专利名称：制备重组抑酶肽的方法
技术领域：
本发明涉及抑酶肽，具体地说，本发明涉及在甲基营养酵母中生产抑酶肽的方法，特别是使用白蛋白信号肽，以DNA重组技术在巴斯德毕赤酵母中生产具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽的方法。
背景技术：
抑酶肽又称为“牛胰蛋白酶抑制剂”(BPTI)，属于Kunitz-型抑制剂家族成员，具有抑制丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶的基本生物学活性(W.Gebhard，H.Tschesche and H.Fritz，ProteinaseInhibitors，Barrett and Salvesen(eds.)，Elsevier Science Publ.BV 375-387，1986；Tschesche et al.，U.S.Pat.No.4,595,674)。
抑酶肽是由58个氨基酸残基组成的碱性蛋白。长期以来，抑酶肽主要被用于治疗急性胰腺炎，90年代以后，开始在外科手术特别是胸外科手术中使用，用于保护血小板，减少出血和渗血，用于治疗有凝血障碍的患者(Bistrup et al.，Lancet 1，366-367，1988)。目前市售的抑酶肽主要是由牛肺或胰等器官中提取的，所使用的工艺复杂而且产品纯度不高。
酵母生物体可产生许多细胞内合成的并在细胞外发挥功能的蛋白质，这样的细胞外蛋白质通常被称为分泌蛋白质。为确保表达产物通过内质网膜，这些分泌蛋白质最初是以序列前体(前序列)或前蛋白的形式存在的。前序列，即信号肽一般是在转位期间从所需产物上被裂解掉。信号肽可以是所需蛋白质自身的信号肽、异源信号肽或杂合信号肽。使用异源信号肽常常遇到的一个问题是异源信号肽并不能保证有效地转位和被裂解。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统是近年来发展很快的一个真核表达系统，现已被普遍用于表达许多有活性的蛋白质。毕赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时，能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长。由于毕赤酵母表达系统是真核表达系统，所以可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰，并且具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌、以及表达效率高、表达产物易于纯化等优点。
已有人在大肠杆菌和在酵母中表达了重组抑酶肽或其类似物或变异体(例如参见(Auerswald et at.，Biol.Chem.Hoppe Seyler 369，27-35，1988；以及欧洲专利0419878、美国专利4,894,436、5,164,482、5,258,302、5,618,915、5,707,831、5,770,568和6,482,798)。然而，现有技术使用酵母系统表达抑酶肽的实践中，表达载体中连接到抑酶肽N末端的信号肽序列几乎都是α-交配因子信号序列。通常情况下，如此产生的前原-α因子/抑酶肽融合蛋白的加工需要两种不同的蛋白水解酶。即第一种蛋白酶首先在融合蛋白的19-20位氨基酸之间进行切割，然后再由特异性识别碱性氨基酸对(Lys-Arg)的蛋白内切酶(Kerx2蛋白酶)切割，从而导致抑酶肽的释放和分泌(A.J.Brake，Methods in Enzymology185，408-421，1990；Das et at.，Biotechn.Progress 3，43-48，1987)。然而，就重组抑酶肽和其变异体而言，Kex2蛋白酶并不能切割具有天然N末端序列“Arg-Pro-Asp”的抑酶肽，以致几乎不能表达一种被均匀、正确地加工和分泌抑酶肽。另外，试图改变抑酶肽的N末端序列以实现酵母系统中表达产物的正确加工也是不实际的，因为对抑酶肽的任何修饰都将会引发有害的免疫反应。
α-交配因子的信号肽部分已被广泛用于啤酒酵母中合成和分泌异源蛋白质(参见欧洲专利申请Nos.0116201A，0123294A，0123544A，0163529A和0123289A)。α-交配因子信号序列在酵母系统中的加工过程是首先在Kex2蛋白酶的作用下完成信号肽的初次切割(在序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala中的Arg和Glu之间)；然后，在STE13基因编码蛋白的作用下，Glu-Ala重复序列再次被切割。可见，α-交配因子信号肽的切割特点在于须切掉两个碱性氨基酸下游的非碱性氨基酸。由于抑酶肽的N端第一个氨基酸为碱性氨基酸(Arg)，所以α-交配因子信号肽无法对抑酶肽进行正确的切割。
