专利名称：核酸标记方法以及核酸标记用液组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及的核酸标记方法是特征如下的核酸标记方法在边掺入标记底物，边通过PCR法进行靶核酸扩增的核酸标记方法中，选择ATCG的4种底物中的一种至3种的底物，与没有被选择的剩下的底物相比，将上述被选择的底物的浓度减少，而且作为上述被选择的底物含有无标记脱氧核苷酸和带标记脱氧核苷酸。
另外，本发明中涉及的靶核酸的检测方法是特征如下的靶核酸检测方法在使含有靶核酸的产物与固定于固相上的探针反应，利用标记对与固相上探针杂交的上述靶核酸进行检测的靶核酸检测方法中，对于上述产物通过上述的核酸标记方法将该产物中含有的靶核酸做成实施了标记的PCR产物之后，与上述固相上的探针反应。
另外，本发明中涉及的用于核酸标记的PCR用溶液组合物是特征如下的溶液组合物作为边掺入标记物质，边通过PCR进行靶核酸扩增时的含有ATCG的4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度比没有被选择的剩下的脱氧核苷酸的浓度低，相对于上述被选择的脱氧核苷酸，含有带标记脱氧核苷酸。
另外，本发明涉及到的用于检测靶核酸的试剂盒含有如下引物和探针 A)用于扩增靶核酸的PCR引物， B)作为含有ATCG 4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度比没有被选择的剩下的脱氧核苷酸的浓度低，相对于上述被选择的脱氧核苷酸，含有带有标记的脱氧核苷酸， C)在固相上配置了用于与上述靶核酸反应的探针的固相探针。
固相探针最好是DNA微阵列。
利用本发明的核酸标记方法在边掺入标记底物，边通过PCR法进行靶核酸扩增时，对于添加了带标记脱氧核苷酸的底物通过将浓度调低，可以更有效地掺入标记物质。而利用本发明的靶核酸的检测方法，通过固相杂交可以使靶核酸的检测灵敏度提高。
图1表示在pUC118 EcoRI/BAP中两个引物以及一个探针的图。箭头表示在各个引物中由5’至3’的方向。
具体实施例方式 本发明的核酸标记方法其特征是在边掺入标记底物，边通过PCR(聚合酶链式反应)法进行靶核酸扩增时，选择A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)4种底物中一种至3种底物作为赋予标记的底物，使上述被选择的底物的浓度比没有被选择的剩下的底物的浓度低，而且在选择的底物中含有带标记脱氧核苷酸。另一特征是将作为选择的底物的“无标记脱氧核苷酸”和“带标记脱氧核苷酸”的总浓度调整到比没有被选择的各个底物的浓度都低。通过使用这样标记化条件的PCR扩增，制备产物，靶核酸在扩增过程中可以有效地掺入标记物质。
另外，带标记脱氧核苷酸的浓度越高，越有利于标记物质的掺入。作为被选择的底物中的带标记脱氧核苷酸，如果将PCR反应液中的浓度调整到20μM以上，本发明可更有效地发挥作用。将没有被选择的碱基在PCR反应液中的脱氧核苷酸的浓度调整为150～300μM，被选择的底物浓度调整为没有被选择的底物的5～80％(摩尔数基准)，优选将被选择的底物中带标记脱氧核苷酸对被选择的底物中的无标记脱氧核苷酸的比例(摩尔基准数)调整到0.25以上。另外，更优选将被选择的底物调整到没有被选择的底物的10～40％(摩尔基准数)。最优选如果将作为被选择的底物中的带标记脱氧核苷酸对无标记脱氧核苷酸的比例(摩尔基准数)调整到1以上。在这样的条件下进行产物制备，即使少量的带标记核苷酸也可以有效地将标记物质掺入到靶核酸中。
作为标记物质，无论什么样的标记物质都可以没有特别限制地用于本发明，但一般使用可高灵敏度检测的荧光物质等。其中，以Cy3、Cy5为代表的CyDye(Amersham Bioscience公司生产)常用作核酸标记用的荧光物质，这些荧光物质在本发明中特别有效。另外，生物素、氨基烯丙基系化合物等核酸标记用物质在本发明的产物制备方法中也都有效。
进行本发明产物制备的靶核酸可以用于通过固相上杂交进行检测中。虽然利用本发明的PCR有时产量低，但在可高灵敏度地对少量产物进行检测的检测装置中可以特别发挥作用。其中，对DNA微阵列特别有效。另外，优选DNA微阵列的每一点的面积在10-6平方米以下。点面积的下限可以根据相应于目的分析用途使用的扫描器等用于测定结果的仪器的灵敏度等设定，例如也可做小到10-12平方米左右。
