专利名称：：耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物基因工程领域，特别是通过不同来源的耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法与应用。
背景技术：
：自1983年首次报道通过土壤根癌杆菌获得转化烟草以来，植物基因工程取得了飞速发展。由于转基因农作物具有高产、优质、抗病虫害、抗除草剂及抗逆境等优点，世界范围内种植的转基因作物的种类和产量都迅速增加。据统计，2002年全球转基因作物种植面积达到5870万公顷，2003年则增加到6770万公顷，其中转基因大豆、玉米、棉花和油菜4种作物的种植面积已达种植总面积的25％，种植转基因作物的国家从1996年的6个增加到2002年的18个。转基因植物已经并且无疑将在解决人类生存以及可持续发展等方面发挥越来越大的作用。随着越来越多转基因作物进入商品化生产，人们对转基因植物的生物及生态安全性也越来越担心。造成这些担忧的原因是多方面的，但其中一个重要原因是为了提高转化效率，在转化过程中一般需要使用筛选标记基因(selectablemarkergene，以下简称SMG)来鉴别转化细胞、组织和植株。SMG在遗传转化过程中与目的基因共同导入转化细胞，在筛选剂的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于获得SMG所赋予的抗性而成活下来，并进一步增殖分化，形成转基因植物，因此SMG对转基因植株的获得至关重要。获得转基因植物后，SMG一般便不再有用。尽管现有的风险评估报告认为一些SMG如nptII(新霉素磷酸转移酶)，CP4是安全的，但SMG潜在的生态安全和生物安全性一直存在争议，公众对SMG安全的担心已经大大阻碍了转基因植物的商业化进程。据统计，目前已经有超过50种SMG用于植物转化研究，其中应用最多的是抗生素抗性基因和抗除草剂基因[4]。目前认为SMG潜在的危险主要有以下几个方面(1)转基因农作物中的除草剂类SMG可能会经自然杂交传递至杂草，转基因作物本身也可能变为杂草或通过杂交等方式使野生近缘种变为杂草。(2)SMG可能扩散到其他物种而造成生态失衡，如产生超级病虫害等。(3)由转基因作物生产的食品所含的标记基因及其产物可能对人或动物健康有害。(4)转基因食品中的抗生素标记基因可能被转移到人或动物肠道寄生菌，使其产生耐药性。(5)一些SMG长期的潜在负面效应及安全性难以预见。此外，由于转基因植物中某一种SMG的存在，若要对该植物进行多次遗传操作将会受到限制。对不同SMG及其产物的风险评估是一个昂贵、繁琐而又漫长的过程，所以近年来培育无SMG的转基因植物和寻找新的安全的SMG已成为植物基因工程研究的热点。目前解决转基因植物SMG安全性问题有两种途径一是转化时仍使用SMG，转基因植物再生成功后将其剔除；二是寻找新的安全的SMG。对于前一条途径而言，目前报道的剔除SMG的转化系统主要有共转化(co-transformation)系统、位点特异性重组(site-specificrecombinase)系统、转座子(transposon)系统和双T-DNA载体系统等。尽管这些系统都能够不同程度的消除SMG，但仍存在很多问题，如共转化方法通过有性杂交可实现目的基因与标记基因的分离，但需要从大量的转基因植株中去筛选，与传统的转基因方法相比，需要更多的工作量才能获得无SMG的转基因植株，而且只适合有性杂交的物种。利用转座子、位点特异重组酶系统等方法去除转基因植物中标记基因，初级转化系一般需要通过杂交或再次转化来导入Ac转座酶、Cre重组酶等基因，然后对杂交后代进行选择，筛选出不含标记基因的植株，SMG和目的基因的遗传分离必须经过有性世代才能实现，这不仅会增加育种时间，无法应用于无性繁殖的植物品种，而且有报道转化植物可能会出现畸形。为了寻找新的安全的SMG，近年来发展了糖类代谢酶基因作为新的SMG，加入糖类筛选剂后不是将非转化细胞杀死，而是使转化细胞处于某个有利的代谢条件下，从而筛选出转化细胞。与传统的选择系统(负选择系统)相比，这种选择系统称之为正选择系统。正选择系统的主要优点在于选择剂无毒副作用，不影响转化植物的代谢平衡，在多数情况下有利于转化植株的再生，提高转化效率。目前用于植物转化的此类标记基因有木糖异构酶基因(xylA)和磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)。但糖类代谢酶SMG用于植物遗传转化时不同植物对所需的筛选剂的最适浓度差别很大，对总碳源量及配比的要求也不甚相同，与其他SMG一样存在不容忽视的品种差异。