水稻抗白叶枯病隐性基因xal3和它的等位显性基因Xal3的制作方法

专利名称：水稻抗白叶枯病隐性基因xal3和它的等位显性基因Xal3的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一个水稻抗白叶枯病隐性基因xa13的分离克隆、功能验证和应用。抗病隐性基因xa13是它的等位(显性)基因Xa13的功能缺陷突变体。显性基因Xa13的突变使水稻产生对某些白叶枯病菌的抗性。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两大类(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但绝大多数抗病基因都具有病原生理小种特异性，即一个抗病基因只能介导对一种或几种病原生理小种的抗病反应。抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。
植物中已有多个抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多数基因都编码信号分子识别蛋白(Baker等，1997，Signaling in plant-microbe interactions，Science 276726-733。这类抗病基因介导的抗病反应可以用基因对基因学说解释(Flor，1956，The complementarygene systems in flax and flax rust，Adv.Genet.829-54)。根据基因产物的结构，现可将已经分离克隆并经过功能验证的植物抗病基因分为8类(Hammond-Kosack和Parker，2003，Deciphering plant-pathogen communicationfresh perspectives for molecular resistance breeding，Curr.Opin.Biotech.14177-193)。本专利申请涉及的水稻抗白叶枯病隐性基因xa13属于目前尚未在植物中报道过的一种新类型抗病基因。
水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种Xanthomonasoryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起。这种病害在亚洲、欧洲、非洲、南美、美国和澳大利亚都有发生；而以日本、印度和中国发生比较严重。我国主要发生在华东、华中、华南稻区，在西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布。白叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻(过崇俭，1995，中国农作物病虫害，中国农业出版社，14-24)。受侵染的水稻一般减产20-30％，严重时能够达到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition，Commonwealth Mycology Institute，NewEngland)。白叶枯病造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。
控制白叶枯病害流行的最好的方法是改良水稻品种的抗性。转基因技术为品种改良提供了高效途径。但利用这一途径的前提是必须具有优良抗病基因克隆。目前已被鉴定的抗白叶枯病基因有30个，但国际国内已报道被克隆的抗白叶枯病基因只有四个Xa21(Song等1995，A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene，Xa21，Science2701804-1806，美国专利5,859,339)、Xa1(Yoshimura等，1998，Expression of Xa1，a bacterialblight resistance gene in rice，is induced by bacterial inoculation，Proc.Natl.Acad.Sci.USA951663-1668)，Xa26(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzaepv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein，Plant J.37517-527，本申请人的在先授权的中国发明专利ZL02139212.9)和xa5(Iyer和McCouch，2004，The rice bacterialblight resistance gene xa5 encodes a novel form of disease resistance，Mol.Plant-Microbe Interact171348-1354)。在国际上已经鉴定并命名的30个抗白叶枯病基因中，大多数基因对白叶枯病菌生理小种PXO99没有抗性。而本申请所涉及的xa13基因对白叶枯病菌PXO99有很强抗性。xa13基因是它的等位(显性)基因Xa13的功能缺陷突变体。显性基因Xa13存在于所有对白叶枯病菌PXO99不具有抗性的水稻品种中。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，可使水稻中显性基因Xa13的功能丧失，拓宽水稻的抗谱；也可以利用RNAi技术抑制隐性基因xa13的功能，进一步提高水稻对白叶枯病的抗性。