另外，本发明还提供在上述制备方法中使用的溶液组合物。
以下对于本发明的核酸标记方法进行更详细说明。
本发明提供的核酸标记方法通过在作为利用PCR对靶核酸序列进行扩增时使用的底物ATCG 4种脱氧核苷酸中，选择1种至3种底物，使被选择的底物的浓度比没被选择的底物浓度低，而且作为被选择的底物至少使用带标记脱氧核苷酸实施。特别是作为赋予标记的底物选择的底物可以使用赋予标记和没有实施标记的底物的混合物，通过将没有实施标记的底物的浓度调整到比作为实施标记没有被选择的底物浓度都低，使带有标记的底物所占的比例增大，可以有效地掺入标记物质。
另外，通过将被选择的底物的浓度调整到比没被选择的底物的浓度都低，可以获得更好的效果。例如，选择T作为标记底物时，将没有标记的dTTP和标记的dUTP并用，使dTTP和标记的dUTP的总量比没有标记的dATP、dCTP以及dGTP的各个浓度都低[(dTTP+标记的dUTP的浓度＜(dATP、dCTP或dGTP的浓度)]。
另外，被选择的底物和没有被选择的底物的上述关系以及下面叙述的关系可各自独立应用于各个底物。例如，被选择的底物是2种时，每一种都可以应用对于没有被选择的2种底物中的每一个底物的浓度关系。
另外，“底物”表示“dATP”、“dTTP”、“dCTP”以及“dGTP”脱氧核苷酸的种类。
在PCR中，酶高效作用的的脱氧核苷酸的浓度为200μM左右(Takara公司生产Ex Taq等)。从酶的底物特异性观点看，原来带标记脱氧核苷酸难以掺入。因此有关选作标记的底物，将其整体的制备浓度调低到例如100μM左右，最好将带标记脱氧核苷酸调整到例如其中的50μM，结果在得到的含有靶核酸序列的PCR产物中可以掺入更多的标记物质。通过将选作标记的底物之中的没有被标记的脱氧核苷酸的量减少，具有反应少许停止，使得难以大量掺入的带标记脱氧核苷酸变得容易掺入的效果。另外，即使将脱氧核苷酸的量增减30％左右，本发明的产物制备方法也是有效的。
因此，将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有被标记的底物的合计浓度)调整到没有被选作进行标记的各个底物的浓度的5％至80％(摩尔基准数)之间比较好。而将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有被标记的底物的合计浓度)调整到没有被选作进行标记的各个底物的浓度的10％至40％(摩尔基准数)之间更好。另外，最好是将没有被选作进行标记的各个底物的浓度调整到150μM～300μM。另外，最好是将选作进行标记的各个底物的浓度(被标记的底物和没有标记的底物的合计浓度)调整到20μM以上。另外，将选作进行标记的底物的总量中的“带标记脱氧核苷酸”对“没有标记的脱氧核苷酸”的比例(摩尔基准数)调整到0.25以上，最好是调整到1以上。而其上限为50左右好。
作为具有靶核酸的碱基序列被扩增的PCR产物的碱基长度虽然没有特别限制，但在100至2000bp之间特别有效。
标记物质可以使用荧光物质等。其中，以Cy3、Cy5为代表的CyDye(Amersham Bioscience公司生产)常用作核酸标记用的荧光物质，这些荧光物质在本发明中特别有效。另外，生物素、氨基烯丙基系化合物等对于本发明的核酸标记用物质也都有效。生物素与Cy3相比由于分子的大小小，进行PCR时的立体障碍比较少，所以利用本发明的方法可以使标记物质更有效地掺入到PCR产物中。作为被标记的脱氧核苷酸一般常用胸苷酸，相应的标记试剂也有很多市售商品，本发明对于这些试剂也能较好地适用。
利用本发明的核酸标记方法标记的靶核酸可以通过与固定在固相上或固相表面的探针杂交形成双链，通过测定与该探针结合的靶核酸带有的标记物质的信号可以进行高灵敏度检测。作为利用固相杂交的高灵敏度的检测装置，已知有各种各样的物质、形态，但本发明可没能限制地适用于这些装置。其中，在玻璃基板上固定了核酸的DNA微阵列是其代表例子，对通过本发明的方法做成的靶核酸的检测特别适合。作为用于固相的材料除了玻璃以外，还有树脂、金属、金属薄膜、纤维等。另外其轮廓上形态还有微粒子、光纤维顶端、多孔材料、纤维等。
