新型的分泌蛋白质及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：新型的分泌蛋白质及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及因抑制血管发生的活性和/或破骨细胞形成抑制活性而具有骨吸收的抑制活性的可溶性新型蛋白质及其制备方法，应用该蛋白质的新型的诊断药和治疗药。
背景技术：
所谓“血管发生”是指在体内可重新形成血管。对于血管发生存在着促进物质和抑制物质，这种平衡调节着血管发生。一般说来成人血管系统全长为10km，血管内皮细胞的表面积为7000m2，重量为1kg，一般认为其是分布于体内的所有部位的人体最大的器官。在胎儿期和成长过程中，血管发生活跃，但是对于成体而言，认为只有在排卵和创伤治疗之类特殊情况下才发生血管发生。血管系统对于维持生命而言是不可缺少的，上述血管发生是正常的生物体的反应。
另一方面，上述情况之外的异常的血管发生也成为各种疾病的原因。其代表的例子有癌症血管发生。癌症组织中血管发生造成肿瘤的显著增大，转移能力增强。因此，如果抑制给癌细胞供给营养成分的血管的新生，就可以使癌症保持在休眠状态。提出肿瘤休眠的Folkman等人鉴定出癌细胞产生的血管发生的抑制因子，命名为血管生成抑制素和内皮抑制素(非专利文献1，非专利文献2)。在清楚了这些血管发生抑制因子在小鼠中几乎完全使癌症退化之后，血管发生的研究得以积极的进行。现在，许多的制药企业致力于血管发生抑制剂的开发，以癌症作为对象实施临床试验，但是没有实现攻克癌症，寄希望于新型的血管发生抑制剂。
癌症以外的疾病，例如糖尿病性视网膜病，类风湿性关节炎等中也发生异常的血管发生，现在报道了许多数据，这些数据提示通过抑制这些血管发生有可能可以治疗这些疾病。因此，认为血管发生抑制剂成为针对癌症和伴随血管发生的其它疾病的治疗药物。
血管系统分布于体内的所有部位，但是也存在缺乏血管丛的组织。作为缺乏血管丛的组织，可以举例有软骨，腱，韧带，眼球等。间充质组织中，骨和肌肉等富含血管，因此产生骨折和肌肉损伤也有再生的能力。
与其相对，间充质组织的软骨，腱，韧带是缺乏血管丛的组织，发生损伤或断裂时，再生、自然治愈非常困难。另一方面，一旦血管侵入这些无血管组织中，会引起组织的破坏，因此认为这些组织中存在内源性的血管发生抑制因子，抑制血管从周围侵入。
软骨调节因子(Chondromodulin)-I(ChM-I)作为软骨中存在的血管发生抑制因子，是由牛胎儿软骨纯化而来，是大小约为25kDa的糖蛋白质，现在认为其控制血管向软骨的侵入(非专利文献3)。
此外，发现了与ChM-I具有同源性的II型跨膜蛋白质ChM1L(非专利文献4，专利文献1)。ChM1L是在腱、韧带等强韧结合组织中特异表达的基因，现在认为其控制血管向这些组织侵入(专利文献2，非专利文献5，非专利文献6)。
如上所述，腱和韧带也与软骨同为缺乏血管丛的组织。腱和韧带是连结骨和肌肉重要的组织，它们的损伤或断裂也会限制运动选手以及一般人的身体运动，因此被认为是严重的疾病。这种腱和韧带组织是重要的组织，但是与软骨相比，迄今为止基础和临床研究还没有很大的进展。其原因可例举有细胞等材料的安全性，没有腱或韧带特异表达的标记分子。由于这种背景，因此希望存在能够评价腱或韧带的损伤或修复程度的标记分子。
由于发现ChM1L在腱和韧带中特异表达，因此认为可以利用其作为评价这些组织的损伤或修复的标记分子。此外，通过控制ChM1L的活性，也有治疗腱或韧带损伤的可能性。
但是，为了将ChM-I及其分泌型蛋白质和ChM1L等蛋白质用于抑制血管发生，尚未解决的问题还很多。
在将重组蛋白质开发为药物制剂时，需要制备大量活性蛋白质。一般来说，工业规模的蛋白质生产中可广泛应用采用微生物尤其是大肠杆菌的表达系统。在大肠杆菌中表达的有利之处在于，通过使用可高水平表达的载体和高密度培养，可以获得高水平的重组蛋白质。
但是，作为这种情况中存在重要问题是往往大肠杆菌容易形成含有重组蛋白质的包涵体。实际上，由于作为血管发生抑制剂实施临床试验的内皮他丁在大肠杆菌中表达时也形成包涵体，使其回收困难(非专利文献2)，因此现在还在研究改良方法(非专利文献3)。
人们对因其抑制血管发生的活性被开发为抗癌药物的ChM-I也进行了研究，但是据报道，在大肠杆菌表达ChM-I时形成包涵体，使其回收困难(非专利文献7)。此外，即使采用作为宿主细胞的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，ChM-I形成聚集也需要回收的过程，因此获得大量活性蛋白质有困难(非专利文献8)。
据报道，对于ChM1L而言，和ChM-I一样，在大肠杆菌中表达ChM1L时也形成包涵体，使回收困难(非专利文献9)。此外，通过在COS7细胞的培养液中表达ChM1L，可以从培养液中获得活性蛋白质，但是其表达量低，与ChM-I一样形成聚集，无法获得大量的活性蛋白质(专利文献4)。
此外，跨膜蛋白质的细胞外区域被切断从而使其被分泌到细胞外。例如，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)被作为II型跨膜蛋白质合成，起跨膜蛋白质的功能，但是现在可知其被TNF-α转化酶等蛋白酶所切断，也起分泌性蛋白质的功能。对于ChM-I，也具有II型膜蛋白质结构，但是可知通过弗林蛋白酶等蛋白酶识别的位点(RERR)被加工，C末端的120个氨基酸可分泌到细胞外(非专利文献3和非专利文献8)。
但是，上述120个氨基酸残基构成的分泌型ChM-I，即使是将其重组生产的也没显示出足够的可溶性，没有解决前述问题。
此外，对于ChM1L，虽然与ChM-I具有氨基酸序列同源性，但是没有ChM-I这样的典型的蛋白酶识别位点，推定其作为跨膜蛋白质的功能，没有分泌型蛋白质的报道(专利文献4WO00/12708、专利文献5WO00/29579、专利文献6WO01/23557、专利文献7WO01/48203、专利文献8WO01/53344、非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。
专利文献1WO01/23557专利文献2WO01/53344专利文献3特表2002-504494号公报专利文献4WO00/12708专利文献5WO00/29579专利文献6WO01/23557专利文献7WO01/48203
专利文献8WO01/53344非专利文献1O’Reilly等人Cell(USA)1994年10月21日出版第79卷第2期p315-328非专利文献2O’Reilly等人Cell(USA)1997年1月24日出版第88卷第2期p277-285非专利文献3开等The Journal of Biological Chemistry(USA)1997年12月19日出版第272卷第51期p32419-32426非专利文献4山名等Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(USA)2001年2月2日出版第280卷第4期p1101-1106非专利文献5Brandau等Developmental dynamicsan officialpublication of the American association of anatomists(USA)2001年5月出版第221卷第1期p72-80非专利文献6宿南等Biochemical and biophysical researchcommunications(USA)2001年2月2日出版第280卷第5期p1323-1327非专利文献7山川等日本分子生物学会第25次年会讲演摘要集2001年11月出版2P-0206非专利文献8Azizan等The Journal of biological chemistry(USA)2001年6月29日出版第276卷第26期p32419-32426非专利文献9长谷川等日本分子生物学会第25次年会讲演摘要集2001年11月出版2P-0770发明的公开发明要解决的问题这样，由于野生型ChM-I和ChM1L在医药等方面的利用的不利之处在于其大量制备方面，因此需要开发不同的物质或者至少需要开发简便地制备野生型ChM-I或ChM1L的方法。
用于解决问题的方法本发明人对天然的跨膜型ChM1L加以各种研究，其结果发现了一种新的具有抑制血管发生的活性的可溶性多肽(S-ChM1L)，其应称为迄今为止从未报道过的ChM1L分泌型蛋白质，进而鉴定出了S-ChM1L和其修饰型多肽(MS-ChM1L)有抑制血管发生的活性和抑制由破骨细胞所致的骨吸收的活性。
换句话说，本发明涉及1)包含序列号9所示的氨基酸序列的、或者与序列号9所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列的，并且具有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性的多肽。此外，还涉及2)根据1)的多肽，其N末端和/或C末端还添加有氨基酸残基、3)根据2)的多肽，其N末端添加的氨基酸残基为由甲硫氨酸起始的氨基酸序列构成、4)根据2)或3)中所示的多肽，其N末端和/或C末端添加的氨基酸残基为连续的6-8个组氨酸标记序列和/或含FLAG标记序列的氨基酸序列构成、5)根据2)或3)中所示的多肽，该N末端和/或C末端添加的氨基酸残基为水母(Aequorea victoria)获得的荧光蛋白质或其类似物，或者是分泌型碱性磷酸酶或其类似物的氨基酸序列构成。还涉及6)根据1)的多肽，其N末端和/或C末端添加的氨基酸残基含有经修饰的氨基酸残基、7)根据6)的多肽，其N末端添加的氨基酸残基为谷氨酰胺或焦谷氨酰胺残基、8)根据6)的多肽，其特征在于所述经修饰氨基酸残基具有选自于乙酰基、甲酰基、生物素基、Boc基或Fmoc基中至少一种的修饰基团。
此外，本发明还涉及9)具有编码序列号9所示的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子、10)具有序列号3的第4-243位的核苷酸序列的核酸分子，或者在严格条件下与序列号3的第4-243位的核苷酸序列的互补序列杂交、且具有编码有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子、11)具有编码2)-6)任一项所示的多肽的核苷酸序列的核酸分子、12)含有9)-11)任一项所示的核酸分子的载体、13)由12)的载体转化的宿主细胞。
进而，上述多肽可以采用适当的重组宿主细胞制备成可溶性多肽，还发现通过在制备时共存变性剂和特定的表面活性剂，可将这种可溶性蛋白质从宿主细胞中的内毒素等杂质中简便地纯化出来，从而完成本发明。
