和EcoR I酶切位点，上述apoA-I基因片段经Xhol I和EcoR I双酶切装入P.pastoris的分泌型表达载体获得表达质粒。
实施例2表达质粒电转化毕赤酵母GS115所构建的表达质粒pPIC9k-apoA-I用BglII酶切线性化。宿主菌P.pastorisGS115(his mut+)培养至OD为1.6-1.8，制备电感受态细胞，与上述质粒混合，再以GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电转化，其中电压1500V，电容50μF，电阻4kΩ，向转化杯中加入0.5ml 1mol/L冷山梨醇，取200μl涂于MD平板，30℃培养至单菌落出现，结果得到1000余个转化子。
实施例3 筛选高抗性毕赤酵母重组菌株将1000余个转化子依次涂于含G418分别为1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml的YPD平板上，28-30℃培养，结果在含4mg/mlG418平板上获得22个转化子。
实施例4 筛选高表达能力菌株将上述22株高抗性菌的单菌落分别接入含3ml BMGY的试管中，28-30℃，220rpm培养24h，分别吸取1.5ml接入含40ml BMGY的培养基，同样条件下培养24h，离心(6000rpm，6min)，菌体重悬于15mlBMMY培养基，同样条件下培养96h(每24h补甲醇150ul)。发酵液离心，取上清液做SDS-PAGE电泳，结果有6株表达产物在28KD左右有明显的蛋白条带，选其中16号菌做实验菌。
实施例5 表达产物的Western-blot鉴定将电泳后的SDS-PAGE凝胶剥离，浸入电转移缓冲液中漂洗1min.4℃电转移2h.取出转移膜，放入5％脱脂牛奶封闭液中，37℃缓慢摇动1h.用封闭液稀释一抗(兔抗人ApoA I抗体)1/1000，37℃缓慢摇动1h.用TBS缓冲液洗膜。用封闭液稀释二抗(anti-rabbit)1/30000，37℃缓慢摇动1h.用TBS洗膜一次，AP底物缓冲液洗膜两次。在10mlAP底物缓冲液中加入BCIP 33μl，NBT 66μl，将膜显色30min，条带清洗后漂洗，终止显色。
实施例6 重组甲醇酵母菌株表达ApoA-I从YPD斜面培养基挑选单菌落，接入含3ml BMGY的试管，28-30℃，220r/min，培养24h，取1.5ml转入40ml BMG培养基生长24h，离心(6000rpm，6min)，弃上清，菌体用15mlBMMY诱导培养基悬浮，同样条件下培养，每24h补甲醇15ul。从72h开始每12h取样做SDS-PAGE，。
实施例7 发酵罐中毕赤酵母重组菌株表达ApoA-I发酵罐为美国NBS公司Bio F110自动控制发酵系统，含pH自动调节、温度自动控制、溶氧监测、搅拌、进气系统。
发酵参数设置 温度30℃；pH6.0；DO(溶氧浓度)35％；搅拌200-800r/min.