因而，使用酵母表达有天然N末端序列的抑酶肽时，表达产物的分泌水平往往很低甚至完全不分泌或蛋白水解加工不正确。推测出现这些情况的部分原因是由于存在于信号肽C末端和抑酶肽N末端之间的加工位点没有得到充分暴露，以至不能与蛋白水解酶活性中心充分接近所致。
本发明人在既往长期从事毕赤酵母和人血清白蛋白研究的基础上，使用已有的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统，并利用加入了适当酶切位点的白蛋白信号/前导肽代替常规方法中使用的来自啤酒酵母的α-交配因子信号前导序列，构建了本发明的新的重组载体，并成功地分泌表达了被正确加工的抑酶肽蛋白质，从而完成了本发明。
发明目的本发明的一个目的是提供一种使用巴斯德毕赤酵母系统分泌表达重组抑酶肽的方法，该方法包括培养包含可复制表达载体的巴斯德毕赤酵母菌株，所说的表达载体携带抑酶肽基因和允许在适当的营养培养基中表达抑酶肽的DNA序列，然后从培养物上清中回收和纯化所需的抑酶肽，特征在于所说的载体中，直接连接在抑酶肽基因上游的前导或信号序列是白蛋白信号序列。
根据本发明的一个优选实施方案，特征在于所说的抑酶肽是具有正确的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
根据本发明的一个优选实施方案，特征在于所说的白蛋白信号序列的正链和负链分别具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供由按照上述方法表达的具有天然N末端氨基酸序列的抑酶肽和适当的载体或赋形剂的药物组合物。
发明内容
本发明涉及抑酶肽，具体地说，本发明涉及在甲基营养酵母中生产抑酶肽的方法，特别是使用白蛋白信号肽，以DNA重组技术在巴斯德毕赤酵母中生产具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽的方法。
本发明的一个目的是提供一种使用巴斯德毕赤酵母系统分泌表达重组抑酶肽的方法，该方法包括培养包含可复制表达载体的巴斯德毕赤酵母菌株，所说的载体携带编码抑酶肽的基因和允许在适当的营养培养基中表达抑酶肽的DNA序列，然后从培养物上清中回收和纯化所需的抑酶肽，特征在于所说的载体中，直接连接在抑酶肽基因上游的前导或信号序列是白蛋白信号序列。
根据本发明的一个优选实施方案，特征在于所说的抑酶肽是具有正确的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
根据本发明的一个优选实施方案，特征在于所说的白蛋白信号序列正链和负链分别具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
通过DNA重组技术在酵母细胞内表达产生的蛋白质只有被分泌到细胞外才能发挥其功能，这些在细胞内表达的分泌蛋白以含有前序列(信号肽)的前体形式存在，从而有效地指导被表达的产物通过内质网膜，而前序列(信号肽)则通常的产物转位期间被裂解掉。进入分泌途径的蛋白质被运输到高尔基氏器，并进而被分泌到细胞外培养基中(Pfeffer，S.R.and Rothman，J.E.Ann.Rev.Biochem.56，829-852，1987)。
可以使用几种方法在酵母中表达和分泌各种异源蛋白质。一般说来，可以按照常规方法构建携带编码所需蛋白质和信号肽的DNA，然后用该构建体转化酵母宿主细胞并制备被转化细胞的培养物，在适当的营养培养基中培养所说的酵母细胞培养物并从培养物上清中回收和纯化所需的蛋白质。
作为构建表达载体的必要元件，用于促进所需蛋白质分泌表达的信号或前导序列可以是所需蛋白质自身的信号肽、异源信号肽或固有与异源信号肽的杂合体。
使用酵母异源信号肽时所遇到的一个主要问题是，异源信号肽往往不能确保产物的有效转位和裂解。如前所述，在使用啤酒酵母α-交配因子信号肽制备重组抑酶肽情况下，几乎不可能制得被正确加工和分泌的具有天然N末端序列的抑酶肽蛋白质产物。为此，本发明人在利用毕赤酵母酵母系统表达抑酶肽的实践中，以白蛋白信号序列替代酵母载体本身的α-交配因子信号序列，并利用预先引入的适当酶切位点将该信号序列连接到具有正确N末端序列的抑酶肽基因的上游。结果令人惊奇地发现，使用如此构建的重组载体转化巴斯德毕赤酵母细胞后，成功地以高产率得到了被正确切割、加工和分泌的抑酶肽。
本文中所使用的术语“信号肽”是指作为酵母细胞中表达的细胞外蛋白质前体形式的N末端序列存在亲水前序列。信号肽是能够使所表达的蛋白质被分泌到内质网中，并使信号肽在此过程中被裂解掉。
人或哺乳动物血浆白蛋白基因位于第4号染色体上，其初级翻译产物为前白蛋白原。在分泌过程中切除信号肽，生成白蛋白原。继而在高尔基氏体经弗林蛋白酶(Furin)切除N末端的一个6肽片段(精-甘-缬-苯丙-精-精)，变成成熟的白蛋白。
