专利名称：层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物酶(肌红蛋白Mb和血红蛋白Hb)在层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料，该材料可用于纳米传感领域，有机芳香化合物的降解及废水处理，属于生物无机复合材料领域。
背景技术：
生物酶是一种高效专一的催化剂，而且反应条件温和，引起了人们的广泛关注。但是由于酶价格昂贵、稳定性差，限制了其在工业上的广泛利用。如何既能保持酶的这种高效专一的催化特性又能克服酶的这些缺陷是人们梦寐以求的目标。而较为有效的解决途径是酶的固定。酶的固定实现了酶的循环使用，从而有效降低成本，而且固定后酶的稳定性提高，并实现了酶在有机溶剂下的催化。酶的固定方法很多，其中载体结合法是研究最多的一种方法，但载体的选取对酶的性质有较大的影响。目前广泛选用的载体多为聚合物及溶胶凝胶一些表面无序的载体，而在有序的层状结构材料层间的固定报道较少。C.V.Kumar等在Chem.Mater.Vol.122(2000)pp 830-837报道了肌红蛋白，溶菌酶，血红蛋白及葡萄糖氧化酶在层状磷酸锆层间的固定，形成了一种微米尺度上的复合；并对固定后生物酶在水溶液中的催化活性进行了报道。Q.Gao等在Chem.Comm.2002 pp 2254-2255报道了肌红蛋白和血红蛋白在层状氧化锰层间的固定，虽然形成了一种生物酶纳米复合材料，但是其不能在常温下实现插层固定，而且固定后生物酶的催化活性仅保留了10％。为了得到高催化活性的生物酶复合纳米材料，必须选择其它的层状载体。
层状硅酸盐(magadiite)是一种多硅酸盐天然矿物，可以很容易地利用水热方法合成。具有较好的稳定性，而且与生物分子有极好的相容性。纳米材料具有更大的比表面积，把具有空旷结构的层状硅酸盐材料(magadiite)同纳米材料大的比表面积结合起来，制备了固定在层状结构(magadiite)层间的生物酶材料复合物。这种生物复合材料在催化、分子传感以及作为酶反应器领域具有潜在的应用。而廉价的层状硅酸盐(magadiite)主体材料也为这种固定化酶的商业化奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有制备固定化酶方法中的酶活性较大损失的缺点，制备了层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料。这种纳米复合材料是一种类似于三明治的夹层结构，层状硅酸盐纳米粒子保持原有的结构不变作为酶固定载体，肌红蛋白或血红蛋白固定于硅酸盐层板之间。根据室温起伏及用量多少的差别，肌红蛋白插层后层间距变化在3.3nm～5.0nm，而血红蛋白插层后层间距变化在5.3nm～7.5nm。固定化酶(肌红蛋白或血红蛋白)的粒径大约为10-50nm左右。
本发明的目的是这样实施的首先利用水热方法合成Na-magadiite，与H+离子交换得到H-magadiite，在搅拌的条件下，同四丁基氢氧化铵(TBAOH)反应，得到TBA+插层的magadiite纳米粒子溶胶；在得到稳定的magadiite纳米溶胶的基础上，同亚铁血红素蛋白(Mb和Hb)进行组装。