发明内容
本发明的目的涉及从水稻中分离和应用一种新的DNA序列，这些序列包含隐性基因xa13和xa13基因的等位显性基因Xa13的DNA片段。所述的隐性基因xa13是显性基因Xa13的等位突变基因。携带隐性基因xa13的DNA片段赋予水稻对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应。其中，显性基因Xa13和隐性基因xa13的DNA片段分别如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的DNA序列。
所述的显性基因Xa13的编码产物XA13蛋白和隐性基因xa13的编码产物xa13蛋白均由307个氨基酸组成(分别如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示氨基酸序列)。与XA13蛋白相比，xa13蛋白第238位氨基酸发生突变，由XA13蛋白的丙氨酸变为xa13蛋白的苏氨酸。
本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性的应用提供了一种新的方法。这种方法包括将隐性基因xa13或显性基因Xa13的部分片段与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制显性基因Xa13的功能改良水稻对白叶枯病的抗性，或者通过抑制隐性基因xa13的功能进一步提高水稻的抗性。
在本发明的实施例部分，申请人详细阐述了本发明所涉及的隐性基因xa13和显性基因Xa13的分离、功能验证和应用过程以及这两个基因的特点。


序列表SEQ ID NO1.本发明分离的水稻抗白叶枯病隐性基因xa13的等位显性基因Xa13的序列，该显性基因来源于水稻品种IR24和IR64(菲律宾国际水稻研究所公开提供的水稻品种)。
序列表SEQ ID NO2.本发明分离的水稻品种明恢63、IR24和IR64中显性基因Xa13的cDNA序列。
序列表SEQ ID NO3.本发明分离的水稻抗白叶枯病隐性基因xa13的序列，该隐性基因来源于水稻品系IRBB13(菲律宾国际水稻研究所公开提供的水稻品系)。
图1.是本发明鉴定和分离克隆水稻抗白叶枯病隐性基因xa13和它的等位显性基因Xa13、以及xa13和Xa13基因功能验证的流程图。
图2.是覆盖抗白叶枯病隐性基因xa13区段的物理图谱。图中短横线示细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)克隆。分子标记之间的数字表示在F2群体中检测到的xa13位点与分子标记之间发生重组交换的单株数。其中没有下划线的数字表示在第二个F2群体中检测到的重组交换事件的次数，有下划线标记的数字表示在第三个F2群体中检测到的重组交换事件的次数。连接分子标记和BAC克隆的竖虚线表示通过DNA杂交或者序列比较分析证实了相对应的分子标记和BAC克隆具有同源性。
图3.是本发明涉及的显性基因Xa13的结构以及遗传转化片段结构。长方块代表Xa13基因的外显子，横线条代表内含子；黑色长方块示编码区，斜线长方块示5’-和3’-末端非翻译区(untranslated region，UTR)；ATG和TGA分别是翻译起始密码和终止密码；数字示各结构的碱基(bp)数。与水稻品种IR24和IR64中的Xa13基因序列进行比较分析，水稻品种明恢63中的Xa13基因发生两个碱基替换(箭头)。这两个碱基替换存在于内含子中，碱基替换内容见表1。
图4.是具有IRBB13遗传背景的T0代遗传转化植株接种白叶枯病菌PXO99两周后表型和对应植株的基因型分析。感病遗传转化T0代植株和水稻感病对照品种IR24都携带显性基因Xa13的候选基因，而抗病转化植株和水稻抗病对照品系IRBB13都不携带Xa13候选基因。
图5.是具有IRBB13遗传背景的T1代遗传转化植株接种白叶枯病菌PXO99两周后表型和对应植株的基因型分析。来源于一个T0植株的T1代植株的感病表型与显性基因Xa13候选基因的分子标记共分离。IRBB13携带隐性基因xa13，IR24携带显性基因Xa13。
图6.是携带嵌合基因eGFP-Xa13的水稻愈伤组织切片，用发红色荧光的PI(propidium iodide)染料染色。采用莱卡共聚焦显微镜观察。图中A.在观察绿色荧光的波长(505-530nm)下，观察到绿色荧光在组织中的分布。B.在观察红色荧光波长(488nm)下，观察与A同一视野中组织和细胞结构；长箭头(白色)示细胞核，短箭头(天兰色)示细胞膜。C.将A和B的图像重叠，显示绿色荧光位于细胞膜，证实XA13是细胞膜蛋白质。
图7.是携带显性基因Xa13DNA片段的pMCG161载体的部分结构。图中RB和LBT-DNA的右侧和左侧边界；Hpt潮霉素磷酸转移酶基因；35S花椰菜花叶病毒35S启动子；AdhI玉米乙醇脱氢酶基因的内含子I；OCS章鱼碱合成酶多聚腺苷酸信号。
图8.是本发明所涉及的隐性基因xa13的结构以及PCR扩增片段结构。图中长方块代表xa13基因的外显子，横线条代表内含子；黑色长方块示编码区，斜线长方块示5’-和3’-UTR；ATG和TGA分别是翻译起始密码和终止密码；数字示各结构的碱基(bp)数。与显性基因Xa13比较分析，长箭头示xa13基因发生一个碱基替换、并造成一个氨基酸密码改变的位置，实心短箭头示xa13基因发生一个碱基替换、但没有造成氨基酸密码改变的位置，空心短箭头示xa13基因发生3个碱基插入的位置。碱基替换和插入的内容见表3。
