专利名称：构建植物病毒弱病毒株的方法
技术领域：
本发明涉及控制植物病毒病的方法，尤其涉及一种构建植物病毒弱病毒株的方法。
背景技术：
植物病毒是侵染蔬菜花卉药材和大田作物的细胞内致病的微生物，因为其按照寄主的细胞系统进行基本的代谢和复制侵染过程，因此其不能像细菌和真菌等病原微生物那样通过药物治疗达到根除效果。迄今，对植物病毒进行控制仍然没有“特效药”，控制的主要方法是预防其侵染。
实践证明预先接种弱病毒株能够干扰其后侵染的强病毒株的危害，降低其影响，达到抗病增产和改善作物品质的作用。以黄瓜花叶病毒(CMV)为例，该病毒能够侵染1,000多种植物，可经75种蚜虫传播，也是目前世界范围内寄主植物最多、分布最广、危害最严重的植物病毒之一。预防病毒传播媒介昆虫和获得无病毒繁殖材料并不是在任何情况下均能够有效实施。用弱病毒株进行预防接种的方法是行之有效的方法之一。CMV和其它一些植物病毒往往携带一种伴随侵染的亚病毒因子——卫星RNA，它们是“寄生于病毒的病毒”。CMV卫星RNA是伴随辅助病毒CMV复制的一类低分子量RNA(330-405bp)，不能独立复制。因此对于CMV卫星RNA而言，CMV就是辅助病毒；此外，烟草花叶病毒(TMV)、烟草坏死病毒(TNV)、竹子花叶病毒(BaMV)、草莓潜隐环斑病毒(SLRV)等许多植物病毒均作为辅助病毒携带卫星RNA。大多数卫星RNA能抑制辅助病毒RNAs的复制，并改变寄主植物的症状表达；卫星RNA有其特异的核苷酸序列，与辅助病毒RNA没有序列同源性。既然许多卫星RNA能抑制病毒复制，减轻病毒的症状，那么把致弱病毒的卫星RNA加入自然界流行的辅助病毒中，并预先接种待保护的植物，就可能达到防病效果。根据这一构思我国科学家组建了卫星RNA生防制剂(BCA).并于1983年在国际上首次报道了用卫星RNA防治黄瓜花叶病毒取得成功。
迄今为止，获得CMV弱病毒株的方法之一是，通过RNA的电泳分离获得纯化的卫星RNA，然后尽快将卫星RNA与CMV进行共同感染。但是，这一方法的局限在于直接通过卫星RNA的制备纯化具有许多技术困难，辟如RNA很不稳定，不容易获得一定纯度和浓度的卫星RNA，通过电泳制备难以在一个辅助病毒基因组中加入不同的卫星RNA，同时，不能通过基因修饰获得致弱效果更好的卫星。
获得弱病毒株的另一方法也是最常见的方法是在自然界筛选本身对所保护的对象作物具备侵染性，而在作物上引起的症状轻微的天然弱病毒株，通过接种保护试验，验证其保护效果和安全性，然后进行田间释放。就CMV和大部分植物病毒而言，这些天然弱病毒株多数携带卫星RNA。但是从自然界本身筛选天然弱病毒株的工作量非常大。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，以分子生物学和现代植物病理学的理论和技术为基础，提供一种构建植物病毒弱病毒株的方法，在强病毒株或普通病毒株的基因组中通过基因克隆和体外转录后添加外源卫星RNA。
一种构建植物病毒弱病毒株的方法的步骤如下1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT-PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后按照常规分子克隆方法进行测序，确定其序列；2)将全长卫星RNA的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；3)预先接种强毒株至系统寄主，2-55天，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，获得假重组；或者将转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，与辅助病毒的总RNA或从强病毒株侵染的植株组织中提取的总RNA，同时接种敏感的系统寄主，获得假重组。假重组后1-20天，取接种叶扩大接种，获得具备一个或者多个卫星RNA的弱病毒株。
另一种构建植物病毒弱病毒株的方法的步骤如下1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT-PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后按照常规分子克隆方法进行测序，确定其序列；2)在进行卫星RNA转录前，在DNA水平上对卫星RNA之cDNA序列进行点突变，获得卫星RNA因子；3)将上述经点突变改造获得的卫星RNA的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；4)预先接种强毒株至系统寄主，2-55天，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，获得假重组；或者将转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，与辅助病毒的总RNA或从强病毒株侵染的植株组织中提取的总RNA，同时接种敏感的系统寄主，获得假重组。假重组后1-20天，取接种叶扩大接种，获得具备一个或者多个卫星RNA的弱病毒株。