换言之，本发明还涉及14)根据前述1)-8)任一项所示的多肽的制备方法，其特征在于其有培养前述13)的转化宿主细胞的步骤和回收生成的多肽的步骤、15)根据14)的多肽的制备方法，其特征在于在蛋白质变性剂存在下从转化宿主细胞中回收含有多肽的提取液、16)根据14)或15)任一项所示的肽的制备方法，其包括用TritonX-114处理从宿主细胞中回收的提取液后，进行离心分离处理以除去热源的步骤、17)前述14)-16)任一项所示的多肽的制备方法，其特征在于在从宿主细胞回收含有多肽的提取液后的所有步骤中，将含有该多肽的溶液的pH调整至8.0-8.5的范围内、18)制备重组人ChM-I或重组人ChM1L的方法，其是采用可以表达人ChM-I或人ChM1L的重组宿主细胞制备重组人ChM-I或重组人ChM1L的方法，该方法包括在蛋白质变性剂存在下从重组的宿主细胞中回收含有重组人ChM-I或重组人ChM1L的提取液的过程，以及用TritonX-114对该提取液处理后进行离心分离以除去热源的步骤、19)根据前述18)的制备方法，其特征在于在回收提取液的步骤之后的所有步骤中，将含有该多肽的溶液的pH调整至8.0-8.5的范围内。
此外，本发明提供含有前述1)至8)任一项所示的多肽的药物组合物，尤其是21)权利要求20中所示的药物组合物，其是血管发生抑制剂和/或破骨细胞活化抑制剂，以及用于诊断与腱炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病、青光眼、牛皮癣、瘢痕疙瘩、动脉硬化症等与血管发生或骨吸收相关病症的诊断用组合物。
进而，还提供了含有前述9)-11)任一项所示的核酸分子的经基因操作的转基因非人动物。
发明的效果本发明的可溶性蛋白质如下文所述，具有抑制血管发生的活性和抑制由破骨细胞的活化所产生的骨吸收的活性，有望在作为药物使用时，通过抑制血管发生和破骨细胞的活化，获得尤其是针对类风湿性关节炎和骨转移性肿瘤的明显的治疗效果。
进而，由于本发明的可溶性蛋白质是由天然存在的ChM1L的部分序列构成的蛋白质因此抗原性低，在采用重组细胞生产中不需要再折叠的过程，因此可以大量制备。
进而，本发明的可溶性蛋白质的制备方法中可以简便地除去来源于宿主细胞的内毒素，以达到可使本发明的可溶性蛋白直接施用于生物体的水平，这是使用重组细胞的制备中所需的。此外这种方法对于难以用常规方法重组生产的野生型ChM1L的纯化也有效。
发明的最佳实施方式<可溶性多肽S-ChM1L、MS-ChM1L或编码它们的核酸分子>
本发明涉及具有抑制血管发生的活性和抑制由破骨细胞引起的骨吸收的活性的可溶性多肽。
已知所谓重新形成毛细血管的“血管发生(angiogenesis)”的现象经历如下步骤(1)血管基底膜和其周围的细胞外基质中的、由基质金属蛋白酶(MMP)等引起的消化、(2)血管内皮细胞的迁移、(3)血管内皮细胞的增殖、(4)毛细血管的形成的阶段。本发明中所称的血管发生抑制是指与上述阶段中至少一个阶段相关的，基本上抑制血管发生的活性。
如下述的实施例所示，具有序列号9所示的氨基酸序列的多肽具有抑制上述(1)-(4)的所有阶段的活性。因此，认为本发明的多肽可以作为癌症、类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病性视网膜病等伴随血管发生的疾病的治疗药物使用。
此外，令人惊讶地发现本发明的可溶性多肽还具有抑制由破骨细胞引起的骨的吸收的功能。本发明中所称骨吸收抑制是指对由破骨细胞的活化所产生的骨的吸收的抑制活性。
一般而言，通过调节成骨细胞产生的骨形成和由破骨细胞产生的骨吸收的平衡控制骨代谢。作为由骨代谢的异常引起的疾病，已知有骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨Paget病、高钙血症、齿周骨丧失、肾脏骨营养异常症(renal osteodystrophy)、骨溶解性肿瘤和骨转移性肿瘤等。因此，本发明的可溶性多肽也可以用于针对与由破骨细胞产生的骨吸收相关的上述疾病的治疗药物。尤其是，由于类风湿性关节炎是问题在于伴随血管发生的滑膜细胞的炎症、增殖，以及由破骨细胞引起的骨/软骨破坏的问题的疾病，且骨转移性肿瘤是这样一种疾病，其中血管发生与肿瘤的增大和转移密切相关，破骨细胞与由骨吸收引起的骨的溶解密切相关，因此与现有药剂相比，本发明的可溶性多肽具有优势。
本发明的可溶性多肽，典型地是具有序列号9所示的氨基酸序列的多肽(S-ChM1L)、也可以是其两端进一步添加了一个或者一个以上的氨基酸残基，尤其是在所述多肽两端添加了构成除ChM1L之外的其它肽的氨基酸残基的多肽(MS-ChM1L)。例如，序列号9所示的氨基酸序列的N末端上添加了谷氨酰胺或焦谷氨酰胺的多肽也有抑制血管发生的活性和抑制骨吸收的活性。此外，即使是在序列号9所示的氨基酸序列的N末端上添加适当的标记序列，典型的是添加组氨酸标记或FLAG标记的多肽依然有抑制血管发生的活性和抑制骨吸收的活性。进而，即使代替标记序列，添加来自水母的荧光蛋白质或分泌型碱性磷酸酶的氨基酸序列等的多肽依然保持所希望的功能。
因此，应该理解的是具有序列号9所示的氨基酸序列的多肽(S-ChM1L)、其一端或两端添加了其它蛋白质的氨基酸的多肽(MS-ChM1L)也属于本发明的范围内。
此外，序列号9所示的氨基酸序列中的一部分氨基酸残基被缺失或取代但仍具有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性的多肽在本发明的范围内，其也可理解为MS-ChM1L。
例如，也可获得在S-ChM1L中有一个及一个以上的氨基酸残基用与之具有相似化学特性或结构的氨基酸残基取代的可溶性多肽。这种置换为化学特性或结构相似的氨基酸的取代，即高保守性的取代的具体的形式是本领域技术人员众所周知的，例如可以例举有甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、Gly和丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、Thr和丝氨酸(Ser)或ala、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。
因此，即使可溶性多肽是由与序列号9所示的氨基酸序列不同的序列构成，只要其差异与如上文所述的高保守性的取代相当且该多肽具有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性，则这个可溶性多肽也是MS-ChM1L的一种。
上述的MS-ChM1L的氨基酸序列与序列号9所示的氨基酸序列具有70％或以上，优选80％或以上，或更优选90％或以上的同源性。
上述本发明的MS-ChM1L可以采用化学合成法或普通的遗传重组技术容易地进行制备。
作为通过基因工程方法的制备，可以例举有在适当的宿主细胞中表达由编码本发明的可溶性多肽的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA，回收该多肽的方法。例如，典型的可以制备编码如序列号9所示的氨基酸序列N末端添加自甲硫氨酸起始的氨基酸序列的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA，将其重组于合适的载体上转化宿主细胞，再使其表达。
此外，为了提高稳定性、可溶性、纯化的效率以及表达效率，检测所产生的分子等，可以制备编码在向序列号9所示的氨基酸序列添加了任意肽构成的氨基酸序列的DNA，将其重组于合适的载体上转化宿主细胞，再使其表达。
作为例子，本发明的可溶性多肽可如下制备，即包含由编码标记序列的核苷酸序列制备的含有具有6个或6个以上的连续的组氨酸残基的his标记序列、或FLAG标记序列。具有这种结构的可溶性多肽具有易于通过金属螯合物载体或抗体纯化的优点。
此外作为其它的例子，也可以以添加了构成来自水母的荧光蛋白质或分泌型碱性磷酸酶的氨基酸序列的所谓融合蛋白质的形式表达。对于与来自水母的荧光蛋白质的融合蛋白质，可测定其荧光强度，对于与分泌型碱性磷酸酶的融合蛋白质可测定由该酶与其底物反应所产生的显色、发光或荧光的强度，容易地检出这些融合蛋白质的存在。
这种情况，这些本发明的可溶性多肽的融合蛋白质，典型的可以通过在编码序列号9所示的氨基酸构成的多肽(S-ChM1L)的基因序列的5’或3’末端结合编码来自水母的荧光蛋白质或分泌型碱性磷酸酶的碱基序列，将其插入表达载体在适当的宿主中表达获得翻译成上述各蛋白质的氨基酸序列。
此外，以融合有任意氨基酸序列形式表达的本发明的可溶性蛋白质，可以如下方式获得，即与S-ChM1L相当的多肽与添加在该多肽上的序列结合的形式，或者除去其所添加的氨基酸序列的形式。作为除去添加的氨基酸序列的方法的一个例子，可以通过在含有可溶性多肽的序列与添加在这些序列上的序列之间插入赖氨酸进行基因构建，用内肽酶Lys-C(EC.3.4.21.50)处理表达获得的蛋白质，通过切断该赖氨酸残基C末端部分进行纯化，回收含有可溶性多肽序列部分的多肽。
上述的操作可以利用本领域技术人员常用的各种方法进行，此外，也可以利用酶或化学的合成多肽的方法(hermanson等人的生物结合技术(bioconjugate technique)(USA)1996年出版Academic Press)等公知的方法。
此外，在获得由活组织获得的或通过基因重组法产生的可溶性多肽后，通过对其结构进行修饰也可以获得本发明的可溶性多肽。对于生物体内的蛋白质或多肽类激素等，已知其N末端采取转换为焦谷氨酸的形式或者经乙酰基或甲酰基等修饰的形式，由此使蛋白质或多肽类激素的稳定性的提高同时活性发生变化。由此，根据需要还可以采用翻译后修饰本发明的可溶性多肽分子的N末端。作为获得这种分子的方法的一个例子，表达含有可溶性多肽分子且N末端为谷氨酰胺残基的序列，通过在5-10％醋酸溶液等酸性条件下处理所得多肽，可以获得N末端转换为焦谷氨酰胺的分子(park等Proceedings of theNational Academy of Science of the United States of America(USA)1991年3月出版p22046-2050)。此外作为其它的例子，通过用硫代-NHS-醋酸或无水醋酸处理含有N末端为具有α氨基的任意氨基酸残基等的表达的本发明的可溶性多肽序列的多肽，可以获得N末端被乙酰化的肽。此外，用荧光物质等化合物处理也可以修饰含有所得可溶性多肽序列的多肽。
通过与获得下述的重组蛋白质的方法相同的方法制备以上方法获得的经氨基酸取代修饰ChM1L和与ChM1L具有同源性的分子，通过实施例5-13所示的方法，可以确认抑制血管发生的活性和抑制骨吸收的活性。
<重组蛋白质>
本发明的可溶性多肽的表达和纯化，典型的可通过下述方式进行，制备可以在宿主细胞中表达编码多肽的基因的重组体DNA，将其导入宿主细胞中进行转化，培养转化体。作为这种宿主细胞，可以使用真核宿主细胞和原核宿主细胞的任一种。
真核宿主细胞中，可含有脊椎动物、酵母和昆虫细胞等。作为脊椎动物细胞可以例举有CHO细胞、293T细胞和COS7细胞等。
