专利名称：一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法
技术领域：
本发明是利用腐皮镰孢菌(Fusarium solani)壳聚糖高效内切酶生产高活性壳寡糖的技术。
背景技术：
壳寡糖(Chitosan oligosaccharide)，也称几丁寡糖，学名为β-1，4-寡聚-葡萄糖胺，是以壳聚糖为原料，经生物技术降解而成的水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量(小于4000D)产品。壳寡糖在人体内吸收率近100％，是近年来倍受关注的功能性医药食品素材。壳寡糖水溶性大于99％，人体吸收率99.88％，从而比壳聚糖具有更优越的生物活性。实验证明，壳寡糖应用于乳制品，可使双歧杆菌增生120倍。壳寡糖具有明显的抗菌抑菌作用，其抑菌作用随壳寡糖分子量的降低而逐渐增强的，尤以分子量为1500D左右时抗菌效果较好。壳寡糖能提高机体的免疫活性和抗癌能力，还可作为植物调节剂，增强植物对病虫害的防御能力。壳寡糖的诸多优良的生物活性使其广泛应用于各行业，如精细化工领域作为优良的保湿增湿剂，同时又可抑制皮肤表面细菌，活化表皮细胞，增强皮肤弹性；在生物医药方面的重要用途之一是利用其抑制肿瘤作用来制备抗癌制剂，壳寡糖特别是低聚6～8糖，可通过活化人体中的淋巴细胞，抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌作用；在保健食品领域，以壳寡糖为主要原料生产的保健食品能够提高机体的免疫力，活化细胞，促进肠道双歧杆菌等有益菌的增生，并抑制有毒菌的生成。目前壳寡糖的制备方法主要包括水解法、物理法、利用糖转移反应、利用转基因合成、化学合成法几大类。目前以水解法(酸水解法和酶水解法等)为主。
目前广泛采用的酸解法和氧化降解法反应制取壳寡糖其反应条件和分离条件都较难控制，且后处理繁琐，分离纯化困难，高生理活性壳寡糖(聚合度在6-10)的产率低，成本高。酶法降解主要是由甲壳素酶、壳聚糖酶和溶菌酶进行水解，但这类酶较难获得，造成生产成本过高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，该方法过程简捷，成本低，得到的壳寡糖产品小于十糖的占90％以上，其中高生理活性壳寡糖(6-8糖)占45％以上。
本发明的技术方案是，该种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其步骤包括1)、以腐皮镰孢菌(Fusarium solani)经培养发酵生产出壳聚糖高效内切酶2)、壳聚糖在酶解前采用物理技术进行预处理，降低壳聚糖粘度；3)、在发酵酶液pH值为5.0-5.5，温度为37℃-55℃下，加入发酵酶液体积2-4％的壳聚糖粉末，该壳聚糖事先采用物理技术进行过预处理，酶解6-8hr；4)、对酶解后的液体，采用超滤和纳滤技术进行膜滤，对产品进行分子量分级、脱色、脱盐和浓缩干燥。
本发明进一步的方案在于，培养基成分葡萄糖或蔗糖或淀粉2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培养基pH值为5.5-7.5；培养时间20-64hr；选定的搅拌转速为250～300r/min；通风量在0～24hr，通气比为0.33∶1；24～48hr，通气比为0.38∶1；48hr～结束，通气比为0.44∶1；并根据发酵情况及时补加聚醚类消泡剂。
本发明进一步的方案在于，培养基pH值最佳pH值为6.0。
本发明进一步的方案在于，培养时间最佳60hr。
本发明进一步的方案在于，前述在酶解前采用物理技术进行的预处理可以是采用超声波技术或辐照技术等物理方法适当降低壳聚糖粘度的处理。
本发明进一步的方案在于，酶解过程中发酵酶液pH值为5.5，温度为50℃下，加入发酵酶液体积4％的壳聚糖粉末，该壳聚糖事先采用物理技术进行过预处理，酶解8hr。
本发明进一步的方案在于，所述膜滤过程是当酶解6-8hr后，过滤去除不溶物，将滤液泵入超滤膜分离器中，膜的截留分子量为2000D，滤液中分子量大于2000D的物质返回滤液贮罐中，分子量小于2000D的透过膜进入脱色脱盐贮罐；在此过程中需向滤液贮罐补加纯净水；当透过液中壳寡糖含量极低时，停止超滤操作，并将滤液泵入纳滤膜分离器进行浓缩，作为下一批的原料投入发酵酶液中；脱色脱盐贮罐中的超滤透过液泵入纳滤膜分离器，进行脱色和脱盐，截留液返回贮罐，在此过程中不断补加纯净水，直至盐份和色度达标，停止补加纯净水，对溶液进行浓缩。
