专利名称：一种大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体，可作为疫苗中的免疫原性成分，例如抗肠毒素引起的腹泻的疫苗或作为其他疫苗的佐剂。该突变体可以通过重组DNA技术从编码野生型大肠杆菌不耐热肠毒素的基因获得。
背景技术：
绝大多数传染性疾病都是通过粘膜途径而进入人体。对传染性疾病的治疗，疫苗显然是一种较为方便、经济的手段。现有疫苗大部分仍采用注射方式接种，通过注射途径的免疫虽能大量增加血液内特异抗体水平，但局部的粘膜抗体水平—抵御病原入侵的第一道屏障—却较低下，因而疫苗的对机体的保护作用就不可避免地大打折扣另外，不洁注射器还可能带来新的传染，如艾滋等。鉴于此，通过粘膜途径的免疫接种方式便受到越来越多的重视，成为当今免疫学的一个研究热点。但是，许多抗原单独作用粘膜部位后，不能诱使机体产生特异的局部分泌抗体，也不能产生系统性的特异抗体，它们必须由具有很强免疫原性的佐剂的辅佐才能发挥其免疫作用。在粘膜免疫佐剂中，大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)因其强烈的佐剂效应[Rappuoli R，Pizza M，Douce G，Dougan G.Structure and mucosal adjuvanticity of choleraand Escherichia coli heat-labile enterotoxins(霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素的结构与粘膜佐剂活性).Immunol Today.1999，20(11)493-500.]和免疫调节作用[Ryan EJ，McNeela E，Pizza M，Rappuoli R，ONeill L，Mills KH. Modulation of innate and acquired immune responsesby Escherichia coli heat-labile toxindistinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic ABcomplex and the enzyme activity(大肠杆菌不耐热肠毒素对先天和获得免疫响应的调节无毒AB复合体和具酶活性毒素对促进和抵抗炎症反应的显著不同的效应).J Immunol.2000，165(10)5750-5759.Plant A，Williams NA.Modulation of the Immune Response by theCholera-like Enterotoxins(霍乱毒素样毒素的免疫响应调节).Curr Top Med Chem.2004，4(5)509-519]而受到更多的关注。
大肠杆菌不耐热肠毒素是产毒大肠杆菌产生的一种能导致人畜腹泻的毒素。该毒素为一六聚体蛋白，由一个分子量约28kD的A亚基和5个分子量约为12kD的B亚基(LTB)构成的六聚体(Mr～90kD)。LTA具有ADP-核糖基转移酶活性，可使胞内cAMP水平升高，细胞流体及电解质流失，进而导致腹泻。五聚体的B亚单位含有细胞表达神经节苷脂(GM1)结合位点，通过LTB与GM1的结合，LT得以进入胞内并进而发挥毒性[Pizza M，Giuliani MM，Fontana MR，Monaci E，Douce G，Dougan G，Mills KH，Rappuoli R，Del Giudice G.Mucosalvaccinesnon toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants(粘膜疫苗大肠杆菌不耐热肠毒素和霍乱毒素的无毒衍生物作为粘膜佐剂).Vaccine.2001，19(17-19)2534-2541]。野生型LT基因定位于产毒性大肠杆菌的大质粒上[Yamomoto T，Yolota T.Host-dependent，thermosensitive replication of an R plasmid，PJY5，isolated from enterobacter cloacae(从enterotbactercloacae中分离的一R质粒-pJY5-的宿主依赖，温度敏感复制).J.Bacteriol.，1977，132(3)923-930]，LTA与LTB的通过一完整的DNA序列表达，在LT基因上存在一移码阅读框，带信号肽的LTA前体与带信号肽的LTB前体被分别表达并被转运到胞周质而完成切去信号肽的全毒素的组装。野生LT基因的表达效率极其低下，而要产生具正常活性的重组LT须将LT基因完整插入表达载体，但这大大限制了其产率的提高，现报道的最高表达效率也仅46mg/L培养基[冯强 蔡绍皙 杨珺 邹全明等大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及纯化保存策略生物工程学报，2003，19(5)532-537]，很难满足大规模生产的需要。
发明内容
本发明针对现有LT表达效率不高，不利于大规模生产以作为粘膜免疫佐剂的问题，其首要目的是构建一种大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体，提高LT的表达效率。
本发明的第二个目的是在新构建LT突变体的基础上结合LTA1结构域的突变构建新型无毒或低毒粘膜免疫佐剂。
