专利名称：采用土著pha合成菌回注法提高剩余活性污泥合成pha产率的制作方法
技术领域：
本发明属于生物法合成生物降解材料研究领域背景技术传统塑料在自然环境中不能被降解，造成严重的“白色污染”。因此世界各国都对生物降解材料的研制和开发给予高度重视。近年来通过化学合成法和微生物发酵法制备了许多新型生物降解材料。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是许多原核微生物在生长不平衡条件下，如氮或磷缺乏时，积累的胞内碳源或能源储藏物质，由于PHA在自然环境中能被完全降解成二氧化碳和水，并具有热塑性和生物相容性，已经成为研究的热点。但是，由于纯培养物发酵合成的PHA生产成本高，限制了其推广和应用。因此，迫切需要建立切实可行的降低PHA生产成本的方法。
1974年Wallen从活性污泥中分离得到PHA，为以后利用活性污泥合成PHA的研究奠定了基础。在污水生物处理尤其是厌氧—好氧活性污泥法中PHA是一种重要的中间产物，扮演着能量转化器的角色。在有氧阶段聚磷菌吸收废水中的磷，形成胞内多聚磷酸盐，同时有糖原形成，当环境中无氧时，聚磷菌以体内的多聚磷酸盐和糖原为能量，吸收环境中的有机物，并在胞内转化为PHA。在污水处理过程中，产生大量的剩余活性污泥，需要进行适当处理，否则会造成二次污染。利用剩余活性污泥经驯化，发酵制备生物降解材料PHA，既能解决剩余活性污泥资源化的问题，又能降低PHA合成成本。堪称一箭双雕。然而，利用剩余活性污泥合成PHA的产率不高，制约了该方法的推广应用。
发明内容
本发明的目的1是建立一种简单、经济、快速提高活性污泥合成PHA产率的方法------“规制”驯化方向再进行PHA发酵以提高活性污泥合成PHA产率的回注法。
本发明的目的2是提供一种结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作的活性污泥驯化装置。
本发明提出一种回注土著PHA合成菌提高活性污泥生产率的方法，包括以下步骤a)采用Nile-Red荧光染色法从实验所用活性污泥中分离得到一株或数株PHA合成菌，选择其中一株或几株高产PHA菌作为回注菌株；b)采用自行设计的活性污泥驯化装置，进行活性污泥驯化；c)土著高产PHA合成菌经扩大培养和离心收集菌体后，将一定量加入至含有活性污泥和驯化液的驯化反应桶中，进行驯化；d)整个驯化周期为10天，温度25℃，每个循环包括2小时厌氧，4小时好氧，1.5小时沉淀，0.5小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化液；e)驯化结束后，排净驯化液加入发酵培养基进行PHA发酵，温度30℃；f)发酵结束，收集污泥沉淀，干燥，采用氯仿抽提PHA，计算产率。
所述的活性污泥驯化装置，由空气泵(1)、补充驯化液恒流泵(2)、驯化反应桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、微电脑时控开关(5)、温度计(6)、恒温水浴搅拌装置(7)、进液孔(8)、出液孔(9)、排气孔(10)、进液桶(11)、排液桶(12)和排气指示杯(13)等部分组成。
所述的活性污泥驯化装置的特征在于微电脑时控开关(5)能控制恒温水浴搅拌装置(7)、补充驯化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空气泵(1)定时开关，使整个驯化装置成为一个整体，按照规定要求，自动完成厌氧、好氧和沉淀驯化过程。补充驯化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流泵(4)能控制驯化反应桶(3)中液体量恒定。驯化反应桶(3)由4mm厚的有机玻璃制成(Φ＝150mm，h＝400mm)，内置磁性转子。驯化反应桶(3)外加恒温水浴搅拌装置(7)，顶部有进液孔(8)、出液孔(9)和排气孔(10)。
回注菌是分离自实验所用活性污泥中的高产土著PHA合成菌。