图9.是本发明的其中一个实施例中所应用的一个水稻品系“IR24”的显性基因Xa13和另一个水稻品系“IRBB13”的隐性基因xa13的相对表达量。Xa13或xa13基因的表达量是与看家基因actin的表达量相比后的相对表达量，使各材料在样品量一致的条件下进行比较。ck未接种也未接水材料；8、24和72接种PXO99或接水8、24、72小时。
具体实施例方式
以下实施例中进一步解释和定义本发明，图1描述了遗传定位和分离克隆抗白叶枯病隐性基因xa13和它的等位显性基因Xa13、以及验证xa13和Xa13基因功能的流程。根据以下实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1构建抗白叶枯病隐性基因xa13区段的物理图谱1.实验材料和接种方法分两年用携带隐性基因xa13的籼稻家系“IRBB13”和“IRBB13”的近等基因系(轮回感病亲本)、携带显性基因Xa13的“IR24”(Chu等，2004，Genome-wide analysis ofdefense-responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediated by the recessive R genexa13.Mol.Genet.Genomics 271111-120)构建了三个F2群体。第一个群体由250株极端抗病(接种白叶枯病菌PXO99两周后病斑长度小于3厘米)单株组成，第二个群体由6000个随机单株组成，第三个群体由1972个随机单株组成。利用这三个F2群体定位隐性基因xa13。
本发明采用剪叶法(Kauffman等，1973，An improved technique for evaluating resistance ofrice varieties to Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57537-541)接种白叶枯病菌。白叶枯病菌菌株是PXO99，由菲律宾国际水稻研究所提供(Chu等，2004，Genome-wide analysis ofdefense-responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediated by the recessive R genexa13.Mol.Genet.Genomics 271111-120)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Lin等，1996，Identifying and mapping a new gene for bacterial blight resistance in rice based on RFLPmarkers.Phytopathology 861156-1159)。
2.构建xa13基因区段的物理图谱根据前人对隐性基因xa13的遗传分析，该基因位于水稻8号染色体的两个RFLP(restriction fragment length polymorphism)标记RG136和R2027之间(Zhang等，1996，RAPDand RFLP mapping of the bacterial blight resistance gene xa13 in rice，Theor Appl Genet 9365-70；Sanchez等，1999，Genetic and physical mapping of xa13，a recessive gene bacterial blightresistance gene in rice.Theor Appl Genet 981022-1028)。本发明利用第一个F2群体进行分析，将xa13基因定位于RG136和另一个RFLP标记S14003之间(图2)。进一步用第二个F2群体分析，发现一个CAPS(cleaved amplification polymorphism sequence)标记E6a位于RG136和xa13位点之间，即xa13位点位于E6a和S14003之间(图2)。利用水稻品种明恢63的细菌人工染色体(bacterial artifical chromosome，BAC)文库(Peng等，1998，A BAC libraryconstructed to the rice cultivar‘Minghui63’for cloning genes of agronomic importance，ActaBotanica Sinica 401108-1114)，本发明构建了xa13基因区段、覆盖分子标记E6a至S14003区间的物理图谱(图2)。该物理图谱由5个重叠的BAC克隆(22E06、23P23、30A21、39N05、44F01)组成，其中BAC克隆44F01的序列与两个来自水稻品种IR64、位于xa13区段的BAC克隆21H14和14L03(Sanchez等，1999，Genetic and physical mapping of xa13，a recessive genebacterial blight resistance gene in rice.Theor Appl Genet 981022-1028)同源。
