专利名称：抑制纤连蛋白表达的反义寡核苷酸的结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向纤连蛋白(fibronectin)治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景资料HBV感染严重威胁人类的健康，是导致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。目前仍然缺乏特别有效的治疗药物，因此新型抗HBV药物具有重大的社会和经济效益。
国外文献报道人肝中的纤连蛋白在体内可能以一种种属限制性的方式与HBV通过前S2区编码的抗原决定簇结合(Budkowska A，Bedossa P，Groh F.；J Virol 1995 Feb；69(2)840-8)；P.A.Norton等发现HBxAg可激活fibronectin的表达(P.A.Norton，H.M.G.P.V.Reis，Journal of Viral Hepatitis，2004，11，332-341)。本实验室通过筛选和验证发现fibronectin在抗HBV感染中具有很好的特异性和可药性，可发展成为抗HBV治疗的潜在作用靶点。
ASODN是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于ASODN作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
本发明的目的是，根据已公开的fibronectin基因mRNA序列，设计针对fibronectin的ASODN，通过抑制fibronectin的表达，阻止HBV感染，抑制HBV复制和表达，为治疗慢性HBV感染提供新的特效的药物。
主要内容本发明的主要内容是，通过检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的fibronectin mRNA参考序列X02761，对其进行RNA二级结构的计算机模拟，选择了5个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。在自动DNA合成仪上合成硫代反义寡核苷酸序列(S-ASODN)。采用转染有HBV DNA，可稳定表达HBV蛋白和完整Dane氏颗粒的HepG2.2.15细胞模型，对上述ASODNs进行活性筛选和评价。结果显示5条ASODNs中，FN1，FN5在0.8μmol/L时对HBV DNA，HBsAg，HBeAg，fibronectin蛋白具有明显的抑制作用，且对HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。在0.2-0.8μmol/L浓度范围内，FN1，FN5对HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及fibronectin蛋白具有特异性的剂量依赖性抑制活性。
硫代反义寡核苷酸序列及性质编号 名称 靶位(nt) 长度(nt) 性质反义序列(5’-3’)1 FN12188-2207 20AGCT CAT CTC CCT CCT CAC TC2 FN26478-6497 20ATTC GTT CCC ACT CAT CTC CA3 FN320-40 20ACTG GGG CTG AAC CAT TTG CT4 FN44704-4723 20AGCC TTC AAT AGT CAT TTC TG5 FN56607-6626 20AGAC GGT CCC ACT TCT CTC CA6 FN1s 2188-2207 20SGAG TGA GGA GGG AGA TGA GC7 FN5s 6607-6626 20STG GAG AGA AGT GGG ACC GTCA反义；S正义根据本发明，抑制fibronectin的表达可特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，fibronectin有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物作用靶点。
根据本发明，针对fibronectin mRNA的ASODNs能特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，FN1，FN5的长度根据实验确定，本发明包含了与FN1，FN5具有相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了FN1，FN5的硫代修饰。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他反义寡核苷酸及其衍生物形式。
根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
结合图表
本发明的具体实施方法图1 fibronectin mRNA在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况图2 fibronectin蛋白在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况图3硫代fibronectin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用图4硫代fibronectin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制作用图5硫代fibronectin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用图6硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1，FN5对HepG2.2.15细胞中fibronectin蛋白的抑制作用图7硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1对HepG2.2.15细胞增殖的影响图8硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN5对HepG2.2.15细胞增殖的影响图9硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列对HepG2.2.15细胞中fibronectin蛋白的抑制作用图10硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用图11硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用图12硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1对HepG2.2.15细胞中fibronectin蛋白的抑制作用呈剂量依赖性图13硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN5对HepG2.2.15细胞中fibronectin蛋白的抑制作用呈剂量依赖性图14硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN1对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈剂量依赖性图15硫代fibronectin反义寡核苷酸序列FN5对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈剂量依赖性图16 5条硫代fibronectin反义寡核苷酸序列及性质图17硫代反义寡核苷酸FN1，FN5的正义序列及性质
实施例一材料与方法1.药物配制拉米夫定用PBS溶解至终浓度为10mmol/L；阿地福韦药物用DMSO溶解至终浓度为100mmol/L，加药时用培养液稀释至1mmol/L，以保证DMSO在培养液中的浓度不高于0.1％；IBE5用DMSO溶解至终浓度为250mg/mL。