本发明的主要优点是第一，在驯化初期回注少量高产土著PHA合成菌或菌群，能够“规制”驯化方向，促使污泥中PHA合成菌成为优势菌，大量繁殖，从而抑制非PHA合成菌生长，有效提高活性污泥合成PHA产率，降低PHA生产成本。第二，该装置能自动、准确的完成活性污泥好氧-厌氧-沉淀-排上清液和补新鲜培养基的各个步骤。具有结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作等特点。
下面结合附图和实例对本发明进一步说明。
图1.本专利申请的活性污泥驯化装置示意图1.空气泵、2.补充驯化液恒流泵、3.驯化反应桶、4.排出上清液恒流泵、5.微电脑时控开关、6.温度计、7.恒温水浴搅拌装置、8.进液孔、9.出液孔、10.排气孔、11.进液桶、12.排液桶和13.排气指示杯。
图2.单株高产土著PHA合成菌回注法与非回注法驯化过程中PHA合成菌数和总菌数的变化(回注菌分离自生活及少量工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)图3.单株高产土著PHA合成菌回注法与非回注法驯化过程中葡萄糖利用率的变化(回注菌分离自生活及少量工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)图4.混合高产土著PHA合成菌群回注法与非回注法驯化过程中PHA合成菌数和总菌数的变化(三株回注菌分离自生活及工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)图5.混合高产土著PHA合成菌群回注法与非回注法驯化过程中葡萄糖利用率的变化(三株回注菌分离自生活及工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)具体实施方式
实施例1采用回注单株高产土著PHA合成菌提高污泥(生活及少量工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)合成PHA产率。
1.试验仪器1.1生物反应桶本试验使用一个3升的自制反应桶作为生物反应桶，反应桶顶部有进液孔、出液孔、排气孔和温度计孔，内置磁力转子，生物反应桶置于具有磁力搅拌功能的恒温水浴装置内，以确保反应过程中温度恒定。
1.2供气系统本试验所使用的空气泵能准确地控制通入反应桶中的量为1.2L/min。
1.3排液和补液恒流泵恒流泵能匀速吸取液体，排液恒流泵在15分钟内将1L上清液排出，补液恒流泵在后15分钟内加入1L新鲜驯化液，保证反应器中活性污泥驯化需要的各种营养物质。
1.4微电脑时控开关通过定时开启和关闭控制供气系统、排液和补液恒流泵，使活性污泥驯化过程中厌氧、好氧和沉淀各个过程按要求进行，在整个驯化周期中自动完成各个驯化循环。
1.5旋转蒸发仪浓缩PHA抽提液(氯仿)至5-10mL。
1.6酸度计测定驯化液和每个循环流出液pH值。
2.程序2.1驯化液的配制C6H12O60.150～0.300g/L，MgSO40.050～0.100g/L，(NH4)2SO40.010～0.100g/L，CaCl20.010～0.020g/L，KCl 0.050～0.100g/L，K2HPO40.050～0.100g/L，蛋白胨0.100～0.200g/L，酵母0.010～0.100g/L，pH 7.02.2发酵液配制C6H12O65～10g/L，MgSO40.100～0.500/LL，CaCl20.010～0.050g/L微量元素1mL/L(成分见表1)，pH 7.0表1微量元素成分表
2.3PHA合成菌分离和计数培养基的配制牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 3～7g/L，葡萄糖15～25g/L，琼脂粉1.5～2.5g/100mL，尼尔红(Nile red)0.1～0.3mL/100mL，pH 7.02.4总菌数计数培养基的配制牛肉膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，NaCl 3～7g/L，琼脂粉1.5～2.5g/100mL，pH 7.02.5采用Nile-Red法分离高产土著PHA合成菌将污泥按比例稀释为10-1～10-7，10-3～10-7每个稀释度取0.1mL涂布PHA合成菌平板，培养4-5天后在312nm紫外灯下观察，发桔黄色荧光的菌落即为PHA合成菌，保存PHA合成菌，并进行发酵合成PHA实验，筛选到高产PHA菌株，用于活性污泥回注法。