由此可见，具体实施可分为两大步第一步制备TBA+插层的magadiite纳米粒子溶胶；第二步将TBA+插层的magadiite纳米粒子溶胶同亚铁血红素蛋白(Mb和Hb)进行组装。现分别详述如下一、层状硅酸盐(magadiite)纳米粒子溶胶的制备钠型层状硅酸盐(Na-magadiite)采用普通的水热方法制备。层状硅酸盐(magadiite)纳米溶胶的制备，有两个步骤首先使钠型层状硅酸盐(Na-magadiite)同稀盐酸(H+)进行离子交换采用0.05-0.2mol/L的盐酸溶液滴定5-10％(重量)的层状硅酸钠悬浮液，直至体系pH＝1.5-3；保持pH值不变，在室温下搅拌24h。经过滤、水洗至没有氯离子存在，空气干燥。X射线粉末衍射结果表明制备的氢型层状硅酸盐(H-magadiite)与文献结果一致。然后取一定量的氢型层状硅酸盐分散在水中，分散比为1∶80-150(重量比)，加入四丁基氢氧化铵(TBAOH)于此悬浮液中，氢型层状硅酸盐(H-magadiite)与四丁基氢氧化铵(TBAOH)的配比为1∶2(分子数比)。搅拌30min，1000转离心，即得透明稳定的层状硅酸盐(magadiite)纳米溶胶。
二、生物酶(Mb和Hb)插层的纳米复合物的制备各取肌红蛋白(Mb)和血红蛋百(Hb)一定量溶于磷酸钾缓冲体系中(4-15mM K2HPO4)，分散比为1-5mg Mb或者Hb/ml。待完全溶解后，储藏备用。纳米复合物的制备取上述配制的肌红蛋白或血红蛋白与上面得到的层状硅酸盐(magadiite)纳米溶胶以一定比5∶2(体积比)混合，室温搅拌1h，即可得到生物酶(Mb和Hb)插层的纳米复合物。离心，冷冻干燥，可得这种固定化酶的复合物粉体。
固定后酶的催化活性同自由酶在水溶液及有机溶剂体系中进行了比较。底物选取邻甲氧基苯酚基和邻苯二胺，氧化剂选取过氧化氢及过丁酸。在活性测试中，固定前后酶的含量固定，在相同的条件下测试30min后酶对底物的转化量。测试手段采用紫外可见吸收光谱，通过在位监测产物的在470nm(相对于邻甲氧基苯酚底物)及496nm(甲苯)及456nm(乙氰)(相对于邻苯二胺底物)的特征吸收峰的强度来定量确定酶对底物的转化量。
这种固定与层间的生物酶复合材料的催化活性同固定前自由生物酶活性对比测试结果表明，催化30min后，在水溶剂条件下，固定后肌红蛋白(Mb)保留了自由肌红蛋白的88.9％，而固定后血红蛋白(Hb)保留了自由血红蛋白的90.4％。而在有机溶剂甲苯条件下，固定后生物酶的催化活性均高于自由生物酶；固定后肌红蛋白(Mb)相对于自由肌红蛋白增加了60％，固定后血红蛋白(Hb)相对于自由肌红蛋白增加了113％。在有机溶剂乙氰条件下，固定后肌红蛋白(Mb)相对于自由肌红蛋白增加了60％，固定后血红蛋白(Hb)相对于自由肌红蛋白增加了342％。固定后生物酶在甲苯溶剂中放置30天后的催化活性测试表明，自由生物酶的活性几乎完全失去，而固定后肌红蛋白的催化活性仍保留了放置前的29％，固定后血红蛋白的催化活性仍保留了放置前的31％。表明固定后生物酶在水溶剂条件下保留了固定前自由酶的大部分活性，在有机溶剂条件下，固定后生物酶的活性要超过自由生物酶的活性，而且固定后的生物酶的稳定性也大大提高。
利用这种层状载体作为生物酶的固定载体得到的生物酶复合材料相对于其它方法(如溶胶凝胶，共价固定)得到的固定化酶材料而言，有两个优势一是固定后的生物酶在层间排列具有有序性，为其在生物器件中的潜在应用奠定了基础；二是固定后的生物酶结构没有明显破坏，保留了大部分(水溶剂)或超过自由酶的催化活性及稳定性(有机溶剂)。
因此，本发明提供的层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料的特点在于1.固定化酶粒径分布比较均匀，尺寸在10-50nm左右。
2.该固定化酶生产工艺简单、所需生产设备简单，易于实现工业化生产。
3.固定后酶活性在水溶液中略有降低，在有机溶剂中活性超过自由酶。
4.固定后酶的稳定性大大提高。
5.可以推广到其它生物酶固定。