3.物理图谱中部分BAC克隆的测序和原始序列的拼接采用超声波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)构建目标BAC克隆的Shotgun文库。用超声波处理BAC克隆的环形质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离出1.5-2.5kb的DNA片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端，与Sma I酶切的去磷酸化的pUC18载体(购自美国Amersham Bioscience公司)平端连接，电转化大肠杆菌DH10B(参见Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonasoryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant J.37517-527)，进行蓝白斑筛选。提取阳性克隆质粒，并与空pUC18质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI双酶切，检测插入片段大小。
采用M13-R(5’-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3’)和M13-F(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)引物和购美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)，根据试剂盒的使用说明以双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。测序仪为Perkin Elmer公司的ABI377 Sequencer。
使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列；用Sequencher 4.1软件没有去除干净的序列则用手工删除。BAC载体的碎片序列和污染的细菌DNA序列则通过和BAC序列进行比较或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generationof protein database search programs，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher4.1软件对两条序列进行拼接的参数是重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重叠序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个Shotgun片段序列。对于由一个Shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确性。而由一个亚克隆覆盖的断口处，则对该克隆进行长序列胶测序或用primerwalking的方法，填补缺口。
明恢63和IR64都携带xa13基因的等位显性基因Xa13。对明恢63的BAC克隆44F01进行了部分测序和对IR64的两个BAC克隆21H14和14L03进行了完全测序。44F01大约140Kb，21H14大约90kb，14L03大约67kb。
实施例2精细定位隐性基因xa13分子标记E6a在第二个F2群体的26个单株中检测到与xa13位点发生了重组(图2)。用一系列来自测序的BAC克隆的分子标记进一步分析用E6a标记检测到的26个重组交换单株。这些标记包括6个来源于BAC克隆21H14和14L03的shotgun克隆(RP3、RP4、RP5、RP7、RP8和RP10)，根据21H14序列设计的SSR(simple sequence repeat)标记SR6和根据14L03序列设计CAPS标记ST9。分析发现标记RP3、RP4、RP5、SR6和RP7分别在与E6a标记相关的26个单株的1至15株中检测到与xa13位点发生了重组，而标记RP8、ST9和RP10在这26个单株中全部与xa13位点共分离(图2)。
根据明恢63BAC克隆44F01的序列设计的SSR标记SR11在第三个F2群体的8个单株中检测到与xa13位点发生了重组，E6a在这个群体的另外10个单株中检测到与xa13位点发生了重组，说明E6a和SR11分别位于xa13位点的两侧(图2)。用4个分子标记进一步分析第三个群体中用E6a标记检测到的10个重组交换单株和用SR11检测到的8个重组单株。发现标记RP7在与E6a标记相关的10个单株的2株中检测到与xa13位点发生了重组，而标记RP8、ST9和RP10在这10个单株中全部与xa13位点共分离(图2)；标记ST9和RP10在与SR11标记相关的8个单株的2株中检测到与xa13位点发生了重组，而RP7和RP8在这8个单株中全部与xa13位点共分离。分析结构提示xa13位点位于标记RP7和ST9之间，该区段长14.8kb(图2)。
实施例3显性基因Xa13的分离和功能验证1.Xa13候选基因的确定采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)基因预测软件对分子标记RP7和ST9之间、包含xa13的等位显性基因Xa13、来源于水稻品种IR64的14.8kb(图2)序列进行分析，显示该区段可能存在三个基因。其中第一和第三个基因不完整，第二个基因完整。因此推测第二个基因是显性基因Xa13。
2.Xa13候选基因的分离和验证本发明采用限制性内切酶BamHI酶切处理水稻品种IR64的BAC克隆14L03的质粒DNA，从中分离了包含显性基因Xa13的候选基因、长大约14kb的DNA片段(图3)。将该片段与BamHI酶切处理的农杆菌介导的遗传转化载体pCAMBIA1300(Sun等，2004，Xa26，agene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptorkinase-like protein.Plant J.37517-527)连接。通过农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep 23540-547)将该片段转入携带隐性基因xa13的水稻品系IRBB13中，获得45株遗传转化植株。