作为探针与固相的结合样式，存在着吸附、化学结合等各种各样的方式，无论哪一种结合样式都适用于本发明的靶核酸的检测方法。例如，如果离子结合，对于包被氨基的玻璃基板或树脂表面，可以只要提供通常的核酸，就可使其进行离子结合。另外，也可以使用5’末端、3’末端修饰了氨基、巯基等官能团的修饰寡核苷酸进行固定。例如利用氨基时，使固相表面预先结合可有效与氨基反应的琥珀酰亚胺，通过将5’末端或3’末端修饰了氨基的寡核苷酸供给给固相表面，可以容易形成共价键，适于用作检测本发明靶核酸的探针。另外，当使用巯基时，通过将例如马来酰亚胺预先结合于固相，与氨基情形一样，容易形成共价键，适于用作检测本发明靶核酸的探针。作为向固相的供给方法，有通过喷墨法将DNA溶液向固相印字的方法等。通过该喷墨法制作的DNA微阵列探针的点小是其特长。在检测中，S/N比也是重要的因子，利用本发明标记方法扩增的靶核酸由于每个靶的标记量多，所以也有S/N比提高的效果，特别有效。
另外，本发明的标记方法不仅在对1种靶核酸进行扩增的单一PCR，而且在Multiplex PCR、或使引物的浓度有差别，使任一单链积极扩增的非对称PCR中也都有效。
另外，通过本发明的核酸标记方法中使用的含有脱氧核苷酸的溶液组合物也可以作为诊断试剂盒、PCR预混合物提供。溶液组合物在例如可用作PCR用的适当的水为主体的水性溶剂中，除了上述脱氧核苷酸的组合之外，还可含有酶起作用所必需的成分以及用于获得引物进行退火所必需的盐浓度的各种添加剂等，具体来说可以含有Tris-Cl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2等。
因此，本发明的标记方法可以边标记边扩增检体(样品)中含有的检测对象的靶核酸序列，适合用于向固相杂交法等的对核酸样品进行标记后与探针进行杂交的分析方法供给的检体(样品)的制备方法。
另外，本发明为了对靶核酸进行检测，提供具有如下构成的试剂盒 A)用于扩增靶核酸的PCR引物， B)作为含有ATCG 4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，与没有被选择的剩下的脱氧核苷酸相比，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度减少，相对于上述被选择的脱氧核苷酸，含有带标记的脱氧核苷酸， C)在固相上配置了用于与上述靶核酸反应的探针的固相探针。固相探针最好是DNA微阵列。通过本构成可以提供可进行靶核酸的高灵敏度检测的检测试剂盒。
实施例
以下通过实施例，对本发明进行更具体说明。但是以下所述实施例虽然是本发明的最好实施方式的一个例子，但本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
<实施例1> I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR (1)引物的设计 从市售的Takara公司生产的载体pUC118 EcoRI/BAP(全长3162bp)的碱基序列中设计两种具有下述序列的引物。而有关pUC118 EcoRI/BAP的全碱基序列信息由Takara公司提供，另外可以从公开的数据库等获得。当进行引物设计时，要充分考虑到序列、GC％、融解温度(Tm)后进行设计，以使pUC118 EcoRI/BAP中所希望的部分碱基序列通过PCR特异、而且有效地被扩增。
设计的引物，正向一侧(F)、反向一侧(R)各一种，共计2种。以pUC118 EcoRI/BAP作为模板，以F和R的组合进行PCR扩增，扩增出1324bp的PCR扩增产物。表1给出了涉及到的引物的碱基序列以及Tm值。
表1 名称 碱基序列Tm(℃)F 5’TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAG 3’60.9R 5’ATCAGCAATAAACCAGCCAGCC 3’61.5 图1给出了在pUC118 EcoRI/BAP全长中2种引物(F和R)和探针(P)的位置。该图中箭头指示方向表示各个引物链5’末端至3’末端的方向。
(2)引物合成 合成实施例1(1)中设计的2种引物。各个引物的合成根据常规方法用DNA合成仪合成具有各自碱基序列的DNA链。纯化通过萃取柱进行，得到2种引物。得到的引物用TE缓冲液稀释到10μM。