图1为生物酶在插层前后的X射线衍射图。a)为钠型层状硅酸盐(Na-magadiite)。b)为氢型层状硅酸盐(H-magadiite)。c)为四丁基铵离子插层的层状硅酸盐(TBA-magadiite)。d)为肌红蛋白插层的纳米复合物(Mb-magadiite)。e)为血红蛋白插层的纳米复合物(Hb-magadiite)。图1表明肌红蛋白、血红蛋白引入层状硅酸盐层间。
图2为生物酶在插层前后的层状硅酸盐(magadiite)板层变化的场发射扫描电境照片。a)为钠型层状硅酸盐(Na-magadiite)。b)为氢型层状硅酸盐(H-magadiite)。c)为四丁基铵离子插层的层状硅酸盐(TBA-magadiite)。d)为肌红蛋白插层的纳米复合物(Mb-magadiite)。
图2表明肌红蛋白插层后与层状硅酸盐形成了纳米复合物。
图3为生物酶在插层前后的高分辨电境图。a)为四丁基铵离子插层的层状硅酸盐(TBA-magadiite)。b)为肌红蛋白插层的纳米复合物(Mb-magadiite)。图3表明肌红蛋白确已引入层间。
图4为生物酶在插层前后在水溶液中的活性比较。a)为固定前后肌红蛋白；b)为固定前后血红蛋白。(固定后肌红蛋白/血红蛋白immo-Mb/Hb；自由肌红蛋白/血红蛋白free Mb/Hb；空白对比TBA-mag)图4表明固定后生物酶保留了大部分自由生物酶活性。
图5为生物酶在插层前后在甲苯溶剂中的活性比较。a)为固定前后肌红蛋白；b)为固定前后血红蛋白。(固定后肌红蛋白/血红蛋白immo-Mb/Hb；自由肌红蛋白/血红蛋白free Mb/Hb；空白对比TBA-mag)图5表明固定后生物酶的活性要高于自由生物酶。
图6为生物酶在插层前后在乙氰溶剂中的活性比较。a)为固定前后肌红蛋白；b)为固定前后血红蛋白。(固定后肌红蛋白/血红蛋白immo-Mb/Hb；自由肌红蛋白/血红蛋白free Mb/Hb；空白对比TBA-mag)图6表明固定后生物酶的活性要高于自由生物酶。
图7为生物酶插层前后在甲苯溶剂中放置30天后的活性比较，表明固定后生物酶在甲苯中具有更高的稳定性。
权利要求
1.层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料，其特征在于该材料类似于三明治的夹层结构，层状硅酸盐纳米粒子保持原有的结构不变作为酶固定载体，肌红蛋白与血红蛋白固定于硅酸盐层板之间。
2.按权利要求1所述的层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料，其特征在于肌红蛋白插层后层间距变化在3.3nm～5.0nm，血红蛋白插层后层间距变化在5.3nm～7.5nm。
3.按权利要求1所述的层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料，其特征在于固定化酶的粒径大约为10-50nm左右。
4.按权利要求1所述的层状硅酸盐层间固定的生物酶复合材料，其特征在于这种固定化酶在水溶液中仍然保持了可与自由酶可比的催化活性，而在有机溶剂中却呈现出了比自由生物酶更高的催化活性及稳定性。
全文摘要
本发明利用生物酶在层状材料层间的自组装方法制备了一种层状硅酸盐层间固定的生物酶纳米复合材料，属于生物无机纳米复合材料领域。这种纳米复合材料类似于三明治的结构，层状硅酸盐纳米粒子保持原有的结构不变作为酶固定载体，肌红蛋白与血红蛋白固定于硅酸盐层板之间。该材料稳定性高，在有机溶剂中催化活性高于自由的生物酶，其制备方法具有工艺简单、生产成本低和可大规模生产等特点。
文档编号C12N11/00GK1632115SQ20041002579
公开日2005年6月29日 申请日期2004年7月6日 优先权日2004年7月6日
发明者高秋明, 彭淑鸽 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所