白蛋白的运输途径是从粗面内质网通过滑面内质网到高尔基复合体，然后通过中间膜囊进入高尔基体，最后通过胞吐作用被分泌至胞外。新合成的白蛋白首先在内质网被切割形成前白蛋白，即以氨基端的六个氨基酸残基序列(在大多数哺乳动物中，序列是Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)命名的没有活性的蛋白前体。
前体白蛋白被酶解转变成成熟的蛋白分子是在分泌小泡中进行的。在弗林蛋白酶(furin)的作用下，前白蛋白在高尔基体或膜泡中被加工成成熟白蛋白，最后被运送到细胞外。
当利用此白蛋白信号肽表达其自身白蛋白时，首先在切点P1处切割前蛋白。产物进入血循环后，融合体前蛋白在切点P2处被蛋白内切酶切割，从而产生成熟的白蛋白(参见附图1A)。由于切点P1处的第一个氨基酸是精氨酸(Arg)，而抑酶肽的N端第一个氨基酸也是Arg，所以抑酶肽基因序列可直接连接在白蛋白信号肽切点P1的下游(参见附图1B)，从而得以确保表达产物的正确切割。由于切割点P2处的原有序列已被抑酶肽序列取代，所以在产物被分泌入血后即不可能再进行第二次切割。由此保证了具有正确N末端抑酶肽的正确切割和分泌。
在酵母系统中表达抑酶肽时，通常是将酵母分泌蛋白的信号序列例如α-交配因子的信号序列连接到抑酶肽的N末端，用以引导抑酶肽的表达。前原-α因子/抑酶肽融合蛋白的加工需要两种不同的蛋白水解酶。定位于内质网膜上的信号肽首先在融合蛋白的19-20位氨基酸之间被切割掉(由此产生的前-α因子/抑酶肽已在原位被糖基化)。然后再被能够特异性地识别二碱性氨基酸的蛋白内切酶(为一种Kex2蛋白酶)切割，从而导致抑酶肽的释放和分泌(A.J.Brake，Methods in Enzymology 185，408-421，1990；Das et at.，Biotechn.Progress 3，43-48，1987)。
然而，在通常情况下，由于Kex2蛋白酶不能切割具有天然N末端序列“Arg-Pro-Asp”的抑酶肽，因此很难得到被均匀地、正确地加工和分泌的抑酶肽。
为了解决这个难题，我们在使用在酵母系统表达抑酶肽时，利用白蛋白信号序列引导切割碱性氨基酸的特征，用该信号序列替代α-交配因子的信号序列，并将具有天然N末端序列的抑酶肽连接到白蛋白信号肽的下游，从而成功地分泌表达了具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽。
本发明中使用的白蛋白信号肽具有下示氨基酸序列MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAlaTyrSer(P1)ArgGlyValPheArgArg(P2)AspAlaHisLysSer。其相应的核苷酸序列是5′-ATG AAG TGG GTAACC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC TCG GCT TAT TCC(P1)AGGGGT GTG TTT CGT CGA(P2)GAT GCA CAC AAG AGT-3′。为本发明的目的，我们对该信号肽进行了必要的修饰，即在白蛋白信号肽正链和负链编码序列的5’和3’端分别加入了有利于继后序列连接的BstB I和Xho I酶切位点，得到如下所示的的白蛋白信号肽编码序列5’--CGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTAC-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位点以下划线标示)(SEQ ID NO1)；5’-TCGAGTAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAGAAGGGAAATAAAGGTTACCCACTTCATCGTTT-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位点以下划线标示)(SEQ ID NO2)在内质网中被切割(切点为P1)后的前白蛋白第一个氨基酸为精氨酸(Arg)，而天然抑酶肽的N端第一个氨基酸也为精氨酸，所以我们可以用白蛋白信号肽来引导具有正确N末端的抑酶肽的表达。将抑酶肽基因连接到白蛋白信号肽序列的下游，同样在信号肽酶的作用下，在内质网进行第一步切割。当分泌蛋白到达高尔基体或膜泡时，由于在白蛋白信号肽C端没有了识别序列Arg-Arg，致使弗林蛋白酶(Furin)无法再进行第二次切割，从而保证了具有正确N末端序列的抑酶肽被分泌至细胞外。另外，考虑到在白蛋白信号肽下游连入抑酶肽，所以我们在确保不改变信号肽下游氨基酸序列的情况下，设计并加入了一个有利于下一步基因操作的Xho I位点(CTCGAG)。