前述以腐皮镰孢菌(Fusarium solani)经培养发酵生产出壳聚糖高效内切酶菌落形态，菌落圆形，菌丝白色，在不同生长阶段呈现绿色、红色等，菌落紧实，最适培养温度25℃。壳寡糖高效内切酶的一般性质酶作用适宜pH为5.0～6.0，最适宜pH值5.4；酶作用适宜温度为45～53℃，最适温度为50℃；酶作用壳聚糖不产生单糖。
通过快速筛选平板并通过摇瓶实验，筛选到了一株可迅速降解壳聚糖为壳寡糖的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；该菌株经优化培养，发酵达到300U/L以上的壳寡糖酶活性。
本发明具有如下有益效果壳聚糖高效内切酶具有高活性、酶解底物浓度高、生产成本低等特点，酶解产物小于十糖的占90％以上，其中6-8糖占45％以上，不含单糖和二糖，产物生物活性高，生产工艺采用高科技的分离手段，产品分子量分布集中。具体为1)、采用腐皮镰孢菌(Fusarium solani)发酵产生的壳聚糖高效内切酶对壳寡糖进行酶解，得到的壳寡糖产品小于十糖的占90％以上，其中高生理活性壳寡糖(6-8糖)占45％以上。
2)、原料壳寡糖经物理方法预处理后，一次酶解得率达到75％。
3)、过程简捷，减少了分离过程引起的污染。
总之，本发明将生物工程技术和膜滤技术结合起来，即采用腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)发酵产生高效内切酶对壳聚糖进行酶解，采用超滤和纳滤膜技术对产物进行分子量分级、脱色、脱盐和浓缩。其酶解产物小于十糖的占90％以上，其中6-8糖占45％以上，在现有技术中未有记载，对壳寡糖的工业化生产和应用具有现实意义。其创造性显而易见。广泛用于保健食品中。
图为本发明方法的工艺流程图。
具体实施例方式
该种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其步骤包括1)、以腐皮镰孢菌(Fusarium solani)经培养发酵生产出壳聚糖高效内切酶通过快速筛选平板并通过摇瓶实验，筛选到了一株可迅速降解壳聚糖为壳寡糖的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；该菌株经优化培养，发酵达到300U/L以上的壳寡糖酶活性；培养基成分葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培养基pH值为5.5-7.5，最佳pH值为6.0；培养时间20-64hr，最佳60hr；选定的搅拌转速为250～300r/min；通风量在0～24hr，通气比为0.33∶1；24～48hr，通气比为0.38∶1；48hr～结束，通气比为0.44∶1；并根据发酵情况及时补加聚醚类消泡剂。
2)、壳聚糖在酶解前采用物理技术进行预处理，降低壳聚糖粘度；前述在酶解前采用物理技术进行的预处理可以是采用超声波技术或辐照技术等物理方法适当降低壳聚糖粘度的处理，提高酶解时底物壳聚糖浓度。
3)、酶解过程是在发酵酶液pH值为5.0-5.5，温度为37℃-55℃下，加入发酵酶液体积2-4％的壳聚糖粉末，该壳聚糖事先采用物理技术进行过预处理，酶解6-8hr；
4)、对酶解后的液体，采用超滤和纳滤技术进行膜滤提纯，对产品进行分子量分级、脱色、脱盐和浓缩干燥。
所述膜滤过程可以是当酶解6-8hr后，过滤去除不溶物，将滤液泵入超滤膜分离器中，膜的截留分子量为2000D，滤液中分子量大于2000D的物质返回滤液贮罐中，分子量小于2000D的透过膜进入脱色脱盐贮罐；在此过程中需向滤液贮罐补加去离子水。当透过液中壳寡糖含量极低时，停止超滤操作，并将滤液泵入纳滤膜分离器进行浓缩，作为下一批的原料投入发酵酶液中。脱色脱盐贮罐中的超滤透过液泵入纳滤膜分离器，进行脱色和脱盐，截留液返回贮罐，在此过程中不断补加去离子水，直至盐份和色度达标，停止补加去离子水，对溶液进行浓缩。
壳聚糖的酶解实施例将壳聚糖和分别经超声波处理、辐照处理的壳聚糖各1200g投入30L发酵酶液中，调节pH值为5.5，启动搅拌，于37℃-55℃下酶解，8hr后过滤，滤液经超滤、纳滤、干燥，样品的酶解率如下。