2.细胞培养所用细胞为肝癌细胞系HepG2细胞株以及转染有HBV DNA的HepG2.2.15细胞株。HepG2.2.15细胞来源于HepG2细胞，含有整合的HBV DNA，在细胞培养过程中可持续稳定地向培养液中分泌Dane氏颗粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2细胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM细胞培养液培养，HepG2.2.15细胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液培养。
3.细胞加药待HepG2.2.15细胞长满后1∶3传代，48小时后换用含2％FBS的MEM培养液，同时加入拉米夫定，阿地福韦或IBE5。拉米夫定终浓度为25μmol/L，阿地福韦终浓度为1μmol/L，IBE5终浓度为250μg/ml，同时设立相应的对照组细胞。加药后4天换含有等浓度药物的细胞培养液，第8天收集细胞。
4.RT-PCR检测fibronectin mRNA在HepG2、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，按照Trizol试剂盒(Invitrogen)说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下各取总RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μl，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscriptII0.5μl，42℃温育1h，最后70℃变性15min。反转录产物取0.5μl作为PCR扩增的模板，以看家基因GAPDH作为内标进行双重PCR。靶基因fibronectin上游引物为5’TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA3’，下游引物为5’CTGCAAGCCTTCAATAGTCA3’，扩增片断为307bp。GAPDH的上游引物为5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物为5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，扩增片断449bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg2+浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃20s，61℃30s，72℃20s，循环22次，最后72℃延伸2min。2％琼脂糖凝胶(Sigma)电泳检测。
5.Western印迹方法检测fibronectin在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，RIPA-PICT(Pharmacia)法提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔30-50μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(PROTRANBA-S 83 Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上。4℃封闭过夜，封闭液组成10％脱脂奶粉，1×TBST。然后与鼠抗人fibronectin抗体(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗体(Sigma)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗鼠二抗(中山)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。
结果1.Fibronectin mRNA在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况等量的HepG2细胞、HepG2.2.15细胞总RNA反转录PCR后，2％琼脂糖凝胶电泳检测表达情况，看家基因GAPDH作为内标。结果如图1中所示，在HepG2细胞中几乎检测不到fibronectin mRNA的表达，而在HepG2.2.15细胞中其表达水平与GAPDH表达水平接近。在25μmol/L拉米夫定以及250μg/ml IBE5处理后，HepG2.2.15细胞中fibronectin mRNA表达明显下调。但在1μM阿地福韦处理后HepG2.2.15细胞中fibronectin mRNA表达只发生微弱下调。图1中control代表fibronectin mRNA在对照组细胞中的相对表达情况；lamivudine、adefovir以及IBE5代表fibronectin mRNA分别在三种药物处理组细胞中的相对表达情况；HepG2、HepG2.2.15代表fibronectin mRNA在HepG2、HepG2.2.15细胞中的相对表达情况。
2.Fibronectin蛋白在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况图2中显示，fibronectin蛋白在HepG2.2.15细胞中相对表达量较高，而在HepG2细胞中几乎检测不到Fibronectin蛋白的表达。25μmol/L拉米夫定以及250μg/mlIBE5处理HepG2.2.15细胞后Fibronectin蛋白明显下调，1μmol/L阿地福韦处理后HepG2.2.15细胞中Fibronectin蛋白表达微弱下调。
结论Fibronectin在HBV感染后表达上调，而在药物干预后表达明显下调，因此可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物作用靶点。
实施例二材料与方法1.S-ASODN的设计和合成检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的fibronectin mRNA参考序列X02761，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，选择了5个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达(见图16)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，过程如下将硫代试剂(Beaucage regent，Transgenomic)溶于无水乙腈中使其终浓度为1g/100ml，置于DNA合成仪的AUX位置处，采用合成仪上提供的DNA硫化程序进行自动合成硫代寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
2.ASODN转染Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种6孔板，1.5×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM并设细胞对照、脂质体对照。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时。收集细胞培养液，-20℃保存备用。提取Hep2.2.15细胞总RNA(Trizol RNA提取试剂盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15细胞总蛋白，-20℃保存备用。
3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用检测取细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为P15’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；荧光探针序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q5’-GTA GTT TCCGGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。