本发明方法中所使用的质粒pPICZaC购自Invitrogen公司；T载体和核酸内切酶均购自TakaRa公司。
本发明所涉及的核酸序列和用于实现本发明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体均可从各种来源中分离得到并可经受遗传操作、扩增，和/或被重组表达。
另外，也可以使用已知的化学合成技术体外合成这些(单链)核酸(例如参见Adams，J.Am.Chem.Soc.105661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444，1997；Blommers，Biochemistry 337886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.6890，1997)。然后再合成其互补链并在适当条件下将它们一起退火。或者使用DNA聚合酶，将互补链与适当的引物序列加合，以得到所需的双链DNA片段。
核酸操作技术，例如亚克隆、探针标记、测序、杂交等在科学文献和专利文献都已有充分描述(如参见Sambrook，ed.Molecular CloningA LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；Current ProtocolsIn Molecular Biology，Ausubel，ed.John wiley&Sons，Inc.，New York(1997))。
可以使用许多已知的方法完成核酸、载体、多肽和蛋白质等的定性和定量分析，例如这些方法包括分光光度法、放射显影法、电泳、高效液相层析(HPLC)、免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号扩增技术等。
我们的实验结果表明，由于用白蛋白信号序列替代通常使用α-交配因子的信号序列引导目的蛋白质的表达，不仅使修饰或突变的抑酶肽在巴斯德毕氏酵母中表达成为可能，而且能够在毕氏酵母系统以高产率表达具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽。检测结果显示，使用本发明方法表达的天然抑酶肽的产率高达约900mg/L。
已报道了抑酶肽在大肠杆菌系统中的表达，然而，由于抑酶肽含有三对二硫键，体外复性时很容易发生二硫键的错配，所以在大肠杆菌中，抑酶肽难以完整复姓的活性形式被表达，且在分泌表达体系中的产量亦普遍较低(10mg/L)。另外，抑酶肽在酿酒酵母系统中分泌表达亦有报道，但如前所述，由于α-交配因子信号肽切割酶(Kex2)不能切割N末端序列“精氨酸-脯氨酸-天冬氨酸”，因此该表达体系分泌表达抑酶肽的产量同样是很低的。与上述现有技术不同，本发明利用毕氏酵母系统，利用白蛋白信号肽的前导信号肽来引导抑酶肽的表达与分泌，结果成功地分泌型表达并得到了具有正确N末端氨基酸序列的重组抑酶肽，不仅产物的产量比其它任何表达体系都高，而且表达产物也更易于纯化。
作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，抑酶肽的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，例如用于治疗急性胰腺炎、创伤出血性休克、抑制纤溶酶活性、保护血小板，减少出血和渗血等(J.McMichanet al.，Circulatory Shock 9，107，1982；L.M.Auer et al.，Acta Neurochir.49，207，1979)。另外，抑酶肽也可用于治疗各种原因导致的病理性肝组织损伤(参见03135997.3号中国专利申请)。
本发明涉及的抑酶肽可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域已知的方法(参见Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.，1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的抑酶肽与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。
根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。
适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。
具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。
可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。