因此以糖类为筛选剂的正筛选系统虽然证明在某些植物(如禾本科)效果较好，但在绝大多数植物上的效果还有待进一步验证。基于上述原因，寻找新的能够广泛用于不同植物转化的SMG是目前植物基因工程的研究热点，也是制约更多转基因植物商业化的一个瓶颈。世界上一些有影响的农业生物技术公司正在对此进行研究，并公开征集解决方案。在我国，尽管已经获得了多种转基因农作物如水稻，大豆，玉米，小麦等，但一直没有进行大规模种植，其中一个原因是基于SMG生物安全性方面的考虑而没有通过国家的评审。例如用于水稻等禾本科作物遗传转化的SMG以hpt(潮霉素筛选基因)效果较好，但该基因目前被认为是不安全的。尽管一些抗除草剂基因也可以用于禾本科作物转化，但一些主要的SMG已经受到专利保护，商业化使用这些基因需要付出昂贵的专利费用，如目前广泛使用的CP4，bar基因以及前面提到的糖类代谢酶基因等都只能用于研究目的。缺乏拥有自主知识产权的功能基因(包括SMG)以及成熟的转基因植物育种技术体系，将会影响我国在植物基因工程领域的国际地位，也会极大的妨碍我国转基因作物的大规模商业化应用。植物可通过调节信号传导，合成渗透调节物质，选择性吸收和运输离子，调控钙调蛋白、通道蛋白等的变化来适应盐胁迫，一些耐盐基因在植物的表达并没有提高植物体内盐的累积，而是通过维持渗透压的平衡或者通过逆向转运蛋白将盐排到胞外而起作用，因此含有耐盐基因的转化植物不会因为盐的累积而对人类健康产生危害。尽管已经获得了不少耐盐转基因植物，但到目前为止还没有通过耐盐这一特性用于植物遗传转化筛选的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法与应用。该方法能够克服现有技术缺陷，它通过不同来源的耐盐基因并以低成本的氯化钠作为植物遗传转化筛选剂而获得转化植物，采用该新的植物转化系统获得的转化植物具有生物安全性和生态安全性，从而为促进植物基因工程的发展和推广应用作出积极贡献。本发明所采用的技术方案如下本发明是一种采用来源于真核生物的耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法，包括以下步骤a.耐盐基因的克隆通过PCR方法，将来源于真核生物gpp(甘油磷酸酶)、gpd(3-磷酸甘油脱氢酶)、hal、dhh、SOS1基因克隆后测序，得耐盐基因。b.转化载体的构建将耐盐基因连接到酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体pBI101或者pCAMBIA上，分别命名为pA8系列或pBI质粒，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105。c.植物遗传转化通过农杆菌介导的转化方法转化高等植物，在含有不同氯化钠浓度的MS培养基上筛选获得转化苗，再通过在含盐生根培养基生根，获得完整的再生植物即转化植物，d.转化植物的鉴定通过测定β-glucoronidase(β-葡苷酸酶)活性鉴定是否转化成功。本发明与现有技术相比，具有以下主要优点其一.方法简单，操作安全，利于转基因植物的推广应用和环境保护。其二.开创了利用耐盐基因作为植物转化筛选标记基因的途径，即从酵母和拟南芥等真核生物克隆耐盐机理不同的耐盐基因作为SMG，构建植物转化载体转化不同植物，通过低成本的氯化钠(包括筛选培养基和生根培养基)等筛选剂获得转化植物，建立新的植物转化系统。这些基因来源于酵母或者高等植物，与目前广泛使用的来源于细菌的SMG比较具有多方面的优点，例如在生物安全性和生态安全性方面更具有保障性。其三.扩展了植物转化筛选基因的来源，可以对同一植物能够进行多次遗传转化。其四.采用氯化钠作为筛选剂不仅成本低，而且在转化目的基因的同时使植物获得了另一个重要的特性-耐盐，这使得筛选基因同时具有应用价值。并且，这种特性对从低等到高等生物都没有负面影响。其五.由于绝大多数植物对盐胁迫都很敏感，本方法作为一种高效广谱的植物转化筛选方法能够用于大多数植物的转化筛选，具有广阔的商业化应用前景。总之，本发明开创了利用耐盐基因作为植物转化筛选标记基因的途径，能够代替目前广泛使用的通过抗生素或者抗除草剂基因作为筛选标记基因存在的弊端，能够获得具有生物安全性和生态安全性的转化植物，利于生物和环境保护等优势，必将促进转基因植物的商业化应用，以及今后植物基因工程的发展。图1是用于转化载体构建的出发载体pA8。图2是将不同耐盐基因克隆到图1后的载体pA8-STG示意图，其中STG可以是gpp2、hal1、dhh1或者SOS1。图3是用于克隆gpd1耐盐基因的出发载体pBI121。图4将gpd1耐盐基因克隆到图3后的载体pBI-gpd1示意图。图5是克隆有gpd1和gpp12个耐盐基因的载体pA8-gpd1-gpp1示意图。