4.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用检测取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAgELISA检测试剂盒(华美公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入显色液A50μl，再加入显色液B50μl，37℃孵育15min，加入终止液50μl，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR＝(A450对照-A450给药)/A450对照计算抑制率。
5.ASODN对Hep2.2.15细胞中fibronectin蛋白的抑制作用检测RIPA-PICT(Pharmacia)提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。然后进行western印迹实验。实验方法参考实施例一。
结果1.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列FN1-FN5，分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，同时设立细胞对照，脂质体对照以及阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，按照公式IR＝(C加药组-C细胞对照组)/C细胞对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表检测出的细胞培养液中HBV DNA拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。图3中C代表细胞对照组，LIP代表脂质体对照组，其对HBVDNA的抑制率接近0，没有明显的抑制作用。LAM10、LAM25分别代表10μM、25μM拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用。FN1-FN5代表五条反义序列在0.8μM时对HBVDNA的抑制作用，从图中可显示，FN1、FN5对HBV DNA的抑制作用大于等于25μM拉米夫定对细胞培养液中HBV DNA的抑制作用。
2.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列FN1-FN5，分别以0.8μM加药处理HepG2.2.15细胞，同时设立细胞对照、脂质体对照以及阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，HBsAgELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBsAg的表达情况，根据公式IR＝(A加药组-A细胞对照组)/A细胞对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值，见图4。图中LIP代表脂质体对照组对细胞分泌HBsAg的抑制作用，显示没有明显抑制作用。LAM代表25μM拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率大于50％。FN1-FN5代表五条反义序列对细胞分泌HBsAg的抑制作用，其中FN1，FN5的平均抑制率大于50％，且大于25μM拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制作用。
3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用靶向ASGPR mRNA的五条反义序列FN1-FN5，分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，72小时后收集细胞培养液，HBeAgELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBeAg的表达情况，根据公式IR＝(A加药组-A细胞对照组)/A细胞对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值，见图5。图中，LIP代表脂质体对照组对细胞分泌HBeAg的抑制作用，显示没有明显抑制作用。LAM代表25μM拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率大于50％。FN1-FN5代表五条反义序列对细胞分泌HBsAg的抑制作用，其中FN1，FN5的平均抑制率大于50％，且与25μM拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制率接近。
4.ASODN对细胞fibronectin蛋白的抑制作用靶向fibronectin mRNA的五条反义序列FN1-FN5，分别以0.8μM给药处理Hep2.2.15细胞，72h后提取总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以β-actin(43kD)为对照，通过Western Blot方法检测硫代反义寡核苷酸对靶蛋白ASGPR表达量的影响。由图6可见，FN1，FN5可显著抑制fibronectin蛋白的表达，FN2，FN4对fibronectin蛋白无明显抑制作用，FN3对fibronectin蛋白无抑制作用。
结论1.抑制fibronectin的表达可以抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达2.五条硫代fibronectin反义寡核苷酸序列中，FN1，FN5具有明显的抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的作用。
实施例三材料与方法1.ASODN的设计与合成根据实施例二结果，选择效果较好的反义寡核苷酸序列FN1、FN5，合成其正义寡核苷酸(见图17)。所有硫代寡核苷酸的合成同实施例二。
2.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5的细胞毒性检测Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸FN1，FN5的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM并设细胞对照，每浓度重复三孔。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时后，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，37℃避光孵育1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，转染ASODN后每日在倒置显微镜下观察细胞形态。
3.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5的特异性考察硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列FN1s，FN5s分别以0.8μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例二。收集培养液，提取总RNA和总蛋白，参照实施例一、例二的方法，检测FN1，FN5及其正义序列对细胞培养液中HBsAg，HBeAg的抑制作用，FN1，FN5及其正义序列对fibronectin蛋白的抑制作用。
4.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5的剂量依赖性检测硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5以0.2μM、0.4μM、0.8μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例一。收集培养液，提取总蛋白，参照实施例一、例二的方法，检测FN1，FN5不同浓度对细胞培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用以及对fibronectin蛋白的抑制作用。