种子液制备从YPD斜面培养基挑选单菌落，接入含40ml BMGY的摇瓶，28-30℃，220r/min培养24h，作为一级种子液。再以5％的接种量接入BMGY 400ml，同样条件下培养12-14h，至A600约8左右，作为发酵罐种子液。
发酵培养14L发酵罐装入4L基础盐培养液，种子液以8-10％的接种量接入发酵罐。当DO陡然上升至80-90％，表明培养及内甘油耗尽流加50％甘油，4h后停止。甘油耗完，开始流加甲醇，流加速度以维持DO 35％为宜。定时取样做SDS-PAGE电泳，适时放罐，最终菌体密度达150g/L(湿重)，表达量达160mg/L。
实施例8 ApoA-I蛋白的分离纯化发酵上清液搅拌下加入-20℃丙酮，使丙酮浓度达20％，-4℃放置5h，离心，收集上清液。上清液中加丙酮至终浓度40％，-10℃。离心，收集上清液。上清液中加入丙酮至终浓度60％，并调pH至5.8，-10℃放置5h，离心收集沉淀。
Q-Sepharose离子交换柱平衡，上述沉淀用5mmol/L PBS的溶解后上柱，0-1.0M NaCl的PBS洗脱，用分布收集器收集洗脱液，280nm检测，收集主峰，透析后浓缩冻干。
实施例9 ApoA-I蛋白活性测定(FITC标记基因工程ApoA-I与天然血浆HDL竞争结合肝细胞实验)基因工程制备ApoA-I按50μg FITC/mg蛋白比例加入FITC-DMSO溶液。室温避光培养4h，进行蛋白荧光标记。经PBS(pH7.2，10mM)充分透析后得到FITC标记的基因工程ApoA-I，进行细胞实验。肝癌SMC7721细胞(1×106个/ml)，37℃，5％CO2培养24h，吸弃培养夜后每孔加入FITC标记的基因工程ApoA-I 0.12mg及各种浓度天然HDL(蛋白浓度分别为0，0.21，0.9，2.22mg)，。37℃，5％CO2温育3h.后分离细胞，经洗涤后分别测定细胞结合荧光强度(λex499nm，λem520nm)。
权利要求
1，一种制备人载脂蛋白A-I的方法，其特征是将apoA-I基因装入P.pastoris的分泌型表达载体上，线性化后转化P.pastoris甲醇酵母宿主菌，利用重组菌进行高效表达，用冷丙酮分级沉淀后经Q-Sepharose柱进一步分离，得到电泳纯的ApoA-I蛋白，包括下述步骤1)构建重组质粒以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然apoA-I基因片段，在apoA-I基因编码序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Xhol I和EcoR I，双酶切后装入P.pastoris的分泌性表达载体上，获得重组表达质粒；2)构建ApoA-I表达菌株步骤1)的重组质粒用BglII线性化，电转化宿主细胞，转化液涂于MD平板，28-30℃培养至转化子长出；3)筛选高表达菌株步骤2)的转化子经G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的高抗性菌株，经甲醇诱导获得高表达菌株；4)发酵、培养、分离ApoA-I蛋白步骤3)的高表达菌株发酵在优化后的BMGY内生长，诱导ApoA-I产生，上清液经丙酮分级沉淀、Q-Sepharose分离纯化，获纯的ApoA-I蛋白。
2，据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法，其中步骤1的P.pastoris的分泌性表达载体是pPIC9k。
3，根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法，其中步骤1的P.pastoris分泌型表达载体其对应的重组菌为分泌表达。
4，根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法，其中步骤2的电转化宿主细胞是GS115宿主细胞。
5，根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法，其中步骤3的高抗性菌株是抗4mg/ml G418的高抗性菌株。
6，根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法，其中步骤4的高表达菌株发酵采用优化的培养基BMGY，BMMY，其中含蛋白胨20％，酵母粉10％，1M磷酸缓冲液10％，5ml/L甲醇和YNB 13.6g/L。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备人载脂蛋白A－I(ApoA－I)的方法。具体涉及利用毕赤酵母系统，通过构建重组工程菌株、表达、分离纯化获得高效生产人载脂蛋白A－I的方法。本发明通过基因工程手段将来源于天然的apoA－I基因重组至P.pastoris宿主菌，表达水平可高达200mg/L，表达产物经冷丙酮分级沉淀和－Sepharose分离纯化获得电泳纯的ApoA－I蛋白。经Western－blot鉴定、蛋白质谱检测、N端氨基酸测序、细胞结合活性测定均与人血来源的ApoA－I蛋白一致。
文档编号C12N15/12GK1594582SQ20041002558
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月30日 优先权日2004年6月30日
发明者吴满平, 宋大新, 周佩, 钟江, 赵志安 申请人:复旦大学