专利名称：利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术、杆状病毒基因表达系统、蛋白质的纯化，尤其涉及一种利用基因工程技术在家蚕体内大量表达生产重组LF的方法。
背景技术：
人乳铁蛋白Lactoferrin(简写为LF)是由人体乳腺分泌的一种具有免疫活性的蛋白质，它由711个氨基酸组成，分子量约78KDa，是人奶中重要的铁结合性糖蛋白，初乳中LF含量约为5-7mg/ml，目前已证实LF与人的免疫机能有关，在促进铁的吸收及抗菌消炎等方面也起重要作用。因此，利用LF具有促进铁的代谢调节以及抗微生物，包括细菌、真菌和病毒等优良性能，美国已开发LF作为功能性食品添加剂以及作为消化管感染症及复合免疫不全者，如艾滋病、接受过化学疗法、放射线疗法的癌症患者等治疗的新型药剂。因此，人LF具有广阔的应用前景。但是目前市场上LF蛋白的价格昂贵，虽然用基因工程的方法在大肠杆菌中可以生产，但在大肠杆菌中LF以包含体的形式表达，需要对其重新折叠恢复其生物活性，使得该过程效率很低且不经济。为了克服这个问题，其他人曾试着用酵母和腺病毒感染的哺乳动物细胞进行表达生产，但酵母的质粒转化体不稳定而哺乳动物培养细胞生产的成本又太高。因此有必要建立一种高效经济的生产LF的方法。
杆状病毒表达系统是当今最有效的真核基因表达系统之一，而“家蚕-重组杆状病毒表达系统”由于可以利用我国饲养量最大的特色经济昆虫—家蚕作表达载体，家蚕具有个体大、易饲养等特点，因此具有生产成本低、可规模化生产等优点，适合于生物制药产业化水平的要求。申请人在此之前构建了一个适用于家蚕的优良表达系统HyNPV(专利号ZL01125605.2)，它具有扩大的寄主域的突出优点。这样，可以在AcNPV的寄主细胞Sf21中构建重组病毒，然后在家蚕幼虫中低成本、高效地生产重组蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人LF在家蚕体内基因工程生产的的方法。利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体(专利号ZL01125605.2)构建了含有人LF基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生产重组人LF。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下1、重组人LF在家蚕体内基因工程生产的方法(1)LF基因的克隆以人乳腺组织cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人LF基因，引物设计如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位点；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸2分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，获得全长为2136bp的LF基因，随后将LF基因克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆LF基因顺序正确性；(2)含有人LF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa获得重组体pBlueBacHisa-LF；然后利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体(专利号ZL01125605.2)，通过共转染获得含有人LF基因的重组病毒。共转染的方法为1μg pBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPVDNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞。先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，申请人将此重组病毒命名为HyNPV-LF；(3)家蚕体内表达和重组LF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫。将幼虫的血淋巴作为重组人LF纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边。用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3P0450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白，结果表明获得的重组LF非常纯一，从每头家蚕获得的产量高达400μg。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是本发明较好地解决了LF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达重组人LF具有成本低、产量高、生物活性强的优点。本专利建立的方法可以大量生产重组人LF，在未来的医学和临床治疗领域具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
1、研究材料基因工程操作工具酶和PCR扩增试剂盒购于宝Takara生物工程有限公司(大连)。人乳腺组织cDNA购自Clotech公司，TA克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pBlueBacHisa、脂质体lipofectin均为Invitrogen公司产品。DNA测序试剂盒购于PE Applied Biosystems。胎牛血清FCS、昆虫细胞系Sf21的培养基TC-100为GibcoBRL的产品。秋粘虫细胞系Tn-5的培养基ESF921购于Expression systems。草地贪夜蛾细胞Sf21用添加10％(v/v)FCS和0.26％细菌用胰蛋白胨的TC-100培养基在27℃培养。Tn-5利用无血清的ESF921培养基于27℃瓶中培养。本试验使用家蚕杂交种，家蚕幼虫桑叶饲养，温度为23～25℃。
2、工作流程重组人LF在家蚕体内基因工程生产的方法，其特征在于(1)LF基因的克隆以人乳腺组织cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人LF基因，引物设计如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位点；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸2分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，获得全长为2136bp的LF基因，随后将LF基因克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆LF基因顺序正确性；(2)含有人LF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa获得重组体pBlueBacHisa-LF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPVDNA同源重组产生重组病毒，共转染的方法为1μg pBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPV DNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞。先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，将此重组病毒命名为HyNPV-LF；(3)家蚕体内表达和重组LF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫。将幼虫的血淋巴作为重组人LF纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边。用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白，结果表明获得的重组LF非常纯一，从每头家蚕获得的产量高达400μg。
权利要求
1.利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法，其特征在于(1)LF基因的克隆以人乳腺组织cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人LF基因，引物设计如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位点；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸2分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，获得全长为2136bp的LF基因，随后将LF基因克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆LF基因顺序正确性；(2)含有人LF基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa获得重组体pBlueBacHisa-LF；通过共转染在昆虫细胞内与构建的杂交杆状病毒HyNPV DNA发生同源重组产生重组病毒，共转染的方法为1μgpBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPV DNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞，先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，将此重组病毒命名为HyNPV-LF；(3)家蚕体内表达和重组LF纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒HyNPV-LF进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组人LF纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边；用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白，结果表明获得的重组LF非常纯一，从每头家蚕获得的产量为400μg。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法。利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体，构建了含有人LF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组病毒的宿主，表达、生产了重组人LF。解决了LF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点。家蚕幼虫体内表达的重组人LF大部分分泌在家蚕血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取，利用亲和层析法纯化了重组的LF，从每头家蚕获得的产量高达400μg。利用基因工程技术用家蚕作为表达载体可以大量生产重组LF，为它在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。
文档编号C12N15/866GK1654647SQ20051004896
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者吴小锋, 姚慧鹏, 曹翠平 申请人:浙江大学