实现本发明目的，采用以下技术实现方案根据LT的X射线衍射结果分析[Sixma TK，Pronk SE，Kalk KH，Wartna ES，van Zanten BA，Witholt B，Hol WG.Crystal structure of a cholera toxin-related heat-labile enterotoxin from E.coli(与霍乱毒素相关的大肠杆菌不耐热肠毒素的晶体结构).Nature.1991，351(6325)371-377]，LTA与LTB五聚体的直接联系在于LTA的A2结构域与LTB五聚体环孔的相互作用。我们推测LT全毒素的稳定性与这一相互作用密切相关，而稳定性的增加可能会使得全毒素在胞周质内组装的增加从而导致LT表达效率的提高。
本发明构建的一种大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体LTDITH，是采用定点突变技术将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位的相应氨基酸突变而得。
大肠杆菌不耐热肠毒素由240个氨基酸的LTA亚单位及五个含103氨基酸的LTB亚单位构成，其DNA序列及氨基酸组成如下式表示
LTAAAT GGC GAC AAA TTA TAC CGT GCT GAC TCT AGA CCC CCA GAT GAA ATA AAA CGT TCC GGAAsn Gly Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile Lys Arg Ser Gly10 20GGT CTT ATG CCC AGA GGG CAT AAT GAG TAC TTC GAT AGA GGA ACT CAA ATG AAT ATT AATGly Leu Met Pro Arg Gly His Asn Glu Tyr Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn30 40CTT TAT GAT CAC GCG AGA GGA ACA CAA ACC GGC TTT GTC AGA TAT GAT GAC GGA TAT GTTLeu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr Gln Thr Gly Phe Val Arg Tyr Asp Asp Gly Tyr Val50 60TCC ACT TCT CTT AGT TTG AGA AGT GCT CAC TTA GCA GGA CAG TCT ATA TTA TCA GGA TATSer Thr Ser Leu Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Ala Gly Gln Ser Ile Leu Ser Gly Tyr70 80TCC ACT TAC TAT ATA TAT GTT ATA GCG ACA GCA CCA AAT ATG TTT AAT GTT AAT GAT GTASer Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn Val Asn Asp Val90 100TTA GGC GTA TAC AGC CCT CAC CCA TAT GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT GGA ATA CCALeu Gly Val Tyr Ser Pro His Pro Tyr Glu Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro110 120TAT TCT CAG ATA TAT GGA TGG TAT CGT GTT AAT TTT GGT GTA ATT GAT GAA CGA TTA CATTyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr Arg Val Asn Phe Gly Val Ile Asp Glu Arg Leu His130 140CGT AAC AGG GAA TAT AGA GAC CGG TAT TAC AGA AAT CTG AAT ATA GCT CCG GCA GAG GATArg Asn Arg Glu Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Ile Ala Pro Ala Glu Asp150 160GGT TAC AGA TTA GCA GGT TTC CCA CCG GAT CAC CAA GCT TGG AGA GAA GAA CCC TGG ATTGly Tyr Arg Leu Ala Gly Phe Pro Pro Asp His Gln Ala Trp Arg Glu Glu Pro Trp Ile170 180CAT CAT GCA CCA CAA GGT TGT GGA AAT TCA TCA AGA ACA ATT ACA GAT GAT ACT TGT AATHis His Ala Pro Gln Gly Cys Gly Asn Ser Ser