用与携带隐性基因xa13的水稻呈非亲和性反应的白叶枯病菌PXO99接种(实施例1中接种方法，下同)所有T0代转化植株。与对照IRBB13相比，26株转化植株的抗病表型发生了变化。接种两周后这26株转化植株的病斑长度为12.3-25.6厘米，与感病水稻IR24的病斑长度(20.6±2.7厘米)相似，而与抗病水稻IRBB13的病斑长度(1.4±0.2厘米)差别明显。为了确认这些转化植株表型改变与转入的Xa13候选基因相关，本发明用一个Xa13候选基因调控区的特异CAPS标记Xa13/SphI检测所有45株转化植株。检测结果显示所有感病转化植株(26株)都含有转入的Xa13候选基因，而所有抗病转化植株(19株)都不携带Xa13候选基因(图4)。这些结果证明转化植株的表型改变是因为转入基因的作用。
为了进一步验证遗传转化植株表型改变是因为转入的Xa13候选基因的作用。本发明检测了T1代植株。结果显示所有T1代植株的感病表型都与显性基因Xa13候选基因的分子标记共分离(图5)。证明用于遗传转化的候选基因就是显性基因Xa13。
本发明进一步采用PCR方法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)、根据水稻品种IR64中Xa13基因两侧的DNA序列设计PCR引物X13Ful F(5’-TACGGTCCATGTTGAGCTTTAGGATTAGCGGGTT-3’)、X13Ful R(5’-GATGGATCCTCTGTCACCCACGATTTTTCCT-3’)和end R(5’-GGGGATCCACTACAGTGGCATCCATCG-3’)。利用PCR引物X13Ful F和end R从水稻品种IR24中扩增了包含显性基因Xa13的大约5.1kb片段，利用PCR引物X13Ful F和X13FulR从水稻品种明恢63中扩增了包含显性基因Xa13的大约4.4kb片段(图3)。另外，本发明利用Xa13基因的序列、通过BLAST分析方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST andPSI-BLASTa new generation of protein database search programs，Nucleic Acids Res.253389-3402)检索明恢63 cDNA文库(储昭晖等，2002，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定，科学通报471656-1662)，获得Xa13基因的全长cDNA克隆EI74B06。对这些DNA片段和cDNA克隆EI74B06进行完全测序和序列比较分析。结果显示包含显性基因Xa13和它的调控区的5.1kb片段序列在水稻品种IR24和IR64中完全相同。明恢63中的Xa13基因序列与IR24和IR64中的Xa13基因序列相比，有2个碱基差异；但这2个碱基的差异位于内含子处(表1和图3)，因此明恢63、IR24和IR64中Xa13基因的cDNA序列(包括编码区以及5’-和3’-UTR)完全相同(序列表SEQ ID NO2所示序列)。序列分析还显示显性基因Xa13长2834bp(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1至2834bp处)，由5个外显子(分别位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2834bp处)和4个内含子(分别位于序列表SEQ ID NO1所示序列的224-1262、1307-1404、1777-1869、1990-2081bp处)组成。外显子1中包含171个碱基的5’-UTR(序列表SEQ ID NO1所示序列的1-171bp处)，外显子5中包含420个碱基的3’-UTR(序列表SEQ ID NO1所示序列的2415-2834bp处)(图3)。
表1本发明克隆的显性基因Xa13的序列在水稻品种IR24、IR64和明恢63中的差异

1序列表SEQ ID NO1(水稻品种IR24和IR64中显性基因Xa13)所示序列位点。
3.Xa13基因的编码产物Xa13基因的编码区位于序列表SEQ ID NO1所示序列的172-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2414bp处或者序列表SEQ ID NO2所示序列的172-1095bp处)，编码307个氨基酸。采用PSORT软件(Nakai和Kanehisa，1991，Expert system forpredicting protein localization sites in gram-negative bacteria.Proteins 11(2)95-110，http//psort.ims.u-tokyo.ac.jp)分析显示，XA13蛋白是一个细胞膜蛋白质。