作为脊椎动物的表达载体，通常可以使用具有位于待表达的基因的上游位置的启动子，待表达基因下游的多腺苷酸化部位和转录终止序列等的载体。作为这种表达载体，可例举为如具有SV40的早期启动子的pSV2dhfr(Mol.Cell.boil.，854，1981)、pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)和pCAGGS(Gene，108，193-200，1991)等。
真核细胞中表达目的蛋白质的方法在本领域中有许多系统是周知的。例如，作为酵母中表达系统可举例有特开昭57-159489号公报中所示的“酵母中的蛋白质的表达”，作为昆虫细胞中的表达系统可举例有特开昭60-37988号公报中所示的“重组杆状病毒载体的制备方法”，作为哺乳动物细胞中的表达系统可例举有特开平2-171198号公报中所示的“真核表达的改良”，当然除此之外还存在很多。
在例如大肠杆菌、枯草杆菌和链霉菌等原核宿主细胞内也可表达获得编码本发明的可溶性多肽的基因。例如，作为上述宿主的大肠杆菌可以优选使用大肠杆菌(Echerichia coli)K12等菌株，可以使用作为载体的pBR322及其改良载体，但是也可以使用不限于这些载体的公知的各种菌株和载体。作为启动子，可以举例有例如大肠杆菌乳糖(lac)、大肠杆菌trp等启动子，但是并不限于这些启动子。此外，上述的启动子都是本领域技术人员熟知的，可以是合成的也可以是由已知的质粒构建的。
编码本发明的可溶性多肽的基因、含有该基因的重组质粒或重组病毒的核酸序列中可以引入许多修饰或改变。例如，通过遗传密码的简并性，对于多肽的全部的密码区域，可以在不改变其所编码的氨基酸的情况下，对核苷酸进行取代。这样的序列可以根据蛋白质的氨基酸序列推定，也可以通过下述常规的合成方法构建。这种合成方法，基本上可以按照Itakura等人的方法(Itakura等人，Science198，1059，1977)和Crea等人的方法(Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75，5765，1978)进行。因此，本发明不特别限于例示中的碱基序列，质粒和病毒。
作为将如此获得的目的基因导入宿主细胞的方法及由此产生的转化方法，可以采用常规的各种方法。此外，获得的转化体可以按照常规方法进行培养，可以生产出本发明的可溶性多肽。作为培养中所使用的培养基，可以适当选择所采用的宿主细胞需要的常用的各种培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
通过上述内容，可以在转化体的细胞内、细胞外或细胞膜上生产出该蛋白质。本发明的可溶性多肽，根据需要，可以通过利用其物理学性质、化学性质等性质的各种分离操作(参照日本生物化学学会编《生物化学数据书II》第1版第1次印刷、东京化学株式会社同人1980年6月23日出版p1175-1259 Arakawa等人Biochemistry(USA)1986年12月16日出版第25卷第25期p8274-8277(1986)；Langley等人EuropianJouanal of Biochemistry(Germany)1987年3月2日出版第163卷第2期p313-321等)进行分离，纯化。作为这种方法，可以例举有例如通常的重建处理，通过蛋白质沉淀剂处理(盐析法)、离心分离、渗压休克，超声波破碎、超滤、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲合色谱法、高效液相色谱法(HPLC)等各种液体色谱法、透析法、它们的组合等。此外，如果表达在该蛋白质上融合有亲和标记物的蛋白质，就可能利用这种标记实施亲合纯化。作为这种亲和标记物，可举例有例如聚组氨酸标记(His标记、Sisk等Journal of Virology(USA)1994年2月出版第68卷第2期p766-775)和FLAG标记(Hopp等Biotechnology 1988年出版第6卷p1204-1210)。融合这些亲和标记物的本发明的可溶性多肽(MS-ChM1L)的表达和检出，可以按照实施例1所述方式实施，使用这种标记的MS-ChM1L的纯化也按照实施例3所述方式实施获得。本发明的可溶性多肽的制备方法，更为具体地详述于实施例3。
<合成肽>
作为获得的本发明的可溶性多肽的方法，可以例举有化学合成该多肽的方法。
这种情况，可以利用固相合成法或液相合成法等一般采用的肽合成法。肽合成中，对于缩合法或氨基酸残基的保护以及合成后保护基的脱离可以利用公知的方法(泉谷等肽合成的基础和实验丸善株式会社1975年出版，矢岛等-日本生化学会编生物化学实验讲座1蛋白质的化学IV东京化学同人株式会社1977年出版)。此外，也可以一次合成可溶性多肽蛋白质全部的肽序列，但是也可以采用分别合成该蛋白质的部分肽，缩合这种部分肽的方法(日本生化学会编生物化学实验讲座蛋白质的化学IV合成和表达东京化学同人株式会社1991年出版)。在肽合成中使用的氨基酸的α氨基通常受tBoc基或Fmoc基保护，但是对于最终获得的肽，可以是带有这些保护基的形式或脱保护的形式。此外根据需要，也可以形成该肽的脱保护的氨基酸末端经酶修饰或焦谷氨酸或乙酰基或甲酰基等化学修饰的形式(Hermanson等人的生物结合技术(USA)Academic Press1996年出版)。作为具体的例子可以含有可溶性多肽的序列的肽在N末端具有谷氨酰胺的形式合成，通过用5-10％醋酸溶液等稀酸处理使其环化变为焦谷氨酸(Park等Proceedings of the National Academy of Science of the United States ofAmerica (USA)1991年3月出版p22046-2050)。
<抗体>
针对本发明的可溶性多肽的抗体可用于骨/关节疾病的诊断/治疗。例如在诊断中，可利用利用抗体的Western印迹、免疫沉淀法、ELISA法等。
上述采用的抗体可以使用本领域技术人员公知的方法获得。本发明中使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(Milstein等Nature(England)1983年10月6日出版第305卷第5934期p537-540)。例如，针对以本发明的可溶性多肽的多克隆抗体可以从以相同多肽作为抗原，从由其致敏的哺乳动物的血清等中回收。针对所述多肽的单克隆抗体，可以从由所述抗原致敏的哺乳动物中取出免疫细胞，与克隆的骨髓瘤细胞等融合获得杂交瘤，从其培养物中回收。
本发明的可溶性多肽或ChM1L蛋白质的检测中，可以对这些抗体适当标记。此外，还可以不标记这些抗体而标记与该抗体特异性结合的物质，例如蛋白质A或蛋白质G间接检测出所述多肽或蛋白质。
可以通过例如在表达载体中插入编码肽的基因或其一部分，导入适当的宿主细胞，制成转化体，培养该转化体从而表达重组蛋白质，从培养物或培养上清中纯化出表达的重组蛋白质，获得作为抗原的本发明的可溶性多肽或其部分肽。或者，也可以化学合成由所述基因编码的氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的寡肽，将其作为免疫原。作为被免疫的动物，可以使用小鼠、大鼠、家兔、山羊、马、仓鼠等。
<诊断方法>
对于本发明的诊断方法，通常以从被验者收集的生物体试样作为试样。作为生物样品，优选血液试样。所谓血液试样，可以使用全血、或由全血获得的血浆或血清。此外，作为本发明中的生物试样，除了血液之外，还可以使用滑液、通过活组织检查收集的关节软骨片、滑膜组织、腱组织、韧带组织、肌肉组织、泪液等。这些生物样品的收集方法是公知的。
如果由上述的生物体试样制备溶胞产物，可以制成用于本发明的可溶性多肽或ChM1L的免疫学的测定的试样。生物体试样的溶胞产物的抽提可利用市售的试剂盒方便地进行。此外如果本发明的可溶性多肽或ChM1L被分泌到血中或滑液中，就可以测定出被检者的血液或血清等体液试样中所含的本发明的可溶性多肽或ChM1L的量。本发明的方法中可以使用根据需要用缓冲液等稀释的上述试样。
进而本发明提供用于与血管发生或骨吸收相关的疾病的诊断方法的试剂。即本发明涉及一种包括识别含有本发明的可溶性多肽的氨基酸序列的多肽的抗体的，用于诊断伴随血管发生的疾病和ChM1L活性的减弱或增强的疾病例如类风湿性关节炎和腱炎的试剂。
构成本发明的试剂的抗体可以根据测试的形式，结合适当的标记物。或者构成本发明的试剂的抗体也可以根据测试的形式预先固定在适当的支持物上。此外本发明的试剂，除了前述抗体之外，也可以制成与检查或保存时需要添加的成分组合形式的诊断用试剂盒。作为可以构成试剂盒的添加的成分，可以举例有用于稀释试剂或生物体试样的缓冲液、阳性对照、阴性对照、用于测定标记物的底物。这些成分也可以根据需要预先混合。此外，根据需要可以在各个成分中添加保存剂或防腐剂。此外试剂盒还可以含有反应容器、记载测试步骤的说明书等。
本发明中所谓疾病的诊断包括例如下述的诊断。对于伴随血管发生的疾病和ChM1L活性的减弱或增强的疾病，例如癌症、类风湿性关节炎和腱炎等，即使通过一般的检查无法诊断的患者，如果进行根据本发明的检查就可以容易地判断出是否是患有这些疾病的患者。更为具体的是，在显示出疑似腱炎症状的患者中，ChM1L蛋白质的表达的提高或降低，显示该症状的原因是腱炎等的可能性高。
或者，使用于判断伴随血管发生的疾病和ChM1L活性的减弱或增强的疾病，例如癌症、类风湿性关节炎和腱炎等是否有改善的倾向的检查成为可能。也就是说，可用于判定对这些疾病的治疗效果。更为具体的是，对于显示出疑似腱炎症状的患者，ChM1L蛋白质的表达的提高或降低，显示腱炎进一步进行或改善的可能性高。
进而，根据表达水平的不同，也可以判定伴随血管发生的疾病和ChM1L活性的减弱或增强的疾病，例如癌症、类风湿性关节炎和腱炎等严重度。也就是说，ChM1L蛋白质的表达程度可能与这些疾病的轻重程度相关。
<药物>
针对伴随血管发生的疾病和ChM1L活性的减弱或增强的疾病，例如癌症、类风湿性关节炎和腱炎(牛皮癣、血管肿瘤、糖尿病性视网膜病、角膜损伤或角膜移植时的血管发生等)的治疗药物，含有本发明的可溶性多肽作为有效成分，其可以通过与生理学上可接受的载体、活化剂或稀释剂等混合进行制备。本发明的治疗药物以改善症状为目的，可以口服或非口服给药。
作为口服剂，可以选自于颗粒剂、粉剂、丸剂、胶囊剂、乳剂、或混悬剂等剂型。作为注射剂包括皮下注射剂、肌肉注射剂、关节腔注射剂或腹腔内注射剂等。
此外，作为眼科治疗中的给药剂型可以采用滴眼剂、软膏、含有有成分的贴眼透镜等。进而，血管内部位点还可以以含有或包被有支架(stent)或血管内栓塞剂的形式使用。
此外，适合给药的治疗药物的有效成分是由蛋白质构成时，通过采用基因治疗方法在生物体内导入编码该蛋白质的基因，可以达到治疗效果。通过在生物体内导入编码带来治疗效果的蛋白质的基因，表达，治疗疾病的方法是公知的(金田著日本药理杂质2001年出版第117卷p299-306)。