本发明的优点本发明的方法不仅可以大大提高筛选植物病毒弱病毒株的速度，同时，还使得一些难以达到的目标得以实现，尤其是通过在cDNA水平上的卫星RNA序列改造，可以获得性状更优的卫星RNA变异株，提高卫星RNA介导的弱病毒保护效果。弱病毒保护的番茄“乌心果病”和类似病症的发病率低于3％；非保护番茄“乌心果病”和类似病症的发病率高于30％，番茄果实品质明显提高。
具体实施例方式
本发明方法的具体实施方案包括以下步骤(1)根据序列分析软件Genestar分析确定植物病毒卫星RNA两端保守序列，根据引物设计软件Primer five设计PCR引物，进行RT-PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后按照常规分子克隆方法进行测序，确定其序列；(2)将全长卫星RNA的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；(3)在进行卫星RNA转录前，可根据需要和设计，事先在DNA水平上对卫星RNA之cDNA序列进行点突变，获得致弱效果更为理想的卫星RNA因子。对序列的改造既可以是碱基的插入，也可以是碱基的缺失(或序列删除)，也可以是序列的替换。
(4)预先接种强毒株至系统寄主，2-55天，在接种叶或邻近叶片上，再接种体外转录的卫星RNA转录产物获得假重组，假重组后1-20天，取接种叶扩大接种。然后通过测定系统叶组织中的dsRNA，或通过RT-PCR等分子生物学方法确定假重组结果和新病毒株的稳定性。
也可以选择将转录的卫星RNA与辅助病毒的总RNA，或从强病毒株侵染的植株组织中提取的总RNA同时接种敏感的系统寄主，假重组后1-20天，优选2-6天取接种叶扩大接种到其它系统寄主上获得新的弱病毒株。
根据需要可以在一个辅助病毒基因组中通过假重组整合多个卫星RNA在一个辅助病毒基因组中用卫星RNA转录和体外重组方法，同时加入2-20种卫星RNA，可获得同时具备多个卫星RNA的弱病毒株。
(5)本发明采用的鉴定假重组效果的dsRNA检测方法是根据CF11纤维素在11-18％乙醇含量的溶液中对双链RNA特异性吸附特征，进行亲和层析的制备和纯化辅助病毒和卫星RNA特异的dsRNA阶段，用凝胶电泳检测条带的大小；一般每个样品用0.5-5克系统侵染的植物材料。
(6)将获得的假重组毒株在扩大的寄主植物，包括模式植物和多种经济作物上，筛选鉴定，确定假重组毒株是弱致病或非致病的毒株，并进一步确定其安全性。
(7)当新病毒株的弱病毒保护效果不够理想或其它条件需要时，在已经获得的假重组病毒株的基础上，可以进一步添加其它序列和大小的致弱卫星RNA，以获得更为理想的弱病毒株。
(8)对新毒株在不同的寄主植物上应用，获得抗病增产和改善品质的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1以黄瓜花叶病毒(CMV)半夏分离物CMV-BX为强病毒株，以一株来自十字花科白菜的卫星RNA YI(339nt)为卫星RNA因子，采用T7体外转录系统和重组来获得携带卫星RNA假重组CMV弱病毒株。其PCR上游引物为5’＞TAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTTGATGG＜3’；其反向引物为5’＞GGGTCCTGTAGAGGAATGTG＜3’。首先在CMV系统寄主(心叶烟)上接种不含卫星RNA的CMV-BX，4天后用卫星RNA转录产物对接种叶片进行二次接种，2天后将接种叶组织，匀浆后转接其他心叶烟，25℃下，培养7天后通过提取病毒ds-RNA确认重组效果，获得对半夏CMV有保护作用的弱病毒株CMV-BXs1。
实施例2以黄瓜花叶病毒(CMV)半夏分离物CMV-BX为强病毒株，以一株来自十字花科白菜的卫星RNA YI(339nt)为卫星RNA因子，首先在卫星RNA的cDNA水平上，采用易错PCR方法进行突变研究，获得一株新的336nt的卫星RNA的cDNA克隆，利用T7体外转录系统来获得新的卫星RNA转录产物，将其接种在预先侵染CMV-BX的系统寄主(心叶烟)上，2天后将接种组织匀浆后转接其他心叶烟，25℃下，7天后通过提取病毒ds-RNA检测确认重组效果，获得对半夏CMV有保护作用的携带卫星RNA人工突变株的弱病毒株CMV-BXs2。
实施例3.