为了进一步验证XA13蛋白在细胞中的分布，我们将绿色荧光蛋白基因(eGFP)(Zhang等，2004，A rice WRKY gene encodes a transcriptional repressor of the gibberellin signalingpathway in Aleurone cells.Plant Physiol.1341500-1513)与Xa13基因的5’末端融合并由玉米泛素启动子(Ubi)驱动，通过观察绿色荧光分布确定XA13蛋白的分布。将这个嵌合基因UbiGFP-Xa13与HindIII和BamHI双酶切处理的上述农杆菌介导的遗传转化载体pCAMBIA1300连接。通过上述农杆菌介导的遗传转化方法将嵌合基因转入水稻品种中花11。取转基因愈伤组织进行组织切片观察，发现绿色荧光确实位于细胞膜上(图6)，证明XA13是细胞膜蛋白质。
4.Xa13基因的功能分析本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术(Smith等，2000，Total silencing byintron-spliced hairpin RNAs，Nature 407319-320)、通过抑制水稻品种明恢63中显性基因Xa13的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内RISC酶复合体的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000，Total silencing byintron-spliced hairpin RNAs，Nature 407319-320)。
本发明利用能够表达dsRNA的农杆菌介导的遗传转化载体pMCG161(McGinnis等，2005，Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functional genomics.Methods Enzymol3921-24，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，通过上述农杆菌介导的遗传转化方法将显性基因Xa13的DNA片段转入水稻品种明恢63，使明恢63中表达显性基因Xa13的dsRNA，从而抑制明恢63中显性基因Xa13的表达。具体操作步骤如下用下列ds1-2F和ds1-2R序列作为PCR引物，以水稻品种明恢63的显性基因Xa13的cDNA克隆为模板，通过PCR扩增获得显性基因Xa13中长650bp的DNA片段(位于序列表SEQ IDNO2所示序列的163-812bp处，相当于序列表SEQ ID NO1所示序列的163-223、1263-1306、1405-1776、1870-1989、2082-2134bp处)。为了便于PCR产物的克隆，ds1-2F和ds1-2R引物的5’末端标有下划线的部分为限制性酶SpeI和KpnI或者SacI和BamHI的酶切位点，随后的3’-端的序列则分别与显性基因Xa13的cDNA序列相互匹配。
SpeI KpnIds1-2F5’-GGGACTAGTGGTACCCAGTAGCAATGGCAGGAGGTSacI BamHIds1-2R5’-GGGGAGCTCGGATCCAAGTAGAGCCCCATCTGCAC构建Xa13基因片段的第一重复链(正向链)用KpnI和BamHI酶切部分PCR产物及载体pMCG161(依据载体pMCG161的使用说明，http//www.chromdb.org/info/plasmids/pMCG161.html)，酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶，置于冰上，用T4-DNA连接酶进行连接反应。电转后获得的克隆质粒用ds1-2F和ds1-2R引物扩增筛选阳性克隆并经KpnI和BamHI酶切验证(图7)。
构建Xa13基因片段的第二重复链(反向链)用SacI和SpeI酶切剩余的PCR产物和连接了第一重复链的pMCG161载体质粒，酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶，用T4-DNA连接酶进行连接反应。电转后获得的克隆质粒用SacI和SpeI双酶切反应筛选阳性克隆，阳性克隆命名为D75R(图7)。
采用上述农杆菌介导的遗传转化方法将携带Xa13基因片段的pMCG161载体(图7)导入水稻品种明恢63。获得的遗传转化植株被命名为D75RMH。本发明共获得独立转化植株11株。对全部11株植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO99。与对照明恢63相比，4株转化植株的表型发生了显著(P＜0.05)变化。与对照明恢63相比，接种两周后这4株转化植株的病斑长度减短了36-73％(表2)。
表2 明恢63RNAi遗传转化植株(D75RMH)对白叶枯病菌PXO99的反应

为进一步验证转化植株的抗病能力增强是否与显性基因Xa13的表达量相关，本发明对表2中所列4株转化植株抽提总RNA，利用7500 Real Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、定量PCR分析试剂盒SYBRGreen PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)、以及Applied Biosystems公司的定量PCR分析方法做定量反转录(reverse transcript，RT)-PCR分析，比较转化植株和对照材料中Xa13基因表达量。PCR反应引物是X13Rt3F(5’-TGACGACGACTGATCTCGAC-3’)和dse1-R(5’-TGCTAATGACACACTCTTACCACA-3’)(位于序列表SEQ ID NO1所示序列的2415-2434和2579-2556bp处)。以水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照。肌动蛋白PCR引物序列是actinF(5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’)和actinR(5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’)。分析结果显示表型改变的4株转化植株中Xa13基因的表达量与对照明恢63相比降低至15-74％(表2)。这些结果说明Xa13基因在抗白叶枯病反应中发挥负向调控因子的作用，而这一作用与它的表达量相关。