给药量，根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、给药方法、处理时间或含有该医药组合物的活性成分的种类等各有不同，通常平均一位成人，可以每次每人0.1mg至500mg范围，优选以0.5mg至20mg范围给药。但是，由于给药量根据各种条件的不同而改变，也存在比上述给药量更少的量就足够的情况，或者也存在需要超过上述范围的给药量的情况。
下面，以实施例对本发明更为详细地进行说明，但是这些实施例不限制本发明的范围。
并且，在下述实施例中，对各种操作除非有特别说明均按照Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.所著《分子克隆实验室手册第2版》(Molecula Cloninga Laboratory Manual，2nd edn.(USA)Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989年)所所示的方法进行，或者在使用的试剂或试剂盒时按照市售商品的说明书使用。
(实施例)以下的实施例中，所谓COS7细胞是由非洲绿猴肾脏获得的细胞，其是可以由ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的细胞(No.CRL-1651)，所谓293T细胞是由胎儿肾脏获得的细胞，其可以由Gene Hunter公司获得(Cat.No.Q401)，所谓MRC-5细胞是由胎儿正常成纤维细胞获得的细胞，其可以通过理研生物资源中心获得(No.RCD0211)、B16F10细胞是由小鼠黑色细胞瘤获得细胞，其是可以通过ATCC获得的细胞(No.CRL-6475)，所谓Lewis肺癌(LLC)细胞是由小鼠肺癌获得的细胞，其可以通过ATCC获得(No.CRL-1642)。此外，实施例中，HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)细胞和HMVEC(人皮肤微静脉内皮细胞)可以从Clontics公司获得，或者NHDF细胞可以通过三光纯药获得。
实施例1可溶性多肽蛋白质的检测<方法>通过PCR法扩增编码人ChM1L(氨基酸第1-317位)的C端融合有FLAG标记的蛋白质的cDNA(序列号1)，克隆到pCAGGS载体(Miwa等Gene(荷兰)1991年12月15日出版第108卷第2期p193-200)中(pCAGGS-hChM1L-FLAG)。尽管如此，作为本实施例中所述的FLAG标记(sigma公司)，是由8个氨基酸构成的亲水性的标记肽(AspTyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)。采用Lipofectamine plus试剂(Lifetechnologies公司)，按照产品说明书，用pCAGGS和pCAGGS-hChM1L-FLAG转染COS7细胞和293T细胞。自转染约48小时后回收培养上清，用抗FLAG的M2琼脂糖(Sigma公司)进行免疫沉淀。用15％的凝胶对免疫沉淀后的试样进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，转移到硝化纤维素膜上。一级抗体采用抗ChM1L的多克隆抗体(非专利文献5)，二级抗体采用以辣根过氧化物酶标记的抗家兔IgG抗体(Dako公司)，通过ECLplus试剂(amersham pharmacia生物技术公司)按照产品说明书进行显色反应。
<结果>

图1表示通过对可溶性多肽的Western blot法检测结果(泳道1pCAGGS(COS7细胞)、泳道2pCAGGS-ChM1L-FLAG(COS7细胞)、泳道3pCAGGS(293T细胞)、泳道4pCAGGS-ChM1L-FLAG(293T细胞))。在pCAGGS-hChM1L-FLAG所转染的细胞中，清楚的是培养液中存在约15kDa的可溶性多肽。
实施例2可溶性多肽的纯化和N末端氨基酸序列的分析<方法>采用lipofectamineplus试剂(Life technologies公司)，按照产品说明书，用pCAGGS-hChM1L-FLAG转染293T细胞，约48小时后回收培养上清。用抗FLAG的M2琼脂糖(Sigma公司)，制备亲合层析柱，将培养上清上柱。用25mM Tris盐酸缓冲液，150mM NaCl(pH7.4)洗柱后，用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱，用体积为1/20的1MTris-HCl(pH9.5)中和洗出液。用洗出液以15％凝胶进行SDS-PAGE，在转移到Sequi-blotTMPVDF膜(bio-rad公司)上之后，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色。切出约15kDa的条带，用焦谷氨肽酶(Takara公司)处理后，通过Edman末端降解法分析N末端氨基酸序列。
<结果>(A)中表示的是对可溶性多肽的纯化过程的各个级分实施SDS-PAGE，通过GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色的结果(泳道1培养上清，泳道2未吸附到柱上的级分、泳道3清洗级分、泳道4-11洗脱级分)。在从柱上洗脱的级分中，清楚地证明存在约15kDa的可溶性多肽。切出约15kDa的条带，通过Edman降解法分析，不能读取氨基酸序列，认为N末端被封闭。用焦谷氨肽酶处理后，分析N末端氨基酸序列，查明序列为ASEEELP。因此，查明可溶性多肽是由膜结合型ChM1L(317个氨基酸)的第237位至第317位的81个氨基酸(序列号4)构成的，清楚的是N末端氨基酸的第237位的谷氨酰胺被转换为焦谷氨酸(B参照ChM1L和ChM-I的切点比较)。
实施例3MS-ChM1L在大肠杆菌中的表达和纯化
<方法>PCR法扩增编码带有Met并包含His标记和FLAG标记的与人ChM1L的第237-317位部分氨基酸序列的N末端融合的蛋白的cDNA(序列号5)，克隆到pET(Novagen公司)载体中(pET-shChM1L)。将pET-shChM1L转化大肠杆菌Origami B(DE3)pLyS(Novagen公司)。在LB培养基中培养大肠杆菌过夜，对其一部分再培养3小时后，通过以1mM的最终浓度添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-1-thio-β-D-thiogalactoside、IPTG)诱导重组蛋白质的表达，继续培养4小时。以5000×g离心培养液使大肠杆菌颗粒化，以6M胍、0.1MNaH2PO4，pH8.0的0.01M Tris盐酸缓冲液洗脱后，通过离心分离除去不溶性级分，上镍-次氮基三乙酸琼脂糖(Qiagen)柱。用含8M尿素，0.1MNaH2PO4，的0.01M Tris盐酸缓冲液pH8.0清洗柱，进一步以慢慢增加的咪唑浓度清洗后，用加入200mM咪唑的缓冲液洗脱重组蛋白质。将洗脱级分上PD-10柱(Amersham Pharmacia生物技术公司)，用25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3的缓冲液交换。通过对采用TritonX-114的Aida等人的方法(Aida等人Journal of ImmunologicalMethods(荷兰)1990年9月14日出版第132卷第2期p191-195)进行部分改变的以下所示的方法除去重组蛋白质溶液中的内毒素。在重组蛋白质溶液中以1％的最终浓度加入Triton X-114，在冰上温育30分钟、37℃下温育10分钟后，25℃下以2000×g离心10分钟，回收上清。所述上清中以1％的最终浓度加入Triton X-114，再次重复上述操作。用1％脱氧胆酸钠清洗PD-10柱以除去柱内的内毒素后，替换为经Posidain Filter(Pole公司)除去内毒素的25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3后，将重组多肽溶液上柱，除去残留的Triton X-114。用鲎试剂测定法(Limulus amebocyte lysate assay)(Biowhittacker公司)测定内毒素的浓度。使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，以BCA蛋白质测试试剂(Pierce公司)测定蛋白质浓度。用15％凝胶对纯化的重组多肽进行SDS-PAGE，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色。
<结果>对纯化的重组多肽实施SDS-PAGE后，用GelCodeBluestain试剂(Pierce公司)染色的结果表示于图3中(泳道1非还原化(-2巯基乙醇)、泳道2还原化(+2巯基乙醇))。纯化的重组多肽的内毒素的浓度不到5EU/mL/mg蛋白质，生产率为15-30mg/L培养物。通过上述方法，可以大量获得可以给细胞和生物体施用的重组多肽。
实施例4血管内皮细胞的增殖抑制作用的分析<方法>细胞增殖的分析是以DNA的合成(细胞对BrdU的吸收)为指标进行的。在96孔板上以3000个/孔的浓度培养细胞，这之后，在无血清存在的条件下培养24小时(37℃，CO2存在下)。将每个孔清洗后，各种浓度的MS-ChM1L存在下，用10ng/ml FGF-2(成纤维细胞增殖因子2)、10ng/ml VEGF(血管内皮因子)、10ng/ml HGF(干细胞增殖因子)、10％FBS(牛胎儿血清)刺激细胞24小时(图4B-4E)或48小时(图4A)。在最后的3小时BrdU被吸收到细胞中。
<结果>MS-ChM1L的对于各种细胞的DNA合成抑制活性表示于图4中。图4中的A表示MS-ChM1L抑制HUVEC的由各种刺激引起的DNA合成，B表示MS-ChM1L浓度依赖性地抑制HUVEC的由FGF-2刺激引起的DNA合成，C表示MS-ChM1L抑制HMVEC中的DNA合成，D表示MS-ChM1L不抑制NHDF中的DNA合成，E表示MS-ChM1L不抑制MRC-5中的DNA合成。各值表示平均值±标准偏差，“**”和“***”表示相对于对照值(vehicle)显著差异(**为P＜0.01、***为P＜0.001)。