可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备可注射剂。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的天然或重组产生的抑酶肽或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。在用于治疗肝组织损伤(例如急性或亚急性肝坏死、急性病毒性肝炎、活动期慢性病毒性肝炎、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性肝损伤和肝衰竭等)的情况下，这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、功能性肝细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。
一般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为1-80单位/kg/天，最好为5-60单位/kg/天；腹腔内或肌肉内注射给药剂量为0.05-100单位/kg/天，较好为0.1-80单位/kg/天，最好为0.5-50单位/kg/天；静脉内注射给药剂量为0.1-100单位/kg/天，较好为0.5-80单位/kg/天，最好为1-50单位/kg/天。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
图1A显示白蛋白的信号肽序列与白蛋白的切割方式；图1B显示白蛋白的信号肽序列与抑酶肽的连接方式。
图2显示用于表达抑酶肽分泌蛋白质的重组表达质粒pPICZC-HSAsp-BPTI的构建。
图3显示连接了白蛋白信号肽编码序列的重组质粒的1％琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1是用BstB I和Xho I酶切后再与白蛋白信号肽编码序列连接的质粒(pPICZC-HSAsp)；泳道2是DNA分子量标志物。泳道3是用BstB I和Xho I酶切但未连接白蛋白信号肽编码序列的原始质粒。
图4显示抑酶肽基因序列的1％琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1是编码抑酶肽的DNA序列；泳道2是DNA分子量标志物。
图5显示附加有酶切位点的抑酶肽基因序列的1％琼脂糖电泳图谱。其中泳道1是编码抑酶肽的DNA序列；泳道2是DNA分子量标志物。
图6显示分泌表达的抑酶肽产物的SDS-PAGE分析。其中泳道1是浓缩的培养物上清部分；泳道2是经过阳离子交换层析的纯化产物；泳道3是抑酶肽标准品。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1重组质粒pPICZC-HSAsp-BPTI的构建本实施例举例描述用于表达本发明抑酶肽的重组表达质粒pPICZC-HSAsp-BPTI的构建策略和基本方法(参见附图2)。
首先，合成两条(正链和负链)如下所示的，5’和3’端都包括BstB I和XhoI酶切位点的白蛋白信号肽编码序列5’--CGAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTAC-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位点以下划线标示)(SEQ IDNO1)5’-TCGAGTAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAGAAGGGAAATAAAGGTTACCCACTTCATCGTTT-3’(其中的BstBI和XhoI酶切位点以下划线标示)(SEQ ID NO2)。
两条单核苷酸链经体外退火后，得到两末端分别带有BstB I和Xho I酶切位点的白蛋白信号肽双股核苷酸编码序列。经1％琼脂糖凝胶电泳回收后，在T4 DNA连接酶存在下将此片段连接到预先用BstB I和Xho I内切酶切割的质粒pPICZaC(Invitrogen)中，得到含有白蛋白信号肽(HSAsp)的载体pPICZC-HSAsp，即加入了白蛋白信号肽的重组质粒。BstB I和Xho I酶切鉴定结果显示，去掉原有的α-交配因子并连接了信号肽序列后的酶切片段长度约为60bp，而未在相应位点进行信号肽序列置换的片段长度则为大约300bp(参见附图3)。
其次，使用适当的引物以聚合酶链反应(PCR)方法从黄牛肺总DNA扩增得到含抑酶肽全基因序列的DNA片段。PCR反应的两条引物分别为P15’--CTGTGATGACCTTCCCTCTTTAACCG-3’(SEQ ID NO3)P25’-TTCTGAGCGCCACCACTTTCCCTA-3’(SEQ ID NO4)。