(3)PCR扩增反应 使用实施例1(2)中合成的2种引物、作为模板基因的Takara公司生产的载体pUC118 EcoRI/BAP，以及Takara Bio公司生产的PCR试剂盒Takara Ex Taq，进行PCR扩增反应。在该PCR试剂盒中含有包括dATP、dCTP、dTTP、dGTP 4种脱氧核苷酸在内的dNTP混合物(各2.5mM)，为了调整各个核苷酸的浓度，使用Amersham Bioscience公司生产的Sequencing Grade Solution dNTPs。而为了通过荧光标记对PCR产物进行标记，加Amersham Bioscience公司生产的Cy3dUTP，通过Cy3对PCR产物进行标记。另外，没有被标记的脱氧核苷酸，做成下面表2所示那样的浓度的dNTP混合物。为了比较也一起实施以往的制备方法(STd.)。
表2dNTP混合物组成 Std.Mix1Mix2Mix3Mix4Mix5Mix6dATP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdCTP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdGTP5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mM5.0mMdTTP5.0mM4.0mM2.0mM1.0mM0.5mM0.25mM0mM 正向引物和反向引物使用(1)中记载的组合进行PCR扩增。PCR反应的条件按照下面的程序，就表2所示的Low dT dNTP Mixture Mix0至Mix6各混合物进行下述表3所示组成的反应液的制备。
表3反应液组成 成分组成Takara Ex Taq0.5μl(2.5U)10×Ex Taq缓冲液(加20mM Mg2+)5.0μl模板DNA(Takara公司pUC118稀释物)1.0μl(10ng)正向引物(F)2.5μl(25pmol/tube)反向引物(R)2.5μl(25pmol/tube)dNTP混合物(Std.，Mix1～Mix6)2.0μl(※)Cy3dUTP(1.0mM、Amersham Bioscience公司生产)2.0μl(40μM)H2O34.5μl合计50μl (※)浓度由于Mix1～Mix6以及Std.都不相同，在表4中另外给出。
下面表4给出了表3那样制备的反应溶液中的脱氧核苷酸的浓度。而dATP、dCTP、dGTP使用各个表中记载的浓度(在表4中200μM)(在以下表中也同样)。
表4反应液中的脱氧核苷酸的浓度 Std. A(Mix1) B(Mix2) C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6) Datp、dCTP、dGTP、 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM 200μM dTTP、 200μM 160μM 80μM 40μM 20μM 10μM 0μM Cy3-dUTP 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM 40μM dTTP+Cy3-dUTP 240μM 200μM 120μM 80μM 60μM 50μM 40μM 对于制备的反应液可以使用市售的热循环仪，按照下面表5的温度循环程序进行PCR扩增反应。
表5PCR扩增反应的温度条件 步骤 温度保持时间重复次数1 94℃(变性)30秒25个循环2 55℃(退火)45秒3 72℃(延伸)1分钟4 72℃10分钟 扩增反应结束后，PCR扩增产物使用纯化用柱(QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒)进行纯化。纯化后，PCR扩增产物溶液的溶液量调整到50μl。取一部分得到的纯化好的PCR扩增产物溶液，按照常规方法进行电泳，确认在7种各个PCR产物中出现了具有所希望的碱基长度的带。表6给出了PCR扩增产物的浓度。
表6PCR扩增产物的浓度 Std. A(Mix1) B(Mix2)C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6)产物量51.0nM 47.9nM 30.1μM14.2nM 9.6nM 3.0nM 0nM 就象表6所示的那样，作为PCR扩增产物的量，反应液中的dTTP的量越多，产物量也越多。