Arg Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn190 200GAG GAG ACC CAG AAT CTG AGC ACA ATA TAT CTC AGG AAA TAT CAA TCA AAA GTT AAG AGGGlu Glu Thr Gln Asn Leu Ser Thr Ile Tyr Leu Arg Lys Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg210 220CAG ATA TTT TCA GAC TAT CAG TCA GAG GTT GAC ATA TAT AAC AGA ATT CGG GAT GAA TTAGln Ile Phe Ser Asp Tyr Gln Ser Glu Val Asp Ile Tyr Asn Arg Ile Arg Asn Glu Leu230 240LTBGCT CCC CAG TCT ATT ACA GAA CTA TGT TCG GAA TAT CGC AAC ACA CAA ATA TAT ACG ATAAla Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile
10 20AAT GAC AAG ATA CTA TCA TAT ACG GAA TCG ATG GCA GGT AAA AGA GAA ATG GTT ATC ATTAsn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile30 40ACA TTT AAG AGC GGC GCA ACA TTT CAG GTC GAA GTC CCG GGC AGT CAA CAT ATA GAC TCCThr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser50 60CAA AAA AAA GCC ATT GAA AGG ATG AAG GAC ACA TTA AGA ATC ACA TAT CTG ACC GAG ACCGln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr70 80AAA ATT GAT AAA TTA TGT GTA TGG AAT AAT AAA ACC CCC AAT TCA ATT GCG GCA ATC AGTLys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser90 100ATG GAA AACMet Glu Asn103上式中的数字表示氨基酸序号。
突变体LTDITH的特征在于该蛋白质在229、230、232、233位氨基酸残基的改变，它们由Glu、Val、Ile、Tyr分别改变为天冬氨酸Asp、异亮氨酸Ile、苏氨酸Thr和组氨酸His。由于有这4个氨基酸的突变，LTDITH具有比重组LT产率高、结构稳定、毒性低的优点，而免疫原性则没有改变。
上述突变体的制备包括以下步骤1、新型大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的构建2、重组工程菌的表达3、重组LT及重组LTDITH的纯化与保存以下是对上述获得的新型大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的性质的测定1、表达产率的比较重组LT及重组LT突变体LTDITH 5L发酵，取发酵各时点重组菌进行Tricine-SDS-PAGE观察LT表达的差异[附图1]。发酵结束后收集细菌，破菌收取上清液进行纯化，统计纯化得率得到如下结果。重组LT为46mg/L培养基；重组LTDITH为160mg/L。
2、结构稳定性的比较(1)纯化的重组LT及LTDITH进行10％SDS-PAGE，观察二者的电泳行为[附图2]，LTDITH六聚体成分保持得更好。
(2)LT及LTDITH突变体在胰酶(胰酶毒素＝1∶100摩尔浓度)37□作用15min、30min和1h后，进行Tricine-SDS-PAGE[附图3]，由图可见重组LT在胰酶消化后大量出现LTA1片段，而重组LTDITH则更加稳定。
(3).HPLC检测LT与LTDITH的稳定性A.平衡层析柱将装于Agilent HPLC仪上的OHpak SB-800柱用TEAN(pH7.3)在0.25mL/min流速下进行平衡。
B.上样将LT及LTDITH用上样针上样50μL，确保上样量一致。
C.用TEAN(pH7.3)在0.25mL/min流速下洗脱样品。
D.记录280nm的吸收值A280。
E.用含1％SDS的TEAN(pH7.3)平衡层析柱。
F.各样品上样前加SDS至终浓度为1％，用与B中同体积同样品量上柱。
G.用含1％SDS的TEAN(pH7.3)对柱内样品进行洗脱。
H.记录280nm的吸收值A280。
I.得结果如附图4所示，由图可见，在含1％SDS缓冲液洗脱下LTDITH六聚体保持得更好，即稳定性更好。
3、毒性的比较用Patent-mouse毒性检测实验进行。具体如下(1)3组(5只/组)6周龄雌性C57BL/6小鼠断食不断水24h，先饲以300μL胃酸中和液。
(2)10min后，3组分别饲以300μL TEAN(pH7.3)、含100μgLT的TEAN(pH7.3)、含100μgLTDITH的TEAN(pH7.3)。