不同壳聚糖的酶解产率
样品中不同聚合度壳寡糖含量如下表。
权利要求
1.一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，步骤包括1)、以腐皮镰孢菌(Fusarium solani)经培养发酵生产出壳聚糖高效内切酶；2)、壳聚糖在酶解前采用物理技术进行预处理，降低壳聚糖粘度；3)、在发酵酶液pH值为5.0-5.5，温度为37℃-55℃下，加入发酵酶液体积2-4％的壳聚糖粉末，该壳聚糖事先采用物理技术进行过预处理，酶解6-8hr；4)、对酶解后的液体，采用超滤和纳滤技术进行膜滤，对产品进行分子量分级、脱色、脱盐和浓缩干燥。
2.根据权利要求1所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，培养基成分葡萄糖或蔗糖或淀粉2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培养基pH值为5.5-7.5；培养时间20-64hr；选定的搅拌转速为250～300r/min；通风量在0～24hr，通气比为0.33∶1；24～48hr，通气比为0.38∶1；48hr～结束，通气比为0.44∶1；并根据发酵情况及时补加聚醚类消泡剂。
3.根据权利要求2所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，培养基成分葡萄糖2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％。
4.根据权利要求2所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于培养基pH值最佳为6.0。
5.根据权利要求2所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于培养时间最佳60hr。
6.根据权利要求1或2所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，前述在酶解前采用物理技术进行的预处理可以是采用超声波技术或辐照技术等物理方法适当降低壳聚糖粘度的处理。
7.根据权利要求6所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，酶解过程中发酵酶液pH值为5.5，温度为50℃下，加入发酵酶液体积4％的壳聚糖粉末，该壳聚糖事先采用物理技术进行过预处理，酶解8hr。
8.根据权利要求1所述的一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，其特征在于，所述膜滤过程是当酶解6-8hr后，过滤去除不溶物，将滤液泵入超滤膜分离器中，膜的截留分子量为2000D，滤液中分子量大于2000D的物质返回滤液贮罐中，分子量小于2000D的透过膜进入脱色脱盐贮罐；在此过程中需向滤液贮罐补加去离子水；当透过液中壳寡糖含量极低时，停止超滤操作，并将滤液泵入纳滤膜分离器进行浓缩，作为下一批的原料投入发酵酶液中；脱色脱盐贮罐中的超滤透过液泵入纳滤膜分离器，进行脱色和脱盐，截留液返回贮罐，在此过程中不断补加去离子水，直至盐份和色度达标，停止补加去离子水，对溶液进行浓缩。
全文摘要
本发明公开了一种利用腐皮镰孢菌(Fusarium solani)生产壳寡糖的方法，该菌所产的壳聚糖酶为高效内切酶，在37℃－55℃范围内，2hr可使2％的壳聚糖溶液粘度降低90％以上，酶解8hr后，壳寡糖产率大于70％，其中10糖以下的寡糖大于90％。其生产方法包括腐皮镰孢菌(Fusarium solani)的培养、产酶发酵工艺、壳聚糖原料的物理预处理、酶解液的过滤、产物分子量分级、脱色、脱盐与浓缩、干燥。本发明采用腐皮镰孢菌(Fusarium solani)酶解壳聚糖，使产品壳寡糖中生理活性最强的6糖、7糖、8糖含量大大增加，提取采用多种膜滤技术，提高了收率和产品质量。广泛用于保健食品中。
文档编号C12P19/00GK1680569SQ20051004201
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月11日 优先权日2005年1月11日
发明者苏理, 鲍晓明, 兰文忠, 赵双枝, 董学前 申请人:苏理