II.DNA微阵列的制作 (1)探针的设计和合成 对上述PCR产物A设计探针。设计与引物的设计一样，要充分考虑到序列、GC％、融解温度(Tm值)，以便能够特异识别设计的部分碱基序列。
表7给出了设计的探针的碱基序列和Tm值。 表7 名称 碱基序列Tm(℃)P 5’GATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGC 3’75.7 在该探针设计中，由R引物延伸的DNA链与探针进行杂交，与探针形成杂化体。
(2)玻璃基板的清洗 将合成石英玻璃基板(大小(W×L×T)25mm×75mm×1mm，饭山特殊玻璃公司生产)放到耐热、耐碱性的架上，浸入到调整到所定浓度的超声清洗用清洗液中。于清洗液中浸泡过夜后，用超声清洗20分钟。然后取出玻璃基板，用纯水轻轻涮洗后，于纯水中超声清洗20分钟。然后将玻璃基板于加热到80℃的1N氢氧化钠水溶液中浸泡10分钟。再进行纯水清洗和超纯水清洗，制备DNA芯片用的清洗后石英玻璃基板。
(3)表面处理 使硅烷偶联剂KBM-603(信越硅公司生产)溶解于纯水中，使终浓度为1％，于室温下搅拌2小时。然后将清洗后的石英玻璃基板浸入到该硅烷偶联剂水溶液中，于室温下放置20分钟。将玻璃基板提出后，用纯水轻轻清洗表面后，用氮气吹玻璃基板的两面，使其干燥。然后将氮气流干燥的玻璃基板放到加热到120℃的烘箱中烘烤1小时，使偶联剂处理完结。通过该偶联剂处理，在玻璃基板表面导入了来自硅烷偶联剂的氨基。
另一方面，制备在二甲基亚砜和乙醇的1∶1混合溶剂中溶解了同仁化学研究所公司生产的N-马来酰亚胺己酰氧琥珀酰亚胺(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(终浓度为0.3mg/ml)的EMCS溶液。烘烤结束后，将偶联剂处理后的玻璃基板放冷，在制备的EMCS溶液中于室温下浸泡2小时。在浸渍处理期间，导入到偶联剂处理后的玻璃基板表面的氨基与EMCS的琥珀酰亚胺基反应，在玻璃基板表面导入来自EMCS的马来酰亚胺基。将从EMCS溶液中提出的玻璃基板用上述的二甲基亚砜和乙醇的混合溶剂洗净，再用乙醇洗净后，于氮气氛围下使其干燥。
(4)探针用DNA的合成 合成上述(1)中设计的探针。
为了使探针DNA与在上述表面导入马来酰亚胺的玻璃基板共价结合，按照常规方法在5’末端实施巯基化处理。然后为了避免DNA合成时的副反应，对实施了保护的保护基进行脱保护，再进行HPLC纯化和脱盐处理。
得到的探针DNA溶解于纯水中，进行分注(墨水溶解时)，终浓度为10μM后，进行冷冻干燥，除去水分。
(5)通过BJ打印机吐出探针DNA、以及与基板表面的结合 制备含有甘油7.5质量％、硫二甘醇7.5质量％、尿素7.5质量％、アセチレノ-ルEH(川研Fine Chemical公司生产)1.0质量％的水溶液。然后，将分注的探针DNA按照规定浓度(10μM)溶解在上述混合溶剂中。将得到的探针DNA溶液充填到泡沫喷墨打印机(商品名BJF-850佳能公司生产)用墨盒中，装到印字头上。
而上述泡沫喷墨打印机是实施改造使得可以进行平板喷墨印刷的打印机。另外，该改造的泡沫喷墨打印机通过按照所定的膜做成方法输入印字图样，可以在约120μm芯片点印约5pl DNA溶液的液滴。
然后，使用该改造的阀喷墨打印机，对玻璃基板进行探针DNA溶液的点印操作。每枚DNA微阵列，预先做成进行16点的探针吐出的印字图样，进行喷墨印字。通过放大镜等确认DNA溶液的点确实点在目的图样中后，于常温下在加湿盒内静置30分钟，使玻璃基板表面的马来酰亚胺基与探针DNA 5’末端的巯基(-SH)反应。
(6)清洗 于加湿盒内反应30分钟后，用含有100mM的NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)将残存在玻璃基板表面的未反应的探针DNA洗掉。得到在玻璃基板表面，每一DNA芯片16个点处分别固定了所定的单链探针DNA的DNA微阵列型DNA芯片。
III.杂交反应 使用实施II项中制作的DNA微阵列和作为样品核酸产物在I制作的7种PCR扩增产物在微阵列上进行杂交。