100μg/ml的MS-ChM1L几乎完全抑制人脐带静脉内皮细胞(HUVECs可获自Clonetics)中FGF-2、VEGF、HGF、FBS依赖性的DNA合成(图4A)。此外，观察到了MS-ChM1L对FGF-2依赖性的DNA合成的抑制是浓度依赖性的(图4B)。在其它的血管内皮细胞中(人皮肤微血管内皮细胞HMVEC，clonetics公司)也发现了由MS-ChM1L引起的DNA合成的抑制(图4C)。但是，作为人成纤维细胞的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF、三纯制药)、MRC-5细胞(正常肺成纤维细胞)中，观察到100μg/ml的MS-ChM1L也不引起DNA合成受到抑制(图4D和4E)。因此，认为MS-ChM1L血管内皮细胞特异性地抑制DNA合成。
实施例5血管内皮细胞毛细血管形成的抑制作用的分析<方法>在24孔板中以320μl/孔加入Growth-factor-reducedMatrigel(Becton Dickinson公司)，37℃下培养30分钟。使用通过EBM-2培养基(Clonetics公司)将EGM-2培养基(clonetics公司)以1/8稀释的培养基，制备含有50000个HUVEC/mL的细胞悬浮液。在1/mL的细胞悬浮液中(50000个细胞)中加入100，25，12.5μg/mL的重组MS-ChM1L或缓冲液(25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3)，接种在经Growth-factor-reduced Matrigel(Becton Dickinson公司)包被的24孔板上，6小时后观察毛细血管形成拍摄照片。
<结果>MS-ChM1L对HUVEC的毛细血管形成的抑制表示于图5中。A表示25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3条件下毛细血管形成，B表示100μg/mL MS-ChM1L，C表示25μg/mL MS-ChM1L，D表示12.5μg/mL MS-ChM1L的情况，定标线条表示100μm。表明MS-ChM1L以浓度依赖性抑制HUVEC的毛细血管形成。
实施例6血管内皮细胞的迁移抑制作用的分析<方法>通过使用1μg/mL的玻璃粘连蛋白(Sigma公司)包被滤膜的上层和下层的孔径为8mM的Transwell(coster公司)进行血管内皮细胞的迁移实验。也就是说，在24孔板的各孔中均加入总共600μl的含有0.1％的血清的培养基、含有10ng/mlVEGF的培养基、或含有10ng/ml FGF-2的培养基。在板的各孔上安装滤膜后，将无血清存在条件下培养24小时的人脐带静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cellsHUVEC，clonetics公司)悬浮于存在各种浓度的MS-ChM1L的培养液中，以50000个/孔的密度添加到滤膜的上层。37℃，CO2存在下培养细胞4小时后，取下滤膜，用甲醇固定细胞。用Diff-Quick染色液(Dade Behring公司)对滤膜染色后，用棉棒除去滤膜上层的细胞。用刀片切取滤膜，封入载玻片，显微镜下对迁移细胞数计数。求出迁移细胞数作为平均一个视野的细胞数。
<结果>MS-ChM1L对HUVEC的迁移的抑制表示于图6中。A表示MS-ChM1L抑制HUVEC的对于VEFG的迁移，B表示MS-ChM1L浓度依赖性的抑制HUVEC的对于FGF-2的迁移。各值表示平均值±标准偏差，显示相对于对照值(vehicle)显著差异(*为P＜0.05、**为P＜0.01)。迁移实验的结果，观察到MS-ChM1L产生了对于VEFG、FGF-2的迁移的抑制(图6A和6B)。这种迁移抑制在MS-ChM1L为100μg/mL时最强，发现了浓度依赖性。也就是说，表明MS-ChM1L抑制血管内皮细胞的迁移。
实施例7血管内皮细胞的细胞粘着抑制作用的分析<方法>用1μg/mL纤维连接蛋白(Sigma公司)、1μg/mL玻璃粘连蛋白(Sigma公司)、1μg/mL I型胶原包被96孔板。清洗各孔后，用含有1％BSA的PBS进行阻断。将HUVEC以1000000个/mL浓度悬浮于不含血清的培养基中，用钙黄绿素AM(Molecular probes公司)荧光标记。清洗细胞后，在各孔中以100000个/孔添加MS-ChM1L至其浓度为100μg/mL。37℃，CO2存在下培养细胞1小时后，用荧光平板读数器测定荧光强度。
<结果>图7中显示MS-ChM1L抑制HUVEC对于玻璃粘连蛋白的粘着。各值表示平均值±标准偏差，**表示相对于对照值(vechile)显著差异(**为P＜0.01)。观察到MS-ChM1L抑制HUVEC对于玻璃粘连蛋白粘着。另一方面，没有发现对于纤维连接蛋白、I型胶原的粘着的影响。也就是说，弄清了MS-ChM1L抑制对于玻璃粘连蛋白的细胞粘着。此外，清楚了本实验是可以简便调查重组MS-ChM1L蛋白质活性的方法。进而，由于已知玻璃粘连蛋白与整联蛋白αvβm结合，因此清楚了MS-ChM1L抑制玻璃粘连蛋白与整联蛋白αvβm的相互作用。此外，推测其机理为MS-ChM1L通过与整联蛋白αvβm结合，抑制其活性表达血管发生抑制作用。
实施例8关于血管内皮细胞的细胞周期的分析<方法>通过由流式细胞仪(flow cytometer)监控细胞的DNA量进行细胞周期的分析。由于细胞如M期→G1期→S期→G2期→(M期)这样规则地迁移，因此通过调查DNA量可以识别出细胞周期处于哪一阶段。在10cm皿中以1000000个/孔的浓度培养HUVEC，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。清洗后，100μg/mL MS-ChM1L存在下，以EGM-2培养基刺激细胞24小时。用Triton-X100、Rnase处理细胞后，用PI(propidium iodide)进行染色，通过流式细胞仪进行分析。
<结果>与仅用EGM-2培养基刺激的情况(图8A)相比，以EGM-2培养基和MS-ChM1L刺激的条件中，G1期的细胞数增加，S期和G2/M期的细胞数减少(图8B)。该结果显示G1期的细胞没有迁移到S期。因此，显露出HUVEC通过MS-ChM1L的作用停止于细胞周期的G1期(G1停止)。
实施例9关于血管内皮细胞中的间质金属蛋白酶(MMPs)的产生的分析<方法>在24孔板中培养HUVEC，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。清洗后，100μg/mL MS-ChM1L存在下，不刺激或以10ng/ml tnf-α刺激细胞24小时。用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen公司)和Dnase提取总RNA，用Omniscript RT试剂盒(Qiagen公司)通过逆转录反应合成cDNA。通过含有各0.1μM的正义引物和反义引物、5μl 2×SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)、2μlcDNA，总量为10μl的反应液进行实时PCR。作为反应条件，进行1)变性(95℃下15秒)、2)退火和延伸反应(60℃下1分钟)的循环。采用GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems公司)对各目的基因的表达量进行定量。
通过在PCR每个循环时按时测定与扩增的PCR产物(双链DNA)结合的SYBR Green的荧光信号强度，制作成PCR产物相对于循环数的扩增曲线，然后算出该扩增曲线与任意域值(通常，选择扩增曲线的指数扩增区域的中点附近)的交差循环域值(threshold cycle，ct)值，进行扩增的PCR产物量的定量。通过计算式2-(目的的ct-18s的ct)计算出目的mRNA相对于作为内部标准18S的相对表达量。
<结果>就MMP-2、MT1-MMP的mRNA的表达进行了分析。图9显示了MS-ChM1L对于HUVEC中的间质金属蛋白酶的mRNA的表达的影响。A表示MS-ChM1L抑制MMP-2mRNA的表达，B表示MS-ChM1L抑制MT1-MMP mRNA的表达。各值仍表示平均值±标准偏差，*和**表示相对于对照值(vechlie)显著差异(*为P＜0.05、**为P＜0.01)。
已知，MMP-2、MT1-MMP在以TNF-α刺激血管内皮细胞的情况中表达增加(J.Cell Sci.，2001年1月；114(pt 1)131-139，blood.，2003年3月1日；101(5)1810-7，Biochem.J.，1993年12月15日；296(pt 3)803-9)。在本实验条件下，没有识别出由TNF-α引起的表达的增加，无论是否存在TNF-α，MS-ChM1L都抑制MMP-2和MT1-MMP的mRNA的表达。
(图9A和B)。MMP-2和MMP-9是与基底膜破坏极为相关的MMP，它们强有力地分解基底膜的主要成分IV型胶原。此外，MT1-MMP不仅在细胞膜上将前体MMP-2转化为活化型的MMP，而且还分解自己细胞外基质。因此，由这次的MS-ChM1L的作用抑制MMP-2、MT1-MMP的mRNA的表达的结果提示MS-ChM1L有抑制血管发生时的基底膜破坏的可能性。
实施例10FGF-2诱导的海绵血管发生模型中的体内血管发生抑制作用的分析<方法>用FGF-2诱导的海绵血管发生模型(Br JPharmacol.2000，399，2-3，233-237)研究MS-ChM1L的体内的血管新生抑制作用。在雄性SD家兔(七周大)中在背部侧皮下移植圆形海绵盘(circular sponge disk，厚5mm×直径15mm)，次日起一天一次在海绵中以人重组FGF-2(500ng/50μl/位点)施用3天以诱导血管发生。一天一次在海绵中以MS-ChM1L(5ng/50μl/位点)施用3天。第4天时取出海绵和周围组织，实施肉眼观察和组织学研究。
<结果>观察到通过施用FGF-2产生了周围的肉芽组织的形成和血管向肉芽组织中的发生，MS-ChM1L显著地抑制了该模型中肉芽组织的形成和血管发生(图10)。该模型中在移植初期观察到活跃的炎症，观察到海绵周围的肉芽组织的增殖和血管发生。因此，提示MS-ChM1L抑制增殖性炎症和肉芽组织的增殖、血管发生。
实施例11破骨细胞形成抑制作用的分析(用M-CSF依赖性的巨噬细胞研究)<方法>采用M-CSF(巨噬细胞克隆刺激因子)依赖性的巨噬细胞，对东等人的方法(东等The Journal of Biological Chemistry(USA)2000年2月18日公开第275卷第7期p4858-4864)进行部分改变从而实施破骨细胞的形成。从7-8周大的雄ddY小鼠(日本SLC一公司)的大腿骨和胫骨中取出骨髓细胞，破坏红血球后，在含有α-MEM，10％FBS，100ng/ml人M-CSF(Pepro-Tech Ec有限公司)的培养基中培养，进行2次传代培养，获得M-CSF依赖性增殖的来源于骨髓细胞的巨噬细胞。将这种细胞以10000个/孔散布于48孔板上，约6小时后(确认发生粘附后)，添加100ng/ml人M-CSF、50ng/ml人sRANKL(可溶性RANK配体，Pepro-Tech Ec有限公司)和MS-ChM1L或ChM--I。5天后进行酒石酸抗性磷酸酶(TRAP)染色。