2.6高产土著PHA合成菌的鉴定筛选所得的一株PHA高产菌株经BIOLOG-System系统鉴定为Pseudomonas bathycetes。
2.7接种a.对照组活性污泥经9000rpm离心15min，收集沉淀部分，取湿重75.00g加入3L反应器中。
b.试验组活性污泥经9000rpm离心15min，收集沉淀部分，取湿重75.00g加入3L反应器中。高产土著PHA合成菌培养液经9000rpm离心，取0.1g～0.25g湿菌体加入至3L反应器中。
2.8活性污泥驯化对照组和试验组驯化方式相同2小时厌氧，4小时好氧，1.5小时沉淀，0.5小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化培养基，每个驯化循环8小时，每天实施3个循环，整个驯化周期为10天。
2.9驯化过程中的参数分析a.驯化液中总菌数计数方法每间隔48小时取驯化液1mL(好氧期末)，第一次取样在驯化46小时实施。采用倾注平皿法计数总菌数取10支无菌试管，每管加入9mL无菌生理盐水，吸取1mL驯化液加入到试管1中，混匀，样品稀释倍数即为101，从试管1中取1mL加入至试管2中，样品稀释倍数即为102，以此类推，稀释至108。取103到108各稀释度0.5mL，加至无菌平板中。同时，倒入熔化的计数琼脂培养基(45～50℃)，混匀，30℃培养，24～48小时后计数菌落数，计算总菌数。
b.驯化液中PHA合成菌数计数方法取样方法同上述a。采用Nile-Red荧光染色法计数PHA合成菌数。取10支无菌试管，每管加入9mL无菌生理盐水，吸取1mL驯化液加入到试管1中，混匀，样品稀释倍数即为101，从试管1中取1mL加入到试管2中，样品稀释倍数即为102，以此类推，稀释至108。取103到108各个稀释度0.5mL，加至无菌平板中，同时，倒入熔化的PHA合成菌计数培养基(45～50℃)，混匀，30℃培养，4-5天后，在312nm下计数发桔黄色荧光的菌落数目，计算PHA合成菌数。
c.葡萄糖利用率每间隔48小时取排出驯化液1mL，第一次取样在47.5小时左右实施。采用葡萄糖试剂盒[国食药监械(准)字，2004第3400196号]进行测定。配制一定体积的工作液[R1(葡萄糖氧化酶加过氧化氢酶)与R2(磷酸缓冲液)以9比1的比例混合]。分别给空白对照管，标准样品管和样品测定管中加入3mL工作液。再依次加入20μL蒸馏水，20μL葡萄糖标准品(浓度为5.55×10-3moL/L)和20μL待测样品。于37℃放置15分钟，505nm比色，得到A标准和A样品。
样品中葡萄糖量＝(A样品/A标准)×标准浓度×体积×葡萄糖分子量葡萄糖利用率＝[(初始葡萄糖量-样品中葡萄糖量)/初始葡萄糖量]×100％2.10驯化后污泥合成PHA排净驯化液，加入发酵培养基，好氧发酵48小时。
2.11PHA提取发酵结束，离心收集污泥沉淀，干燥至恒重。氯仿抽提，抽提液经旋转蒸发仪浓缩至5-10mL，40-80倍冷甲醇中沉淀析出PHA。
2.12对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，PHA合成菌数与总菌数的变化情况见图2。对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，葡萄糖利用率变化情况见图3所示。
3.实施例1结果通过计算PHA产率[产率＝(PHA干重/污泥干重)×100％]，回注法比非回注法合成PHA产率提高了51.91％。结果说明，回注单株高产土著PHA合成菌的方法能够有效提高活性污泥合成PHA的产率。
实施例2采用回注混合高产土著PHA合成菌群提高污泥(生活及工业废水污水处理厂好氧池活性污泥)合成PHA产率。
1.试验仪器同实施例12.程序2.1驯化液的配制同实施例12.2发酵液配制同实施例12.3PHA合成菌分离和计数培养基配制同实施例12.4总菌数计数培养基配制同实施例12.5采用Nile-Red法分离得到三株高产土著PHA合成菌方法同实施例12.6高产土著PHA合成菌的鉴定分离所得的三株高产土著PHA合成菌未进行分类鉴定；2.7接种a.对照组同实施例1b.回注组活性污泥的收集，加入量与实施例1同。三株高产土著PHA合成菌分别经9000rpm离心，各取0.033g～0.083g湿菌体加入至3L反应器中。