图6是烟草在不同氯化钠浓度下筛选再生的效果示意图(氯化钠浓度从左至右0，6，8，10，15mg/L)。图7是在6mg/L氯化钠筛选2周后的效果示意图。图8是在耐盐培养基筛选2周后的GUS(β-葡苷酸酶)检测效果示意图。图9是再生的烟草在含有12mg/L氯化钠的生根培养基的生根效果示意图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。本发明提供的是一种采用来源于真核生物的耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法，其包括以下步骤a.耐盐基因的克隆通过PCR方法，将来源于真核生物的甘油磷酸酶、3-磷酸甘油脱氢酶、hal、dhh、SOS1基因克隆后测序，得耐盐基因。上述真核生物可选用酿酒酵母或拟南芥。高等植物可选用烟草。b.转化载体的构建将耐盐基因连接到酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体pBI121或者pCAMBIA上，分别命名为pBI质粒或pA8系列，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105。c.植物遗传转化通过农杆菌介导的方法转化高等植物，在含有不同氯化钠浓度的MS培养基上筛选获得转化苗，再通过在含盐生根培养基生根，获得完整的再生植物即转化植物。d.转化植物的鉴定通过测定β-glucoronidase(β-葡苷酸酶)活性鉴定是否转化成功。本发明提供的耐盐基因，可用于植物遗传转化的筛选标记基因。该植物可以是杨树等树木，或大豆等双子叶植物，或水稻等单子叶植物。下面结合具体实验对本发明提供的方法作进一步说明。实验一.转化载体的构建1.耐盐基因的克隆1.1引物设计获取GenBank的gpd1(登录号NC_001136)、gpp1(NC_001141)、gpp2(NP_012211)、hal1(X67559)、dhh1(SCYDL160C)的基因序列，根据不同酶切位点的需要设计引物。引物序列见附表，附表显示了PCR克隆不同耐盐基因设计的引物序列。1.2PCR扩增及载体构建提取酿酒酵母的总DNA，取2μl加入50μlPCR反应体系中作为模板DNA用于扩增。TouchdownPCR扩增的反应参数如下94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，每个循环退火温度下降0.5℃，20个循环后再进行10个常规循环，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，末次循环72℃延伸5min。PCR仪为ThermoHybaidPX2，在tube模式下进行PCR扩增。所得PCR产物取5μl进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。符合预期大小的PCR产物回收，通过酶切PCR产物和植物双元载体，分别回收相应的片段进行连接构建植物转化载体。利用XhoI酶切位点将耐盐基因(SaltToleranceGenes，STG)gpp2、hal1、dhh1替换pCAMBIA1305.1(简称pA8，图1)的hptII基因，构建pA8-STG(分别包括pA8-gpp2、pA8-hal1、pA8-dhh1，图2)。根据BamHI和SacI酶切位点将gpd1基因替换pBI121(图3)的GUS基因构建pBI-gpd1(图4)。然后利用HindIII和EcoRI酶切位点切下pBI-gpd1的gpd1基因表达盒(包括启动子和终止子)，插入pA8的多克隆位点(MCS)中的HindIII和EcoRI酶切位点之间，再利用XhoI酶切位点将gpp1基因替换hptII基因，构建pA8-gpd1-gpp1(图5)。通过酶切或利用载体上的一条引物E35S(引物序列5′-CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3′)与相应基因的反向引物配对进行PCR检测，筛选阳性质粒并进行序列测定。获得的阳性质粒通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105，用于下面烟草转化。实验二.烟草转化筛选盐浓度和生根盐浓度的确定1.筛选盐浓度的确定烟草叶片切成1×1cm的小片，置于含有不同氯化钠的MS培养基上，盐的浓度分别为0，2，4，6，8，10，12，15mg/L，结果表明在6-8mg/L氯化钠浓度时能够完全抑制叶片的再生，以此浓度作为转化筛选的氯化钠浓度。2.