(1)DNA微阵列的封闭 将BSA(牛血清白蛋白Fraction VSigma公司生产)溶解于100mMNaCl/10mM磷酸缓冲液，使终浓度为0.1质量％，在该溶液中将II中制作的DNA微阵列于室温下浸泡2小时，进行玻璃基板面的封闭。封闭结束后，用含有0.1质量％SDS(十二烷基硫酸钠)的0.1×SSC溶液(NaCl15mM、柠檬酸钠(水合柠檬酸三钠盐，C6H5Na3·2H2O)1.5mM、p.H.7.0)清洗后，用纯水淋洗。然后用旋转干燥装置除去DNA微阵列的水分。
(2)杂交溶液的制备 制备对于各个PCR产物的杂交溶液。而各个PCR扩增产物溶液分别使用2.0μl，使最终液量为120μl。
<杂交溶液> 6×SSPE/10％ Form amide/PCR扩增产物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) (3)杂交 将除去水分后的DNA芯片放到杂交装置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中，使用上述的杂交溶液，按照下面表8给出的步骤和条件进行杂交反应。
表8杂交条件和步骤 操作操作步骤和条件反应65℃3分钟→92℃2分钟→55℃4小时清洗2×SSC/0.1％SDS 25℃下2×SSC 20℃下(淋洗)H2O(手动淋洗)干燥旋转干燥 (4)荧光测定 杂交反应结束后，对旋转干燥的DNA芯片使用DNA微阵列用荧光检测装置(Axon公司生产、Genepix 4000B)对来自杂交体的荧光进行测定。下面表9给出了对来自PCR扩增产物Std.、以及A至F的荧光辉度进行测定的结果。在计算辉度时，将在DNA芯片上没有探针DNA的点的部分观测到的荧光强度作为背景值，将从来自各个点的表观荧光强度减去背景值后的值作为荧光强度的实测值。另外，测定进行2次，给出其平均值。
表9PCR扩增后的浓度和杂交后的荧光辉度 Std. A(Mix1) B(Mix2)C(Mix3) D(Mix4) E(Mix5) F(Mix6)产物量51.0nM 47.9nM 30.1μm14.2nM 9.6nM 3.0nM 0nM(※)荧光辉度3243 5052 1056529659 29948 16956 176 (※)检测灵敏度以下 由表9给出的结果与以往方法Std.相比，其他的A～E的样品PCR扩增产物量虽然少，但通过杂交检测的荧光辉度值都高。就是说，标记掺入效率高。即，反应液中加的标记物质的量即使少，对于带标记碱基，通过将脱氧核苷酸的总浓度调整到比其他碱基的浓度低，也可以有效地使标记物质掺入。而，没有标记的脱氧核苷酸为0时，几乎不能进行PCR扩增，即使杂交也不能检测(样品F)。以上结果表明，相对于没添加带标记脱氧核苷酸的碱基的脱氧核苷酸(这里指dATP、dCTP、dGTP)的浓度，通过将作为标记对象的碱基种的无标记脱氧核苷酸(这里指dTTP)的浓度调整到5至80摩尔％，可以有效地进行核酸标记。
另外，表9的C、D样品的辉度值与以往方法Std.相比高出约10倍多。即，本发明的核酸标记方法相对于没添加带标记脱氧核苷酸的碱基的脱氧核苷酸(这里指dATP、dCTP、dGTP)的浓度，通过将作为标记对象的碱基种的无标记脱氧核苷酸(这里指dTTP)的浓度调整到10至40摩尔％，可以有效地进行核酸标记。另外，在本实施例中只对1种碱基使标记物质掺入，即使对多个碱基使标记物质掺入也可获得同样的效果。
<实施例2> 在实施例1的表6那样的PCR产物中，在将各个PCR产物相互都调整到等摩尔的基础上，使用PCR扩增产物溶液2μl制备使终浓度为下面构成那样的杂交溶液120μl。
<杂交溶液> 6×SSPE/10％Form amide/PCR扩增产物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照表8给出的杂交条件和步骤进行杂交反应。另外，象实施例1的III(4)荧光测定中所述那样，对各个DNA芯片进行荧光测定。表10给出了其平均值。
表10杂交的PCR扩增产物的荧光辉度A(Mix1)B(Mix2)C(Mix3)D(Mix4)荧光辉度5052143516053063600 由该结果可以准确确认对于单链靶，C、D的样品与A相比掺入了更多的标记物质。另外，带标记脱氧核苷酸对无标记脱氧核苷酸的比例为1以上时效果更好。