(1)PCR反应194℃变性4分钟。(2)PCR反应2，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，28个循环。(3)PCR反应394℃变性45秒，72℃延伸2分钟。PCR扩增产物的长度为300bp(参见附图4)。然后，将其连接到T载体(TakaRa)中，得到质粒T-BPTI。
然后，使用合成的寡核苷酸引物P15’-CAAAGCCTCGAGACCTGACTTCTGCCTA-3’(含有XhoI酶切位点)(SEQ ID NO5)；P25’-GGTTCTAGAGCCCTTAAGCACC-3’(含有XbaI酶切位点)(SEQ ID NO6)以T-BPTI为模板PCR扩增得到编码BPTI、长度约203bp的DNA片段。
(1)PCR反应194℃变性4分钟。(2)PCR反应2，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，28个循环。(3)PCR反应394℃变性45秒，72℃延伸2分钟。经29个循环得到扩增产物BPTI编码序列。(参见附图4)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收后，用核酸内切酶XhoI和XbaI双酶切，并在T4 DNA连接酶存在下将此片段连接到已用同样内切酶消化的质粒pPICZC-HSAsp中，从而得到重组表达质粒pPICZC-HSAsp-BPTI。用美国Beckman公司测序仪CEQ2000测序，结果表明，白蛋白信号肽和BPTI均具有和已知相同的核苷酸编码序列。
实施例2重组抑酶肽的表达及发酵生产本实施列举描述本发明的抑酶肽蛋白质在毕氏酵母宿主细胞中的诱导表达及其菌体的高密度发酵。
用限制性内切酶PmeI消化实施例1中制得的重组质粒pPICZC-HSAsp-BPTI后，用所得到的消化产物转化生长于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，100mM磷酸钾缓冲液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)中的毕氏酵母菌株X-33(Invitrogen)，并按常规方法30℃培养被转化的酵母宿主细胞。然后，挑取并培养阳性单克隆菌落。当OD600nm达到2～6时，冻存部分菌种，将BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，100mM磷酸钾缓冲液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)更换成BMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.5％甲醇，100mM磷酸钾缓冲液PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)诱导表达。诱导过程中每隔24小时取样，以SDS-PAGE电泳法监测蛋白质表达产物。SDS-PAGE分析显示，表达产物中存在一条分子量约6KDa的条带(参见附图5)。在表达期间，利用已知的胰蛋白酶抑制实验定量分析表达产物的生物学活性(参见Cara B，Marks V，Peter N，et al，[J].JBC，1986，261(16)7115-7118)。
然后，于28℃，以30L规模发酵培养阳性菌株。为此，配制30L FM21基本盐培养基(H3PO43.5ml/L，CaSO4·2H2O 0.15g/L，K2SO42.4g/L，MgSO4·7H2O1.95g/L，KOH 0.65g/L)，121℃高压灭菌30分钟，待温度下降至30℃左右时加入混合的微量元素(PTM1)和生物素，并将菌体接种于80升发酵罐(New Brunswick scientific)中，进行常规的高密度发酵。发酵条件是温度28-30℃；搅拌器旋转速率600转/分(rpm)；pH3.30(用NH4OH和/或H3PO4校正)。
通过对搅拌速率、罐内压力、通气量等条件的控制，使培养物中溶氧量保持在20％以上，并使其他参数维持在稳定状态。
诱导开始后，于不同时间取样，称取菌体的湿重或干重，并留取上清进行产物活性和SDS-PAGE电泳分析，从而来确定蛋白质产物随时间延长的累计效应。发酵约持续30小时。发酵结束时菌体湿重约为300g/L，重组抑酶肽的浓度约为900mg/L。
实施例3重组抑酶肽的纯化培养完成后，利用标准的离心技术将酵母细胞与培养液分离，弃去酵母菌体后，收集上清。上清内添加约1/10体积的200mM NaAc-HAc PH4.0缓冲液，使其终浓度达到约20mM。经预先用20mM NaAc-HAc(pH4.0)平衡的Sepharose SP FF阳离子交换层析柱层析分离，并依次用溶液A(20mMNaAc-HAc PH4.0)和溶液B(2M Nacl，20mM NaAc-HAc PH4.0)进行洗脱。洗脱后，收集各组分峰进行SDS-PAGE和抑酶肽活性分析。