2.8活性污泥驯化同实施例12.9驯化过程中的参数分析方法同实施例12.10驯化后污泥合成PHA同实施例12.11PHA提取同实施例12.12对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，PHA合成菌数与总菌数的变化情况见图4。对照组(非回注法)和试验组(回注法)驯化过程中，葡萄糖利用率变化情况见图5所示。
3.实施例2结果通过计算PHA产率[产率＝(PHA重量/污泥干重)×100％]，回注法比非回注法合成PHA产率提高了39.45％。结果说明，回注混合高产土著PHA合成菌的方法能有效提高活性污泥合成PHA的产率。
权利要求
1.一种回注土著PHA合成菌提高活性污泥生产率的方法，包括以下步骤a)采用Nile-Red荧光染色法从实验所用活性污泥中分离得到一株或数株PHA合成菌，选择其中一株或几株土著高产PHA合成菌作为回注菌株；b)采用自行设计的活性污泥驯化装置，进行活性污泥驯化；c)土著高产PHA合成菌经扩大培养和离心收集菌体后，将一定量加入至含有活性污泥和驯化液的驯化反应桶中，进行驯化；d)整个驯化周期为10天，温度25℃，每个循环包括2小时厌氧，4小时好氧，1.5小时沉淀，0.5小时排出1升上清液和加入1升新鲜驯化液；e)驯化结束后，排净驯化液加入发酵培养基进行PHA发酵，温度30℃；f)发酵结束，收集污泥沉淀，干燥，采用氯仿抽提PHA，计算产率。
2.权力要求1所述的在活性污泥驯化开始前，向驯化体系中加入少量土著高产PHA合成菌”规制”驯化方向，继而进行PHA发酵以提高活性污泥合成PHA产率的回注法。
3.权利要求1所述的活性污泥驯化的装置，由空气泵(1)、补充驯化液恒流泵(2)、驯化反应桶(3)、排出上清液恒流泵(4)、微电脑时控开关(5)、温度计(6)和恒温水浴搅拌装置(7)、进液孔(8)、出液孔(9)、排气孔(10)、进液桶(11)、排液桶(12)和排气指示杯(13)等部分组成。
4.如权利要求2所述的活性污泥驯化装置的特征在于微电脑时控开关(5)能控制恒温水浴搅拌装置(7)、补充驯化液恒流泵(2)、排出上清液的恒流泵(4)和空气泵(1)定时开关，使整个驯化装置成为一个整体，按照规定要求，自动完成厌氧、好氧和沉淀驯化过程。补充驯化液的恒流泵(2)和排出上清液的恒流泵(4)能控制驯化反应桶(3)中液体量恒定。驯化反应桶(3)由4mm厚的有机玻璃制成(Φ＝150mm，h＝400mm)，内置磁性转子。驯化反应桶(3)外加恒温水浴搅拌装置(7)，顶部有进液孔(8)、出液孔(9)和排气孔(10)。
5.权力要求2所述的单株回注菌和混合回注菌群是分离自实验所用活性污泥中高产土著PHA合成菌。
全文摘要
本发明采用回注少量土著PHA高产合成菌，“规制”驯化初期活性污泥的驯化方向，促使活性污泥中PHA合成菌成为优势菌群，提高活性污泥合成PHA产率。本发明的目的是建立一种简单、经济、快速提高活性污泥合成PHA产率的方法－－土著PHA高产合成菌回注法；提供一种结构简单、自动化程度较高、造价低廉、易操作的活性污泥驯化装置。其操作步骤如下采用Nile－Red荧光染色法从试验所用活性污泥中分离得到PHA合成菌，筛选PHA高产菌作为回注用菌；将0.1－0.25g的回注菌(单株)或回注菌群(数株)接种于活性污泥驯化初期的反应桶中，完成驯化周期；排净驯化液，加入发酵培养基和微量元素液进行PHA发酵，发酵结束收集污泥沉淀，干燥，使用氯仿抽提PHA；抽提液经浓缩于冷甲醇中沉淀析出PHA。该方法能够有效地提高活性污泥合成PHA的产率三成至五成。摘要附图是本发明的活性污泥驯化装置。
文档编号C12P7/64GK1786147SQ20051001548
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者宋存江, 曾猛, 陶剑, 郑承刚, 金映虹, 邓飞, 王淑芳, 孙亚民 申请人:南开大学