<实施例3> 按照实施例1的表3将反应液调整到表11所示那样的脱氧核苷酸的浓度，在表5那样温度条件下进行PCR扩增反应。
表11反应液中的脱氧核苷酸的浓度G(Mix7)H(Mix8)C(Mix3)dATP、dCTP、dGTP、 200μM200μM200μMdTTP、 100μM60μM40μMCy3-dUTP 100μM60μM40μMdTTP+Cy3-dUTP 200μM120μM80μM 表12给出了PCR扩增产物的浓度。
表12PCR扩增产物的浓度 G(Mix7)H(Mix8)C(Mix3)产物量35.0nM26.4nM14.2nM 反应液中的dTTP的量越多，作为PCR扩增产物的量就越多。
在与实施例1同样的条件下，在表12的PCR产物中，制备终浓度为下面构成那样的杂交溶液。各个PCR扩增产物溶液使用2.0μl，使最终液量为120μl。
<杂交溶液> 6×SSPE/10％Form amide/PCR扩增产物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照下面表8给出的杂交条件和步骤进行杂交反应。另外，象实施例1的(4)荧光测定中所述那样进行处理，对各个DNA芯片进行荧光测定。表13给出了其平均值。
表13PCR扩增产物的浓度和荧光辉度 G(Mix7) H(Mix8) C(Mix3)荧光辉度24447 35457 29659 由该结果可知，可以得到H为最高的辉度值。即使带标记脱氧核苷酸与无标记脱氧核苷酸比例为1时，无标记脱氧核苷酸的浓度比其他碱基少的H、C方与G的条件相比检测灵敏度好，可知用少的标记物质可以更有效地掺入标记。
<实施例4> 按照实施例的表3制备表14所示那样的脱氧核苷酸浓度的反应液，在表5那样的温度条件下进行PCR扩增反应。即，对不使用带标记脱氧核苷酸的碱基A、C、G，通过改变浓度条件进行核酸标记。
表14反应液中的脱氧核苷酸浓度I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3)K(Mix11)L(Mix12)dATP、dCTP、dGTP、 100μM150μM200μM250μM300μMdTTP、 40μM40μM40μM40μM40μMCy3-dUTP 40μM40μM40μM40μM40μMdTTP+Cy3-dUTP 80μM80μM80μM80μM80μM 表15给出了PCR扩增产物的浓度。
表15PCR扩增产物的浓度 I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3)K(Mix11)L(Mix12)产物量10.7nM13.5nM14.2nM14.8nM14.3nM 作为PCR扩增产物的量，虽然I(Mix9)略少一些，但无论哪一个样品几乎都一样。
在与在实施例1同样的条件下，在表14的PCR产物中，制备终浓度为下面构成那样的杂交溶液。各个PCR扩增产物溶液使用2.0μl，使最终液量为120μl。
<杂交溶液> 6×SSPE/10％ Form amide/PCR扩增产物溶液 (6×SSPENaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H.7.4) 然后按照表8给出的杂交条件和步骤进行杂交反应。另外，象实施例1的(4)荧光测定中所述那样进行处理，对各个DNA芯片进行荧光测定。表16给出了其平均值。
表16PCR扩增产物的荧光辉度 I(Mix9)J(Mix10)C(Mix3) K(Mix11) L(Mix12)产物量80732236929659 26758 26239 由该结果在除I以外的样品(J、C、K、L)中得到几乎都相同的辉度值。即，标记效率与不使用带标记脱氧核苷酸的碱基A、C、G的浓度，可知调整到150μM至300μM之间比较妥当。
序列表
<110>佳能株式会社
<120>核酸标记方法以及核酸标记用液组合物
<130>10003827CN01
<150>JP2003-430805
<151>2003-12-25
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>1
tgatttgggt gatggttcac gtag 24