实施例4隐性基因xa13的分离和功能验证1.xa13基因的分离用实施例3中的PCR引物X13Ful F和end R从水稻品种IRBB13中扩增包含xa13基因的大约4.7kb片段(图8)，然后对该片段进行测序。序列分析显示隐性基因xa13与水稻品种IR24和IR64的显性基因Xa13相比存在6个碱基替换和3个碱基插入(表3)。其中3个碱基替换和3个碱基插入位于内含子中；另外3个碱基替换位于编码序列内，但只有一个碱基的替换造成一个氨基酸密码的改变(表3和图8)。序列分析显示隐性基因xa13基因长2837bp(位于序列表SEQ ID NO3所示序列的1至2837bp处)，由5个外显子(分别位于序列表SEQ ID NO3所示序列的1-223、1266-1309、1408-1779、1873-1992、2085-2837bp处)和4个内含子(分别位于序列表SEQ ID NO3所示序列的224-1265、1310-1407、1780-1872、1993-2084bp处)组成。外显子1中包含171个碱基的5’-UTR(序列表SEQ ID NO3所示序列的1-171bp处)，外显子5中包含420个碱基的3’-UTR(序列表SEQ ID NO3所示序列的2418-2837bp处)(图8)。
xa13基因的编码区位于序列表SEQ ID NO3所示序列的172-223、1266-1309、1408-1779、1873-1992、2085-2417bp处)，编码307个氨基酸。隐性基因xa13编码的蛋白质xa13和显性基因Xa13编码的蛋白质XA13只存在一个氨基酸的差异(表3)，它位于序列表SEQ ID NO1和序列表SEQ ID NO3所示氨基酸序列的第238位。
表3 本发明的显性基因Xa13和隐性基因xa13序列差异位点

1序列表SEQ ID NO1(显性基因Xa13)所示序列位点。
2.xa13基因的功能分析因为显性基因Xa13和隐性基因xa13的序列高度相似，本发明采用实施例3中所述RNAi技术和携带显性基因Xa13片段的pMCG161载体，通过上述农杆菌介导的遗传转化方法抑制IRBB13中隐性基因xa13基因的表达。获得的遗传转化植株被命名为D75RIB13。本实施例共获得独立转化植株16株。对全部16株植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO99。与对照IRBB13相比，7株转化植株的病斑长度明显(P＜0.05)变短(表4)。为了确认这些转化植株表型改变与隐性基因xa13的表达量相关，本发明采用上述定量RT-PCR方法检测了其中14株转化植株中xa13基因的相对表达量。与对照IRBB13相比，病斑长度明显变短的7株转化植株中xa13基因的表达量降低了3.3-10.1倍以上(表4)。这些结果说明隐性基因xa13在抗白叶枯病反应中也有一定负向调控因子的作用，而这一作用依赖于表达量。降低xa13基因的表达，可进一步增强水稻的抗性。
表4 本发明的水稻品种IRBB13 RNAi遗传转化植株(编号为D75RIB13)对水稻白叶枯病菌PXO99的反应


实施例5隐性基因xa13和显性基因Xa13表达量的分析上述实施例3和实施例4已证明抑制显性基因Xa13的表达使水稻对白叶枯病菌PXO99感病变为抗病，抑制隐性基因xa13的表达可进一步增强水稻对PXO99的抗性。这些结果说明水稻对PXO99的抗性与Xa13或xa13的低量表达密切相关。为了进一步验证这些实验结果，本发明分别用白叶枯病菌PXO99接种携带隐性基因xa13的水稻品系IRBB13和携带显性基因Xa13的水稻品系IR24，并同时设置了接水的对照实验。在接种或接水处理8、24、72小时后取水稻叶片组织抽提RNA，按上述定量RT-PCR方法检测不同处理材料中显性基因Xa13或隐性基因xa13的表达量。分析结果显示IR24的显性基因Xa13和IRBB13的隐性基因xa13的基础表达量差别不大(ck对照)，显性基因Xa13的表达量大约是隐性基因xa13的2倍(表4和图9)；接水后显性基因Xa13的表达量上升(接水对照)，接种PXO99后Xa13基因的表达量进一步上升，接种后72小时后显性基因Xa13的表达量是基础表达量(ck对照)的大约43倍(图9)。而隐性基因xa13的表达量在接种或接水后都无明显变化(图9)。这一结果进一步证明病原诱导后表达量的差异是隐性基因xa13和显性基因Xa13功能差异的一个重要因素。结合上述实施例的结果，本发明的结论是(1)显性基因Xa13的编码产物是抗病反应中的负调节因子，它的大量存在是白叶枯病菌在寄主水稻中生存所必需的；(2)抑制显性基因Xa13的功能可改良水稻对白叶枯病的抗性，抑制隐性基因xa13的功能可进一步增强水稻的白叶枯病的抗性。
序列表序列表SEQ ID NO1<110>华中农业大学<120>水稻抗白叶枯病隐性基因xa13和它的等位显性基因Xa13<130>