(3)继续断食不断水，3h后将动物处死，小心从幽门至肛门取其肠段(gut)并称重，同时称取剩下的畜体(carcass)重量，算出每只小鼠的Gut/Carcass比值(G/C值)，并求出每组的平均值及标准差。
(4)得结果如附图5所示，由图可见，重组LTDITH比重组LT的毒性显著降低。
4、免疫原性的比较3组(5只/组)6周龄雌性C57BL/6小鼠分别用200μL TEAN(pH7.3)，含15μg重组LT的200μL TEAN(pH7.3)，含15μg LTDITH的200μL TEAN进行腹腔免疫，免疫在第0、7、14、21天进行，小鼠在第31天处死，取血清。血清中抗重组LT及抗LTDITH的效价用ELISA法测定。显色后测定A492nm，血清抗rLTB或抗CTB的效价表示为实验组A492nm/阴性对照A492nm＞2.1的最高稀释倍数，并以平均值±标准差显示。
结果显示血清中抗重组LT与抗LTDITH的IgG水平，前者的滴度为105.4±0.55，后者的滴度为105.2±0.84，二者的免疫原性没有区别。
附图1是重组LT(a)与重组LTDITH(b)在M9-CAA培养基中的表达比较LTA用箭头示出LTB用空心三角示出1.种子菌2.0.5mmol/L IPTG诱导前细菌3-7.0.5mmol/L IPTG诱导后1-5小时细菌。
附图2是重组LT(a)及重组LTDITH(b)的10％SDS-PAGE比较由图可见重组LTDITH的六聚体成分保持得更好，即稳定性更高。
附图3是重组LT(a)及重组LTDITH(b)在胰酶消化15min、30min和1h后比较。ALTA，A1LTA1，BmLTB由图可见重组LT在胰酶消化后大量出现LTA1片段，而重组LTDITH则更加稳定。
附图4是重组LT(a)及重组LTDITH在有(下图)无(上图)含1％SDS缓冲液洗脱下的HPLC图形。AB5全毒素六聚体B5LTB五聚体BLTB单体。由图可见，在含1％SDS缓冲液洗脱下LTDITH六聚体保持得更好，即稳定性更好。
附图5是Patent-mouse毒性检测实验检测到的重组LT及重组LTDITH的毒性差异*P＜0.05。由图可见，重组LTDITH比重组LT的毒性显著降低。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作详细描述实施例1新型的大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的构建1、克隆野生大肠杆菌不耐热肠毒素基因(1)用改良的基因组提取方法从野生型产毒性大肠杆菌中提取携带编码LT基因的质粒[冯强 邹全明蔡绍皙等LT质粒的新法提取及无毒突变体LTS63K的构建和序列分析免疫学杂志，2002，18(5)385-388](2)按GenBank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因序列设计如下引物P1GGAATTCCCATATGAAAAATATAAC，P2TAGGATCCTCCTAGCATTAGACAT。
(3)用PCR法从编码LT基因的质粒上扩增出lt基因，并将该基因克隆入pMD18-T。2、野生型大肠杆菌不耐热肠毒素基因的第一次改造
为了将大肠杆菌不耐热肠毒素基因从多克隆位点Nde及BamH插入表达载体pET11c，先将基因内的Nde酶切位点进行不改变氨基酸组成的突变，突变引物如下P3CTCCTGTTCGTATGGGTGAGGGCTG；P4CTCACCCATACGAACAGGAGGTTTC。P3、P4结合1、(2)中的引物P1、P2通过重叠延伸法将编码LTY109的碱基由TAT突变为TAC。该突变不被Nde I识别，但编码的氨基酸残基不变[冯强 邹全明蔡绍皙等LT质粒的新法提取及无毒突变体LTS63K的构建和序列分析免疫学杂志，2002，18(5)385-388]，突变后的lt基因片段重新克隆入pMD18-T形成pMD18-LT。
3、大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体(LTDITH)的构建设计如下引物P5CAGATATTGACACACATAACAGAATTC；P6ACTGATAGTCTGAAAATATCTGCCT，以pMD18-LT作模板，用TaKaRa MutanBEST Kit(大连)按产家给出的操作步骤进行突变得pMD18-LTDITH，由TaKaRa(大连)公司测序验证突变正确性。
4、重组表达载体及重组工程菌的构建将pMD18-LT及pMD18-LTDITH分别用Nde和BamH双酶切获得目的基因后插入经同样双酶切的载体pET11c，得到pET11c-LT及pMD11c-LTDITH，重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)获得重组工程菌。