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>2
atcagcaata aaccagccag cc22
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>探针
<400>3
gataaagttg caggaccact tctgc 2权利要求
1、核酸标记方法，是在边掺入标记底物边经PCR法进行靶核酸扩增的核酸标记方法中，其特征是选择ATCG4种底物中的1种至3种底物，与没有被选择的剩下的底物相比，使上述被选择的底物的浓度减少，而且作为上述被选择的底物含有无标记脱氧核苷酸和带标记脱氧核苷酸。
2、权利要求1所述的核酸标记方法，其中将上述被选择的底物的浓度调整到上述没有被选择的底物的浓度的5％至80％之间。
3、权利要求1所述的核酸标记方法，其中将上述被选择的底物的浓度调整到没有被选择的底物的浓度的10％至40％之间。
4、权利要求2或3中任一项中所述的核酸标记方法，其中将上述没有被选择的底物的浓度调整到150μM～300μM范围。
5、权利要求2或3所述的核酸标记方法，其中将作为上述被选择的底物的带标记脱氧核苷酸的浓度调整到20μM以上。
6、权利要求5所述的核酸标记方法，其中将作为上述被选择的底物的带标记脱氧核苷酸对无标记脱氧核苷酸的比例调整到0.25以上。
7、权利要求5所述的核酸标记方法，其中将作为上述被选择的底物的带标记脱氧核苷酸对无标记脱氧核苷酸的比例调整到1以上。
8、权利要求1所述的核酸标记方法，其特征是标记物质是荧光物质。
9、权利要求8所述的核酸标记方法，其中荧光物质是Cy3或Cy5。
10、权利要求1所述的核酸标记方法，其中，标记物质是生物素。
11、权利要求1所述的核酸标记方法，其中，标记物质是氨基烯丙基系化合物。
12、权利要求1所述的核酸标记方法，其中上述被选择的底物是1种。
13、权利要求12所述的核酸标记方法，其中上述被选择的1种底物是T。
14、靶核酸的检测方法，是使含有靶核酸的产物与固定于固相上的探针反应，利用标记对与固相上的探针杂交的上述靶核酸进行检测的靶核酸的检测方法，其特征是对于上述产物，通过权利要求1～13任一项所述的核酸标记方法将上述产物中含有的靶核酸做成实施了标记的PCR产物之后，与上述固相上的探针反应。
15、权利要求14所述的检测方法，其中上述探针被配置在作为DNA微阵列的固相上。
16、权利要求15所述的检测方法，其特征是上述DNA微阵列中含有的上述探针的点的面积在10-6m2以下。
17、权利要求14所述的检测方法，其中来自于通过PCR法对靶核酸进行扩增的上述检体的PCR产物的碱基长度在100～2000bp范围。
18、溶液组合物，是作为含有边掺入标记物质，边通过PCR进行靶核酸的扩增时的ATCG4种脱氧核苷酸的溶液组合物，其特征是
选择1种至3种脱氧核苷酸，与没有被选择的剩下的脱氧核苷酸相比，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度减少，而且在上述被选择的脱氧核苷酸中含有带标记脱氧核苷酸。
19、用于检测靶核酸的试剂盒，含有如下引物和探针
A)用于扩增靶核酸的PCR引物，
B)作为含有ATCG4种脱氧核苷酸的溶液组合物，选择1种至3种脱氧核苷酸，与没有被选择的剩下的脱氧核苷酸相比，使上述被选择的脱氧核苷酸的浓度减少，而且在上述被选择的脱氧核苷酸中含有带标记脱氧核苷酸，
C)在固相上配置了用于与上述靶核酸反应的探针的固相探针。
20、权利要求19所述的试剂盒，其中上述固相探针是DNA微阵列。
全文摘要
本发明提供尽可能控制标记物质使用量的而且可以有效地将标记物质掺入到产物(作为检测对象的靶核酸)中的核酸标记方法。本发明的方法是通过对产物中含有的靶核酸序列通过PCR法边扩增、边标记时，至少使用从ATCG 4种底物中至少选择1种作为进行标记的底物，使被选择的底物的浓度比没有被选择的剩下的各个底物的浓度都低，而且是被选择的底物中被标记的底物。
文档编号C12N15/09GK1661111SQ200410104890
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月24日 优先权日2003年12月25日
发明者石井美绘, 铃木智博 申请人:佳能株式会社