结果1.硫代反义寡核苷酸FN1，FN5对HepG2.2.15细胞增值的影响硫代反义寡核苷酸FN1，FN5以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM处理细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有显著变化。细胞增殖实验检测结果见图7、图8。图中显示，在0.2μM-10μM范围内，FN1、FN5各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。
2.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5的特异性硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列FN1s，FN5s分别以0.8μM转染HepG2.2.15细胞，收集培养液，ELISA检测试剂盒检测培养液中HBsAg、HBeAg的表达情况，设对照细胞培养液中HBsAg、HBeAg的含量为100％，实验组中HBsAg、HBeAg的含量则为A实验组/A细胞对照组×100％，其中A表示在450nm的吸光度。结果见图10，11。图中显示FN1，FN5的正义硫代寡核苷酸序列(FN1s，FN5s)处理组细胞培养液中HBsAg、HBeAg与正常细胞对照无显著差异(P≥0.05)。而硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5具有很好的抑制作用(抑制率≥50％)。同样，在硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5及其正义序列FN1s，FN5s分别以0.8μM转染HepG2.2.15细胞后72小时，提取总蛋白，western检测结果显示FN1s，FN5s处理细胞组fibronectin蛋白表达与对照组基本一致，而FN1，FN5显示出很好的抑制fibronectin蛋白表达的作用(见图9)。
3.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5对HBV复制和表达影响的剂量依赖性。
硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5以0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM给药处理HepG2.2.15细胞后，收集培养液，荧光定量PCR检测培养液中HBV DNA的拷贝数，ELISA检测试剂盒检测培养液中HBsAg、HBeAg的表达情况，根据实施例二中的公式分别计算抑制率。重复三次实验，计算抑制率的平均值。如图14和图15，FN1，FN5对细胞培养液中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制作用随着硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5浓度的增加而递减，显示出很明显的剂量依赖关系。同样，在0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM FN1，FN5处理细胞后72小时，提取总蛋白，western印迹技术检测fibronectin蛋白的表达情况，结果如图12、13所示，随着FN1，FN5浓度的增加，fibronectin蛋白表达量逐渐减少，0.8μM时，FN5处理细胞组几乎检测不到fibronectin蛋白的表达。
结论1.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5对HepG2.2.15细胞的增殖没有明显的影响2.硫代反义寡核苷酸序列FN1，FN5具有序列特异的抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达的作用3.在0.2-0.8μmol/L浓度范围内，FN1，FN5对HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及fibronectin蛋白具有特异性的剂量依赖性抑制活性。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所<120>抑制纤连蛋白(fibronectin)表达的反义寡核苷酸的结构和用途<130>
<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>
<400>1gctcatctcc ctcctcactc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>
<400>2ttcgttccca ctcatctcca 20<210>3<211>20<212>DNA<213>
<400>3ctggggctga accatttgct 20<210>4<211>20<212>DNA<213>
<400>4gccttcaata gtcatttctg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>
<400>5gacggtccca cttctctcca 20
权利要求
1.纤连蛋白(fibronectin)为抗乙型肝炎病毒感染的药物作用靶点
2.与fibronectin mRNA(GeneBank接受号X02761)互补的寡核苷酸，分布在5’非编码区和编码区，其长度是10-30个碱基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反义寡核苷酸序列及性质序号 名称Fibronecti 长度 特性序列(5’-3’)n靶位(nt)(nt)1 FN1 2188-220720 AGCT CAT CTC CCT CCT CAC TC2 FN2 6478-649720 ATTC GTT CCC ACT CAT CTC CA3 FN3 20-4020 ACTG GGG CTG AAC CAT TTG CT4 FN4 4704-472320 AGCC TTC AAT AGT CAT TTC TG5 FN5 6607-662620 AGAC GGT CCC ACT TCT CTC CA
3.根据权利要求书2中的寡核苷酸，其最佳序列为FN1，FN5
4.根据权利要求书2中的寡核苷酸，经不同化学修饰后，可以用于治疗乙型肝炎及相关性疾病。
5.权利要求书3中的寡核苷酸化学修饰物可以是硫代修饰。
6.权利要求4中经化学修饰后的寡核苷酸可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于乙型肝炎及其相关性疾病的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种新的抗乙型肝炎病毒靶标及相应的反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是靶向纤连蛋白(fibronectin)抗乙型肝炎病毒(HBV)反义寡核苷酸的结构和用途。Fibronectin是人肝脏窦状隙的细胞外基质成分，有文献报道fibronectin可与乙肝病毒的前S2区以一种种属特异性的方法结合。本实验室应用基因芯片技术筛选并通过验证，发现fibronectin具有较好的特异性和可药性。因此，本实验室设计合成了靶向fibronectin的反义寡核苷酸，采用HepG2.2.15细胞，对5条反义寡核苷酸进行了活性筛选及评价，首次发现互补于fibronectin mRNA特定功能区域的寡核苷酸FN1，FN5在培养的HepG2.2.15细胞中能有效地抑制乙型肝炎的复制和表达。因此，本发明涉及到靶向fibronectin mRNA抗HBV感染的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为治疗乙型肝炎病毒相关性疾病，减小乙型肝炎相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号C12N15/12GK1651575SQ200410073618
公开日2005年8月10日 申请日期2004年9月2日 优先权日2004年9月2日
发明者王升启, 杨静, 伯晓晨, 丁晓然, 张敏丽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所