生根盐浓度的确定在再生培养基上获得的野生型烟草小苗切下，置于含有0，5，10，12，15mg/L氯化钠浓度的MS生根培养基。在加入12mg/L和15mg/L氯化钠的培养基上不能够生根，以此浓度作为转化烟草生根的氯化钠浓度。实验三.烟草遗传转化1.gpd1基因作为转化筛选标记基因烟草叶片切成1×1cm的小片，加入含有图3和图4质粒的农杆菌菌液，10分钟后转到1/10MS共培养基上培养3天后再转到含有6-8mg/L氯化钠的筛选培养基上，培养14天后将获得的愈伤组织再转到同样的培养基，获得的再生小苗切下，转入12mg/L氯化钠的生根培养基上。2.gpp2基因作为转化筛选标记基因图2含有gpp2基因的质粒农杆菌菌液相同方法转化烟草后，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。3.hal1基因作为转化筛选标记基因图2含有hal1基因的质粒农杆菌菌液相同方法转化烟草后，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。4.dhh1基因作为转化筛选标记基因图2含有dhh1基因的质粒农杆菌菌液相同方法转化烟草后，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。5.gpd1-gpp1基因作为转化筛选标记基因图5含有gpd1-gpp1基因质粒农杆菌菌液相同方法转化烟草后，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。实验四，杨树遗传转化1.将杨树叶片切成1×1cm的小片，置于含有不同氯化钠的MS培养基上，盐的浓度分别为0，2，4，6，8，10mg/L，结果表明在6-8mg/L氯化钠浓度时能够完全抑制叶片的再生，以此浓度作为转化筛选的氯化钠浓度。2.图2含有hal1基因的质粒农杆菌菌液相同方法转化杨树叶片后，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。实验五，大豆遗传转化大豆种子用15％次氯酸钠灭菌15分钟，无菌蒸馏水洗5次，然后放入无菌蒸馏水浸泡过夜，将种子胚尖分离，与含有hal1基因的质粒农杆菌菌液共培养三天，转入含有5mg/L氯化钠的MS再生培养基，获得的再生苗进行GUS检测，获得GUS阳性植物，确定转化成功。附表耐盐基因克隆所用引物权利要求1.一种植物遗传转化筛选标记基因的方法，其特征是一种采用来源于真核生物的耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法，包括以下步骤a.耐盐基因的克隆通过PCR方法，将来源于真核生物的gpp即甘油磷酸酶、gpd即3-磷酸甘油脱氢酶、hal、dhh、SOS1基因克隆后测序，得耐盐基因，b.转化载体的构建将耐盐基因连接到酶切后的质粒表达载体即植物双元转化载体pBI121或者pCAMBIA上，分别命名为pBI或pA8系列质粒，通过冻融法转入农杆菌菌株EHA105，c.植物遗传转化通过农杆菌介导的转化方法转化高等植物，在含有不同氯化钠浓度的筛选再生培养基上筛选获得转化苗，转化苗再通过在含盐生根培养基生根，获得完整的再生植物即转化植物，d.转化植物的鉴定通过测定β-glucoronidase即β-葡苷酸酶活性鉴定是否转化成功。2.根据权利要求1所述的植物遗传转化筛选标记基因的方法，其特征在于真核生物是酿酒酵母或拟南芥。3.根据权利要求1所述的植物遗传转化筛选标记基因的方法，其特征在于高等植物是烟草。4.一种将权利要求1所述的耐盐基因用于植物遗传转化的筛选标记基因。5.根据权利要求4所述的耐盐基因的应用，其特征在于植物是树木，或双子叶植物，或单子叶植物。6.根据权利要求5所述的耐盐基因的应用，其特征在于树木是杨树。7.根据权利要求5所述的耐盐基因的应用，其特征在于双子叶植物是大豆。8.根据权利要求5所述的耐盐基因的应用，其特征在于单子叶植物是水稻。全文摘要本发明是一种采用来源于真核生物的耐盐基因作为植物遗传转化筛选标记基因的方法与应用。该方法包括耐盐基因的克隆、转化载体的构建、植物遗传转化和转化植物鉴定等步骤。本发明开创了利用耐盐基因作为植物转化筛选标记基因的途径，能够代替目前广泛使用的通过抗生素或者抗除草剂基因作为筛选标记基因存在的弊端，能够获得具有生物安全性和生态安全性的转化植物，利于生物和环境保护等优势，必将促进转基因植物的商业化应用，以及今后植物基因工程的发展。文档编号C12N15/65GK1699579SQ200510018720公开日2005年11月23日申请日期2005年5月17日优先权日2005年5月17日发明者陈士云,张勇,杨宝玉申请人:中国科学院武汉病毒研究所