实施实例2新型大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达取新转重组质粒的E.coli BL21(DE3)单菌落于含4mL LB培养基的试管中培养8h。按50μL菌液接种500mL LB培养基在烧瓶中继续培养8h至A600nm≈1.5。同时对试管中细菌质粒进行鉴定，取质粒正确的种子菌500mL接种。将种子菌接种于5L改良M9-CAA培养基，抗生素浓度为Amp 100μg/mL。在BIOSTAT 10L自控发酵罐中发酵3h后流加补料2L，补料成分20％葡萄糖，8％胰蛋白胨，8％酵母提取物。A600nm≈30时加IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。诱导5小时后4离心收菌[冯强 蔡绍皙 杨珺 邹全明等大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及纯化保存策略生物工程学报，2003，19(5)532-537]。
实施实例3重组LT及重组LTDITH的纯化与保存将离心收集的湿菌用10倍体积的TEAN(pH7.3)缓冲液重悬，高压均质机70MPa破菌3次，油镜检查破菌效果；细胞破碎液16000g×30min 4℃离心收集上清液；上清液16000g×30min 4℃离心弃沉淀；上清过0.22μm滤膜，收集滤液；用TEAN(pH7.3)1.5mL/min流速平衡Immobilized D(+)-galactose亲和柱(Pierce，美国)，调校A280nm基线。将经过超滤的上清以1.5mL/min流速上柱。待上样200mL后，用TEAN(pH7.3)缓冲液冲洗杂蛋白至A280nm回复至基线；用含0.3mol/L半乳糖(Galactose)洗脱缓冲液洗脱结合于柱上的LT或LTDITH，收集洗脱峰；合并洗脱峰，测定蛋白浓度；纯化出的LT通过Lowery法测定浓度马上用冻干机冻干后保存于4[冯强 蔡绍皙 杨珺 邹全明等大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及纯化保存策略生物工程学报，2003，19(5)532-537]。
权利要求
1.一种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体，其特征在于在A亚单位第229、230、232、233位其中一个或多个氨基酸被突变为，即在第229位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸，第230位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸，第232位氨基酸由异亮氨酸突变为苏氨酸，第233位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸，该新型突变体命名为LTDITH。
2.权利要求1所述的一种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤(一)新型大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的构建(1)克隆野生大肠杆菌不耐热肠毒素基因(2)对野生型大肠杆菌不耐热肠毒素基因的第一次改造为了将大肠杆菌不耐热肠毒素基因从多克隆位点Nde及BamH插入表达载体pET11c，先将基因内的Nde酶切位点进行不改变氨基酸组成的突变，突变引物如下P3CTCCTGTTCGTATGGGTGAGGGCTG；P4CTCACCCATACGAACAGGAGGTTTC。P3、P4结合1、(2)中的引物P1、P2通过重叠延伸法将编码LTY109的碱基由TAT突变为TAC，该突变不被Nde I识别，但编码的氨基酸残基不变，突变后的1t基因片段重新克隆入pMD18-T形成pMD18-LT；(3)大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体LTDITH的构建设计如下引物P5CAGATATTGACACACATAACAGAATTC；P6ACTGATAGTCTGAAAATATCTGCCT，以pMD18-LT作模板，用TaKaRa MutanBEST Kit(大连)按厂家给出的操作步骤进行突变得pMD18-LTDITH，测序验证突变正确性；(4)重组表达载体及重组工程菌的构建将pMD18-LT及pMD18-LTDITH分别用Nde和BamH双酶切获得目的基因后插入经同样双酶切的载体pET11c，得到pET11c-LT及pMD11c-LTDITH，重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)获得重组工程菌。(二)重组工程菌的表达(三)重组LT及重组LTDITH的纯化与保存。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌不耐热肠毒素新型突变体及其制备方法，可作为疫苗中的免疫原性成分，例如抗肠毒素引起的腹泻的疫苗或作为其他疫苗的佐剂。该突变体通过重组DNA技术从编码野生型大肠杆菌不耐热肠毒素的基因获得，其特征在于该蛋白质在229、230、232、233位氨基酸残基的改变，它们由Glu、Val、Ile、Tyr分别改变为天冬氨酸Asp、异亮氨酸Ile、苏氨酸Thr和组氨酸His。由于有这4个氨基酸的突变，使其具有比重组LT产率高、结构稳定、毒性低的优点，而免疫原性则没有改变。
文档编号C12N15/31GK1696291SQ20041004023
公开日2005年11月16日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者邹全明, 冯强, 杨珺, 罗萍, 张卫军, 毛旭虎 申请人:中国人民解放军第三军医大学