<结果>MS-ChM1L和ChM--I显著地抑制表达已知作为成熟破骨细胞的标记的TRAP(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review)的破骨细胞的形成(图11)。
实施例12破骨细胞形成抑制作用的分析(用骨髓细胞培养系统进行研究)<方法>从9-10周大的雄ddY小鼠(日本SLC一公司)的大腿骨和胫骨中取出骨髓细胞，破坏红血球后，悬浮于含有α-MEM，10％FBS，的培养液中，以500000个/孔散布于48孔板上，24小时后，添加已知诱导破骨细胞形成的1,25(OH)2D3(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review)和MS-ChM1L或ChM--I。8天后进行TRAP染色。
<结果>图12中显示MS-ChM1L和ChM--I抑制骨髓细胞形成破骨细胞。A表示1,25(OH)2D3(10-8M)+Vehicle，B表示1,25(OH)2D3(10-8M)+10μg/mL MS-ChM1L，C表示1,25(OH)2D3(10-8M)+100μg/mL MS-ChM1L，D表示1,25(OH)2D3(10-8M)+10μg/mL ChM--I，E表示1,25(OH)2D3(10-8M)+25μg/mL ChM--I。结果显示MS-ChM1L和ChM--I显著抑制TRAP阳性破骨细胞的形成(图12)。
实施例13破骨细胞形成抑制作用的机理分析<方法>在96孔板上以10000个/孔散布按与实施例11相同的方法制备的M-CSF依赖性的骨髓巨噬细胞，约6小时后(确认细胞发生粘附后)，添加100ng/ml人M-CSF、50ng/ml人sRANKL(可溶性RANK配体，Pepro-Tech Ec有限公司)和MS-ChM1L。在第0-5天、第0-3天、第3-5天的3个时间段用MS-ChM1L处理。5天后通过酒石酸抗性磷酸酶(TRAP)染色后鉴定破骨细胞，研究形成数。MS-ChM1L处理前，处理后第1、3、5天去除培养液，用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen公司)和Rnase-Free Dnase set(Qiagen公司)提取总RNA。接着，用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen公司)进行逆转录反应，合成cDNA。用SYBR GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems公司)和以下的所示的引物通过ABI PRISM-TM7000(Applied Biosystems公司)实施实时PCR。Primerrodent GAPDH引物是从Applied Biosystems公司购买的。
并且，如下文所示，可知测定的各个基因与破骨细胞的分化、成熟有密切的关系。
现在已知降钙素受体(CTR)是多核的成熟破骨细胞的标记(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review)。M-CSF是破骨细胞前体细胞的生存所必须的细胞素，其受体是c-fms(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review)。RANKL是破骨细胞形成和活化所必须的细胞素，其受体是RANK(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review)。NFATc1是破骨细胞形成所必须的转录因子，现在可知如果抑制NFATc1的功能就不形成破骨细胞(Nature，2003年5月15日；423(6937)337-42，Review.dev.cell，2002年12月，3(6)889-901)。
CTRF5’-GTGCTCCTCGGGCTGTAGCR5’-GAGGATTCCGTGGTTCCTGATTRAPF5’-GATCCCTCTGTGCGACATCAR5’-CCAGGGAGTCCTCAGATCCA
c-fmsF5’-TGGCATCTGGCTTAAGGTGAAR5’-GAATCCGCACCAGCTTGCTARANKF5’-ATGAGTACACGGACCGGCCR5’-GCTGGATTAGGAGCAGTGAACCNFATc1F5’-AGGCTGGTCTTCCGAGTTCAR5’-ACCGCTGGGAACACTCGAT<结果>在使用M-CSF依赖性的骨髓细胞经M-CSF、RANKL作用的破骨细胞形成系统中，添加10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL MS-ChM1L培养5天，25μg/mL、50μg/mL的用量显著地抑制了破骨细胞形成(图13)。此外，如果在培养的初期(第0-3天)以MS-ChM1L作用，即使这之后除去MS-ChM1L培养也不会形成破骨细胞，与之相反在培养后期(第3-5天)添加MS-ChM1L的情况就形成了破骨细胞。根据这些结果，清楚了MS-ChM1L在破骨细胞分化的初期阶段作用并抑制其后的分化，对于进化到分化程度的细胞不抑制破骨细胞的形成。在处理MS-ChM1L的情况中，已知作为破骨细胞标记的降钙素受体(CTR)抑制了酒石酸抗性磷酸酶(TRAP)的表达。此外，破骨细胞的形成所必须的因子NFATc1和RANK的表达也被显著地抑制。另一方面，在破骨细胞前述细胞的生存所必须的因子M-CSF的受体c-fms的表达中没有发现有显著的差异(图14)。
根据这些结果，清楚了MS-ChM1L不抑制破骨细胞的生存信号，而抑制破骨细胞的形成。
实施例14由施用MS-ChM1L引起的B16F10黑色素瘤的增殖抑制作用的分析<方法>在C57BL6/J小鼠(雄性，6周大)的背部皮下以500000个/只移植B16F10细胞，3天后测定肿瘤大小进行分组。进行分组后，1天1次在癌细胞周围的皮下以50μl/位点施用MS-ChM1L(3mg/mL)或vehicle(25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3)。每天用测径器(caliper)测定癌细胞的大小(长度×宽度2×0.52)。以DNA合成(细胞对BrdU的吸收)为指标进行体外(in vitro)的B16F10细胞的增殖分析。以3000个/孔的浓度在96孔板上培养细胞，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。将每个孔清洗后，各种浓度的MS-ChM1L存在下，用10％FBS刺激细胞24小时。在最后的3小时BrdU被吸收到细胞中。
<结果>MS-ChM1L在体内抑制B16F10细胞的增殖(图15A，C)。另一方面，在体外不抑制B16F10细胞的增殖(图15B)。因此，认为MS-ChM1L通过血管发生抑制作用抑制体内的B16F10细胞的增殖。
实施例15由施用MS-ChM1L引起的B16F10黑色素瘤的肺转移抑制作用的分析<方法>在C57BL6/J小鼠(雄性，6周大)的静脉内以50000个/只移植B16F10细胞，1天1次在背部皮下以50μl/位点(150μg/位点)施用MS-ChM1L(3mg/mL)或vehicle(25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3)。移植后，第21天取出肺，在显微镜下对转移的细胞的克隆数计数。
<结果>MS-ChM1L抑制了B16F10细胞的肺转移(图16)。各值仍表示平均值±标准偏差，***表示相对于对照值(vehicle)显著差异(P＜0.001)。
实施例16血管内皮细胞的细胞凋亡诱导作用的分析<方法>已知在细胞凋亡初期细胞膜结构发生变化，正常细胞中存在于脂质双层膜的内侧的磷脂酰丝氨酸露在细胞膜的外侧。因此，采用利用膜联蛋白V(Annexin V)与磷脂酰丝氨酸结合的方法进行细胞凋亡诱导作用的分析。具体的是，在6孔板上以100000个/孔的浓度培养人皮肤微血管内皮细胞(HMVECs)，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。清洗后，各种浓度的MS-ChM1L存在下，用10ng/ml FGF-2刺激细胞。48小时后，用胰蛋白酶-EDTA剥落细胞，用annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Biovision公司)染色后，通过流式细胞仪进行分析。
<结果>MS-ChM1L以浓度依赖性方式诱导HMVECs的细胞凋亡。因此，认为MS-ChM1L在血管内皮细胞中具有诱导细胞凋亡的作用(图17)。各值仍表示平均值±标准偏差，***表示相对于对照值(vehicle)显著差异(P＜0.001)。
实施例17活组织的可溶性MS-ChM1L蛋白质的检测<方法>从DBA1/J小鼠(雄性，13周大)中取出跟腱、眼球、肾脏、肝脏，用液氮冷冻后，用研杵和研钵粉碎。用4M胍、50mM醋酸钠pH5.8和匀浆器将粉碎的组织溶解，用超声波处理后，以15000rpm离心分离10分钟。离心后的上清中加入9倍量的100％乙醇，-80℃下放置5分钟后，以15000rpm离心分离10分钟。去除上清后，用50mM醋酸钠pH5.8悬浮沉淀后，再加入9倍量的100％乙醇，以15000rpm离心分离10分钟。用8M脲、20Mm Tris pH8.0溶解沉淀。标准地使用牛血清白蛋白通过BCA蛋白质检测试剂(Pierce公司)测定蛋白质浓度。以35μg/泳道用10-20％凝胶对试样进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上。一级抗体是抗ChM1L多克隆抗体(非专利文献6)，二级抗体采用以辣根过氧化物酶标记的抗家兔IgG抗体(Dako公司)，通过ECLplus试剂(Amersham Pharmacia生物技术公司)按照产品说明书进行显色反应。
<结果>清楚了腱和眼球中存在约40kDa的膜结合型ChM1L蛋白质，而腱中还存在约14kDa的可溶性ChM1L蛋白质(图18)。根据以上结果，第一次清楚了可溶性ChM1L蛋白质在生理上是存在的。