经Sepharose SP FF阳离子交换层析分离的抑酶肽粗品再经SoureceTM30RPC反相疏水层析进一步纯化。含抑酶肽活性的样品加入1/10体积1％TFA后加入用起始缓冲液A(0.1％TFA)平衡SoureceTM30RPC反相疏水层析柱，用溶液A(0.1％TFA)和溶液B(100％乙腈)进行梯度洗脱，收集各组分峰进行SDS-PAGE和抑酶肽活性分析，并根据OD280吸收值测定蛋白浓度。
质谱检测结果表明，本发明制备的抑酶肽的分子量为6508.7Da。用Edman水解法测定蛋白质N-端序列，结果表明，蛋白质N末端15个氨基酸序列与天然抑酶肽序列完全一致。
实施例4表达产物的生物学活性分析利用胰蛋白酶抑制实验(参照Cara B，Marks V，Peter N，et al)来定量分析表达产物的生物学活性。简单地说，该方法包括首先向600μl缓冲体系(50mMTris-HCl，PH 8.0，10mM MgCl2，10mM CaCl2)中加入200μl胰蛋白酶溶液(100U/mlBuffer)，然后再加入200μl不同浓度的表达物上清。将此混合物置于室温下反应约20～30分钟后，加入50μl底物N-苯甲酰-L精氨酸-β萘酰胺溶液(BAPNA)(20mM，溶于DMSO)。反应5分钟后，于405nm处测量吸光度的变化(相对于对照管)。结果，可见本发明方法制得的具有天然N末端氨基酸序列(Arg-Pro-Asp)的抑酶肽表现有十分显著的胰蛋白酶抑制活性(抑制率约为80％)。另外，使用该方法测得本发明的具有天然N末端氨基酸序列的重组抑酶肽的产率约为900mg/L。
序列表<110>吉林圣元科技有限责任公司<120>制备重组抑酶肽的方法<140>
<141>
<160>6<210>1<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的白蛋白信号肽DNA编码序列正链。
<400>1CGAAACGATG AAGTGGGTAA CCTTTATTTC CCTTCTTTTT CTCTTTAGCT CGGCTTAC<210>2<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的白蛋白信号肽DNA编码序列负链。
<400>2TCGAGTAAGC CGAGCTAAAG AGAAAAAGAA GGGAAAIAAA GGTTACCCACTTCATCGTTT<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>3CTGTGATGAC CTTCCCTCTT TAACCG<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>4
TTCTGAGCGC CACCACTTTC CCTA<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>4CAAAGCCTCG AGACCTGACT TCTGCCT A<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>4GGTTCTAGAG CCCTTAAGCA CC
权利要求
1.一种使用巴斯德毕赤酵母系统分泌表达重组抑酶肽的方法，该方法包括培养包含可复制表达载体的巴斯德毕赤酵母菌株，所说的载体携带编码抑酶肽的基因和允许在适当的营养培养基中表达抑酶肽的DNA序列，然后从培养物上清中回收和纯化所需的抑酶肽，特征在于，所说的载体中直接连接在抑酶肽基因上游的信号序列是人或哺乳动物白蛋白信号序列。
2.根据权利要求1的方法，特征在于所说的抑酶肽是具有正确的天然N末端氨基酸序列的抑酶肽。
3.根据权利要求1的方法，特征在于所说的白蛋白信号序列具有序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.含有按照权利要求1的方法表达的具有天然N末端氨基酸序列的抑酶肽和适当的载体或赋形剂的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及抑酶肽，具体地说，本发明涉及在甲基营养酵母中生产抑酶肽的方法，特别是使用白蛋白信号肽，以DNA重组技术在巴斯德毕赤酵母中生产具有天然N末端氨基酸序列(Arg－Pro－Asp)的抑酶肽的方法。
文档编号C12N15/81GK1880451SQ20051001687
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月14日 优先权日2005年6月14日
发明者颜炜群, 杨莉莉 申请人:吉林圣元科技有限责任公司