<141>2005-05-09<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2834<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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序列表SEQ ID NO3<110>华中农业大学<120>水稻抗白叶枯病隐性基因xa13和它的等位显性基因Xa13<130>
<141>2005-05-09<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2837<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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<221>3’UTR<222>(2418)..(2837)<223>
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Asp Val Ala Ala Phe Ala Leu Ile Val Val Thr Thr Leu Tyr Leu Val115 120 125Pro Lys Pro His Gln Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Cys Leu Ala Phe130 135 140Ser Met Ala Val Phe Val Ala Pro Leu Ser Ile Ile Phe Lys Val Ile145 150 155 160Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Met Pro Ile Gly Leu Ser Val Cys Leu165 170 175Thr Leu Ser Ala Val Ala Trp Phe Cys Tyr Gly Leu Phe Thr Lys Asp180 185 190Pro Tyr Val Met Tyr Pro Asn Val Gly Gly Phe Phe Phe Ser Cys Val195 200 205Gln Met Gly Leu Tyr Phe Trp Tyr Arg Lys Pro Arg Asn Thr Ala Val210 215 220Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ser Met Ser Pro Ile Ser Ala Thr Ala Ala225 230 235 240Ala Thr Gln Arg Val Ile Glu Leu Pro Ala Gly Thr His Ala Phe Thr245 250 255Ile Leu Ser Val Ser Pro Ile Pro Ile Leu Gly Val His Lys Val Glu260 265 270Val Val Ala Ala Glu Gln Ala Ala Asp Gly Val Ala Ala Ala Ala Ala275 280 285Ala Asp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Lys Pro Glu Val Ile Glu Ile Thr290 295 300Ala Ala Val30权利要求
1.来源于水稻的显性基因Xa13的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2.来源于水稻的隐性基因xa13介导的赋予植物对白叶枯病菌抗性的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO3中所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列，所述的隐性基因xa13是权利要求1中所述的显性基因Xa13的等位基因。
3.显性基因Xa13的cDNA序列，它是SEQ ID NO2中所示的DNA序列。
4.与合适启动子连接的、能够使水稻产生双链RNA的权利要求1至3所述的DNA序列的部分片段。
5.权利要求1至4任一项所述的DNA序列在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及包含水稻抗白叶枯病隐性基因xa13以及xa13的等位显性基因Xa13的两条DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。抗病隐性基因xa13是显性基因Xa13的功能缺陷突变体。显性基因Xa13的突变使水稻产生对白叶枯病菌的抗性。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将隐性基因xa13或者显性基因Xa13的部分DNA片段与外源调节序列连接并转入水稻，抑制水稻中显性基因Xa13的功能，可显著增强水稻对白叶枯病菌的抵抗能力；另外，通过RNAi技术抑制抑制水稻中隐性基因xa13的功能，可进一步增强水稻对白叶枯病的抗性。
文档编号C12N15/82GK1861791SQ20051001867
公开日2006年11月15日 申请日期2005年5月10日 优先权日2005年5月10日
发明者王石平, 储昭晖, 袁猛, 葛小佳, 杨红 申请人:华中农业大学