实施例18ChM1L mRNA表达的组织特异性分析<方法>就ChM1L mRNA表达的组织特异性而言，从小鼠的各组织中提取总RNA后，通过进行实时PCR分析。也就是说，通过以下所示的操作实施。用ISOGEN(日本基因公司制)从C57BL6/J小鼠的各组织中提取总RNA后，用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen公司)和Rnase-Free Dnase set(Qiagen公司)提纯。通过使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen公司)、RnaseOUT重组核糖核酸酶抑制因子(invitro制)和随机引物(Takrabio制)的逆转录反应，进行cDNA的合成。用含有针对小鼠ChM1L基因的正义引物和反义引物、SYBR Green PCR MasterMix、cDNA的反应液进行实时PCR。引物，使用(正义引物)5’-AAACACTTCTGGCCCGAGGTAT-3’、(反以引物)5’-AGTGTGCTCCATGTCATAGGTTTTC-3’用于小鼠ChM1LmRNA的测定。此外，小鼠GAPDH mRNA测定用的正义引物、反以引物使用从Appliedbiosystems有限公司购买的引物。PCR反应在1)变性(95℃下15秒)、2)退火和延伸反应(60℃下1分钟)的条件下进行40个循环。采用GeneAmp 5700序列检测系统软件(Applied Biosystems公司)对各目的基因的表达量进行定量。也就是说，通过在PCR每个循环时按时测定与扩增的PCR产物结合的SYBR Green的荧光信号强度，制作成PCR产物相对于循环数的扩增曲线，然后算出该扩增曲线与任意域值(通常，选择扩增曲线的指数扩增区域的中点附近)的交差循环域值(ct)值，进行定量。通过以下所示计算式分别计算出ChM1L mRNA相对于作为内部标准GAPDH的相对表达量。
ChM1L mRNA的相对表达量＝2-(GAPDH的ct？ChM1L的ct)<结果>ChM1L mRNA的表达在跟腱中最高(图19)。在眼、脑、肺、胸腺、横膈膜、胃、胰腺、肌肉、皮肤、肋骨中也发现了ChM1LmRNA的表达，但是与跟腱相比表达量要低。此外，在脾脏、心脏、肝脏、肾脏、小肠、脂肪组织中没有检测出ChM1L mRNA的表达。因此，提示了ChM1L以腱特异性表达。
实施例19小鼠腱细胞的分离和ChM1LmRNA表达的细胞特异性分析<方法>通过以下所示操作分离小鼠的腱细胞。也就是，不混入皮肤、肌肉、脂肪地摘出小鼠的腱，在含有2mg/mL的胶原酶的DMEM/10％FBS中消化3小时(37℃，5％CO2)。离心后，将获得细胞团块悬浮于DMEM/10％FBS中，于10cm皿中培养(37℃，5％CO2)。7天后，由于观察到了培养细胞充分的增殖，进行传代培养，获得小鼠腱细胞。
对于ChM1LmRNA表达的细胞特异性，是通过从小鼠腱细胞和来源于小鼠的细胞株提取总RNA后进行实时PCR而分析的。也就是，通过以下所示操作实施。通过Rneasy Mini试剂盒(Qiagen公司)和Rnase-Free Dnase set(Qiagen公司)提取总RNA，通过使用OmniscriptRT试剂盒(Qiagen公司)、RnaseOUT重组核糖核酸酶抑制因子(invitro制)和随机引物(Takrabio制)的逆转录反应，进行cDNA的合成。用含有针对小鼠ChM1L基因的正义引物和反义引物、SYBR Green PCRMaster Mix、cDNA的反应液进行实时PCR。引物，使用(正义引物)5’-AAACACTTCTGGCCCGAGGTAT-3’、(反以引物)5’-AGTGTGCTCCATGTCATAGGTTTTC-3’用于小鼠ChM1LmRNA的测定。此外，小鼠GAPDH mRNA测定用的正义引物、反以引物使用从Appliedbiosystems有限公司购买的引物。PCR反应在1)变性(95℃下15秒)、2)退火和延伸反应(60℃下1分钟)的条件下进行40个循环。采用GeneAmp 5700序列检测系统软件(Applied Biosystems公司)对各目的基因的表达量进行定量。也就是说，通过在PCR每个循环时按时测定与扩增的PCR产物结合的SYBR Green的荧光信号强度，制作成PCR产物相对于循环数的扩增曲线，然后算出该扩增曲线与任意域值(通常，选择扩增曲线的指数扩增区域的中点附近)的交差循环域值(ct)值，进行定量。通过以下所示计算式分别计算出ChM1L mRNA相对于作为内部标准GAPDH的相对表达量。
ChM1L mRNA的相对表达量＝2-(GAPDH的ct-ChM1L的ct)<结果>小鼠腱细胞中的ChM1L mRNA的表达，比从间充质获得的其它细胞株中的高(图20)。因此，提示了ChM1L以腱细胞特异性表达。
实施例20MS-ChM1L对肿瘤血管发生的作用的研究<方法>通过从实施例14中所示的移植了B16F10细胞的小鼠摘出癌组织后，通过免疫染色检测血管内皮细胞，分析可溶性MS-ChM1L对肿瘤血管发生的作用。也就是，通过以下所示操作实施。从施用了vehicle和可溶性MS-ChM1L的小鼠中摘出癌组织，用4％多聚甲醛固定。通过常规方法用石蜡将其包埋后，制成切片。为了检测出血管内皮细胞，使用家兔抗-von Willebrand因子(vWF)Ab(CHEMICON制)、家兔抗小鼠CD34 mAb(Hycult Biotechnology制)抗作为一级抗体。用系列将切片脱蜡后，添加一级抗体、生物素标记二级抗体、过氧物酶标记的抗生蛋白链菌素。最后，加入3-氨基-9-乙基咔唑(ethylcarbazole)(AEC)(Nichirei制)，用苏木精进行复染，对典型的成像拍照。
此外，通过在显微镜下观察使用vWF Ab染色的切片，对癌细胞中的血管数进行定量。也就是，以低倍率观察切片，选择3个血管数最多的区域后，在高倍率下对所述区域的血管数计数。计算出计数的3个区域的平均值，数据表示为血管/hpf(高倍视野)。
<结果>在施用MS-ChM1L组中，vWF和CD34阳性肿瘤中的血管内皮细胞减少了(图21A、B)。因此，认为MS-ChM1L通过血管发生抑制作用，在体内抑制癌细胞的增殖。
实施例21由施用MS-ChM1L对Lewis肺癌(LLC)的增殖抑制作用的分析<方法>在C57BL6/J小鼠(雄性，6周大)的背部皮下以500000个/只移植LLC细胞(ATCC NO.CRL-1642)，3天后测定肿瘤大小进行分组。进行分组后，1天1次在癌细胞周围的皮下以50μl/位点施用人重组MS-ChM1L(3mg/mL)或vehicle(25mM HEPES，0.15M NaCl，ph8.3)。每天用测径器(caliper)测定癌细胞的大小(长度×宽度2×0.52)。以DNA合成(细胞对BrdU的吸收)为指标进行体外(in vitro)的LLC细胞的增殖分析。以3000个/孔的浓度在96孔板上培养细胞，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。将每个孔清洗后，各种浓度的MS-ChM1L存在下，用10％FBS刺激细胞24小时。在最后的3小时BrdU被吸收到细胞中。
<结果>MS-ChM1L在体内抑制LLC细胞的增殖(图22A)。另一方面，在体外不抑制LLC细胞的增殖(图22B)。因此，认为MS-ChM1L通过血管发生抑制作用抑制体内的LLC细胞的增殖。
实施例22胱天蛋白酶介导的血管内皮细胞的细胞凋亡诱导作用的分析<方法>已知胱天蛋白酶是在活性中心具有半胱氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶，其是细胞凋亡中关键的介质。用caspACE FITC-VAD-FMK原位标记(promega制)对胱天蛋白酶介导的血管内皮细胞的细胞凋亡诱导作用进行分析。已知caspACE FITC-VAD-FMK原位标记是细胞渗透性的FITC标记的胱天蛋白酶抑制剂VAD-FMK(FITC-VAD-FMK)，能够在细胞内外自由地移动，通过与活化的胱天蛋白酶不可逆地结合，留在凋亡细胞中。因此，通过流式细胞仪的分析可以观察到发生胱天蛋白酶介导的细胞凋亡的细胞的FlTC的荧光强度强。在6孔板上分别以的155000个/孔的浓度培养HUVEC、以100000个/孔的浓度培养MRC-5细胞(理化学研究所生物资源中心NO.RCD02111)，接着在无血清存在下培养24小时(37℃，CO2存在下)。将每个孔清洗后，25？g/mL MS-ChM1L存在下，以10ng/ml FGF-2刺激细胞。48小时后，以的10？M终浓度添加FITC-VAD-FMK，培养30分钟37℃，CO2存在下)。用胰蛋白酶-EDTA剥落细胞，通过流式细胞仪进行分析。
<结果>MS-ChM1L在HUVEC中诱导胱天蛋白酶介导的细胞凋亡。另一方面，在MRC-5细胞中没有观察到胱天蛋白酶介导的细胞凋亡(图23)。由此，认为MS-ChM1L具有血管内皮细胞特异性地诱导胱天蛋白酶介导的细胞凋亡的作用。
实施例23ChM--I蛋白质的大肠杆菌中的表达和纯化<方法>通过PCR方法扩增编码人ChM-I的N末端上融合了甲硫氨酸、6个残基的组氨酸(His标记)和FLAG标记的蛋白质的cDNA(序列号7)，克隆到pet载体(Novagen公司)中(pet-shChM-I)。用pet-shChM-I转化大肠杆菌OrigamiB(DE3)pLysS(Novagen公司)。在LB培养基中培养大肠杆菌过夜，将其一部分再培养约3小时后，以1mM的终浓度加入IPTG诱导重组蛋白质的表达后，再培养4小时。以5000×g离心培养液使大肠杆菌颗粒化，以6M胍、0.1MNaH2PO4，pH8.0的0.01M Tris盐酸缓冲液溶解后，通过离心分离除去不溶性级分，上nickel nitrillotriacetic琼脂糖(Qiagen)柱。用8M脲，0.1MNaH2PO4，pH8.0的0.01M Tris盐酸缓冲液清洗柱，再用慢慢增加咪唑浓度的缓冲液清洗后，用加入200mM咪唑的缓冲液洗脱重组蛋白质。将洗脱级分上PD-10柱(Amersham Pharmacia生物技术公司)，用25mMHEPES，0.15M NaCl，pH8.3的缓冲液交换。通过对采用Triton X-114的Aida等人的方法(Aida等人Journal of Immunological Methods(荷兰)1990年9月14日出版第132卷第2期p191-195)进行部分改变的以下所示的方法除去重组蛋白质溶液中的内毒素。在重组蛋白质溶液中以1％的最终浓度加入Triton X-114，在冰上温育30分钟、37℃下温育10分钟后，25℃下以2000×g离心10分钟，回收上清。在这种上清中以1％的最终浓度加入Triton X-114，再次重复上述操作。用1％脱氧胆酸钠清洗PD-10柱以除去柱内的内毒素后，置换为经PosidainFilter(Pole公司)除去内毒素的25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3后，将重组ChM-I蛋白质溶液上柱，除去残留的Triton X-114。用鲎试剂测定法(Biowhittacker公司)测定内毒素的浓度。标准地使用牛血清白蛋白(BSA)，以BCA蛋白质测试试剂(Pierce公司)测定蛋白质浓度。用15％凝胶对纯化的重组ChM-I蛋白质进行SDS-PAGE，用GelCodeBluestain试剂(Pierce公司)染色。
<结果>对纯化的重组ChM-I蛋白质实施SDS-PAGE后，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色的结果表示于图24中(泳道1非还原化(-2巯基乙醇)、泳道2还原化(+2巯基乙醇))。纯化的重组组ChM-I蛋白质的内毒素的浓度不到5EU/mL/mg蛋白质，生产率为10-20mg/L培养物。通过与上述的MS-ChM1L相同的方法，可以大量获得重组ChM-I蛋白质。
附图的简要说明图1表示的是通过western blot法检测可溶性多肽的结果。
图2表示的是对可溶性多肽的纯化过程的各级分实施SDS-PAGE，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色的结果(A)、ChM1L和ChM-I的切断点的比较(B)。
图3表示的是实施纯化的重组MS-ChM1L蛋白质的SDS-PAGE，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色的结果。
图4表示的是MS-ChM1L对于各种细胞的DNA合成抑制活性。
图5表示的是MS-ChM1L抑制HUVEC的毛细血管形成。
图6表示的是抑制HUVEC的迁移。
图7表示的是MS-ChM1L抑制HUVEC的对于玻璃粘连蛋白(vitronectin)的粘着。
图8表示的是HUVEC的细胞周期停止于G1期(A25mMHEPES，0.15M NaCl，pH8.3、B100μg/mL MS-ChM1L)。
图9表示的是MS-ChM1L对于HUVEC中的间质金属蛋白酶的mRNA的表达的影响。
图10表示的是MS-ChM1L抑制FGF-2诱导的肉芽肿形成发生模型中的体内血管发生抑制作用(A25mM HEPES，0.15M NaCl，pH8.3、B100μg/mL MS-ChM1L)。
图11表示的是MS-ChM1L和ChM--I抑制从M-CSF依赖性的巨噬细胞获得的破骨细胞的形成(AM-CSF 100ng/mL、BM-CSF 100ng/mL+RANKL 50ng/mL+Vehicle、CM-CSF 100ng/mL+RANKL 50ng/mL+MS-ChM1L 10μg/mL、DM-CSF 100ng/mL+RANKL 50ng/mL+MS-ChM1L100μg/mL、EM-CSF 100ng/mL+RANKL 50ng/mL+ChM-I 10μg/mL、FM-CSF 100ng/mL+RANKL 50ng/mL+ChM-I 25μg/mL)。
图12表示的是MS-ChM1L和ChM--I抑制由骨髓细胞形成破骨细胞(A1,25(OH)2D3(10-8M)+Vehicle、B1,25(OH)2D3(10-8M)+MS-ChM1L 10μg/mL、C1,25(OH)2D3(10-8M)+MS-ChM1L 100μg/mL、D1,25(OH)2D3(10-8M)+ChM-I 10μg/mL、E1,25(OH)2D3(10-8M)+ChM-I 25μg/mL)。
图13表示的是MS-ChM1L在破骨细胞前体细胞分化的初期直接作用抑制分化，这种抑制作用是不可逆的。
图14表示的是破骨细胞标记基因的表达分析的结果。
图15表示的是由施用MS-ChM1L引起的B16F10黑色素瘤的增殖抑制作用的分析的结果。表示通过施用MS-ChM1L在体内抑制B16F10黑色素瘤的增殖(A，C)。通过施用MS-ChM1L在体外不抑制B16F10黑色素瘤的增殖(B)。
图16表示的是MS-ChM1L抑制B16F10黑色素瘤的肺转移。
图17表示的是MS-ChM1L诱导血管内皮细胞的细胞凋亡。
图18表示的是腱组织中存在可溶性MS-ChM1L。
图19表示的是ChM1L mRNA在活组织中以腱特异性表达。
图20表示的是ChM1L mRNA在间充质细胞中以腱细胞特异性表达。
图21表示的是MS-ChM1L抑制肿瘤血管发生。
图22表示的是通过施用MS-ChM1L对LLC细胞的增殖抑制作用的分析结果。表示通过施用MS-ChM1L在体内抑制LLC的增殖，并且MS-ChM1L在体外不抑制LLC的增殖。
图23表示的是MS-ChM1L诱导胱天蛋白酶介导的血管内皮细胞中的细胞凋亡。
图24表示的是对纯化的重组ChM-I蛋白质实施SDS-PAGE后，用GelCode Bluestain试剂(Pierce公司)染色的结果。
序列表<110>Teijin Pharma Limited<120>新型的分泌蛋白质及其制备方法和用途<130>SAP-715-PCT<160>9<170>PatenyIn version 3.1<210>1<211>978<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(951)<223>
<400>1atg gca aag aat cct cca gag aat tgt gaa gac tgt cac att cta aat 48Met Ala Lys Asn Pro Pro Glu Asn Cys Glu Asp Cys His Ile Leu Asn1 510 15gca gaa gct ttt aaa aag aaa ata tgt aaa tca ctt aag att tgt 96Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Lys Ile Cys Lys Ser Leu Lys Ile Cys20 25 30gga ctg gtg ttt ggt act ctg gcc act cta att gtc ctg ttt tgg 144
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权利要求
1.包含序列号9所示的氨基酸序列的、或者与序列号9所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列的，并且具有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性的多肽。
2.根据权利要求1的多肽，其N末端和/或C末端还添加有氨基酸残基。
3.根据权利要求2的多肽，其N末端添加的氨基酸残基由甲硫氨酸起始的氨基酸序列构成。
4.根据权利要求2或3中所示的多肽，其N末端和/或C末端添加的氨基酸残基是由包含标记序列的氨基酸序列组成，所述标记序列由连续的6-8个组氨酸的标记序列和/或含FLAG标记序列构成。
5.根据权利要求2或3中所示的多肽，该N末端和/或C末端添加的氨基酸残基为来自水母的荧光蛋白质或其类似物，或者是分泌型碱性磷酸酶或其类似物的氨基酸序列构成。
6.根据权利要求1的多肽，其N末端和/或C末端添加的氨基酸残基含有经修饰氨基酸残基。
7.根据权利要求6的多肽，其N末端添加的氨基酸残基为谷氨酰胺或焦谷氨酰胺残基。
8.根据权利要求6的多肽，其特征在于所述经修饰氨基酸残基具有选自于乙酰基、甲酰基、生物素基、Boc基或Fmoc基中至少一种的修饰基团。
9.具有编码序列号9所示的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。
10.具有序列号3的第4-243位的核苷酸序列的核酸分子，或者在严格条件下与序列号3的第4-243位的核苷酸序列的互补序列杂交、且具有编码有抑制血管发生的活性和/或抑制骨吸收的活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
11.具有编码权利要求2-6任一项所示的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
12.含有权利要求9-11任一项所示的核酸分子的载体。
13.由权利要求12的载体转化的宿主细胞。
14.根据权利要求1-8任一项所示的多肽的制备方法，其特征在于该方法包括培养权利要求13的转化宿主细胞的步骤和回收生成的多肽的步骤。
15.根据权利要求14的多肽的制备方法，其特征在于在蛋白质变性剂存在下从转化宿主细胞中回收含有多肽的提取液。
16.根据权利要求14或15任一项所示的肽的制备方法，其包括用TritonX-114处理从宿主细胞中回收的提取液后，进行离心分离处理以除去热源的步骤。
17.根据权利要求14-16任一项所示的多肽的制备方法，其特征在于在从宿主细胞回收含有多肽的提取液后的所有步骤中，将含有该多肽的溶液的pH调整至8.0-8.5的范围内。
18.制备重组人ChM-I或重组人ChM1L的方法，其是采用可以表达人ChM-I或人ChM1L的重组宿主细胞制备重组人ChM-I或重组人ChM1L的方法，该方法包括在蛋白质变性剂存在下从重组的宿主细胞中回收含有重组人ChM-I或重组人ChM1L的提取液的步骤，以及用TritonX-114对该提取液处理后进行离心分离以除去热源的步骤。
19.根据权利要求18的制备方法，其特征在于在回收提取液的步骤之后的所有步骤中，将含有该多肽的溶液的pH调整至8.0-8.5的范围内。
20.含有权利要求1至权利要求8任一项所示的多肽的药物组合物。
21.根据权利要求20中所示的药物组合物，其是血管发生抑制剂和/或破骨细胞活化抑制剂。
22.根据权利要求21中所示的药物组合物，其是腱炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、恶性肿瘤、糖尿病性视网膜病、青光眼、牛皮癣、瘢痕疙瘩或动脉硬化症的治疗剂。
23.用于测定由体液成分中的序列号9或4所示氨基酸序列构成的多肽的诊断用组合物，其含有至少一种识别权利要求1或7任一项所示的多肽的抗体或其片段。
24.根据权利要求23所示的诊断用组合物，其用于腱炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、恶性肿瘤任一病症的诊断。
25.根据权利要求23所示的诊断用组合物，其用于糖尿病性视网膜病、青光眼、牛皮癣、瘢痕疙瘩、动脉硬化症任一病症的诊断。
26.经基因操作的转基因非人动物，其含有前述权利要求9-11任一项所示的核酸分子。
全文摘要
本发明提供了一种具有新型结构的具有抑制血管发生的活性或破骨细胞形成抑制活性的多肽，并且通过构建纯化该肽的方法提供重组蛋白质。此外，根据这些物质提供了有助于腱炎，类风湿性关节炎，骨关节炎，恶性肿瘤等疾病的治疗药物设计的成分。提供了新型的可溶性多肽蛋白质。
文档编号C12N1/21GK1871255SQ200480031060
公开日2006年11月29日 申请日期2004年10月21日 优先权日2003年10月21日
发明者山名庆, 中山保典, 高桥良昌, 落合锐士, 和田仁, 东由明 申请人:帝人制药株式会社