以烟草花叶病毒(TMV)番茄分离物为强病毒株，以一株来自烟草的TMV卫星RNA为卫星RNA因子，采用T7体外转录系统来获得携带卫星RNA假重组TMV弱病毒株。先在TMV系统寄主(番茄)上接种不含卫星的TMV，2天后用卫星RNA转录产物对接种叶片进行二次接种，2天后将接种组织匀浆后转接更多番茄植株，25℃下，7天后通过提取病毒ds-RNA检测确认重组效果，获得对番茄TMV有保护作用的弱病毒株TMV-s。
实施例4.
以黄瓜花叶病毒(CMV)番茄分离物CMV-FQ为强毒株，以一株来自十字花科白菜的卫星RNA-YI(339nt)和一株来自茄科辣椒的卫星RNA-Yns(368nt)为卫星RNA因子。先在CMV系统寄主(心叶烟)上接种不含卫星RNA的CMV-FQ；接种2天后，采用T7体外转录系统获得两株卫星RNA的全长RNA转录产物，对接种叶进行二次接种，2天后将接种组织匀浆后转接更多的系统寄主植株(心叶烟、番茄、西葫芦等)，25℃下培养，7天后通过提取病毒ds-RNA检测确认重组效果，获得对番茄CMV有保护作用的携带有两株卫星RNA因子的弱病毒株CMV-FQss。
实施例5以黄瓜花叶病毒(CMV)番茄分离物CMV-FQ为强毒株，以一株来自十字花科白菜的卫星RNA-YI(339nt)为卫星RNA因子。先在系统寄主(心叶烟)上不含卫星RNA的CMV-FQ，接种5天后，提取接种组织的总RNA；将其与采用T7体外转录系统获得的卫星RNA-Yns的全长RNA转录产物混合，接种于系统寄主植株上；2天后将接种组织匀浆后转接更多的系统寄主植株(心叶烟、番茄、西葫芦等)，25℃下培养，7天后通过提取病毒ds-RNA检测确认重组效果，获得对番茄CMV有保护作用的携带有卫星RNA-YI的弱病毒株CMV-FQs。
实施例6以弱病毒株CMV-BXs为CMV毒株，以一株来自茄科辣椒的卫星RNA-Yns(368nt)为卫星RNA因子。先在系统寄主(心叶烟)上接种含卫星RNA-YI的CMV-BXs；接种2天后，采用T7体外转录系统获得卫星RNA-Yns的全长RNA转录产物，对接种叶进行二次接种，2天后将接种组织匀浆后转接更多的系统寄主植株(心叶烟、番茄、西葫芦等)，25℃下培养，7天后通过提取病毒ds-RNA检测确认重组效果，获得对半夏CMV有保护作用的携带有两株卫星RNA因子的弱病毒株CMV-BXss。
实施例7，在分离自烟草的CMV坏死株系YNs1添加1个卫星RNA(343nt)，获得弱病毒株Y1s的抗病毒效果是病情指数下降33％，小区试验显示产量增加16--23％；进一步添加334~396nt的卫星RNA19个，其中11个卫星RNA能够稳定共存，获得新的弱病毒株Y11s的接种试验显示其病情指数下降63％以上，小区试验显示产量增加28~123％。
实施例8，在半夏脱病毒快繁过程中，先获得脱病毒种苗，然后接种人工构建的弱病毒株CMV-BXss，再将携带弱病毒株的半夏通过组培快繁扩大，获得工厂化生产的抗CMV半夏种苗。2年栽培试验显示100％的携带弱病毒株的扩繁苗均携带CMV，但是，没有形成明显症状；对照(无病毒种苗)在栽培2年后基本上都表现病毒侵染症状；弱病毒病害种苗产量高于不保护种苗60％以上，半夏品质明显提高。
实施例9，将CMV弱病毒FQss和TMV弱病毒TMV-s同时接种番茄幼苗，40天后进入大田栽培，弱病毒保护番茄“乌心果病”和类似病症的发病率低于3％；非保护番茄“乌心果病”和类似病症的发病率高于30％，番茄果实品质明显提高。
对照例1以黄瓜花叶病毒(CMV)半夏分离物CMV-BX为强病毒株，以一株来自十字花科白菜的卫星RNA YI(339nt)为卫星RNA因子，采用直接分离卫星RNA来获得携带卫星RNA假重组CMV弱病毒株。首先在CMV系统寄主(心叶烟)上接种含卫星RNA的CMV-YI，接种5天后提取组织总RNA，进行RNA电泳分离卫星RNA，割胶回收卫星RNA；用卫星RNA回收产物在接种CMV-BX 4天的心叶烟上对接种叶片进行二次接种，2天后将接种叶组织，匀浆后转接其他心叶烟，25℃下，培养7天后通过提取病毒ds-RNA确认重组效果。经重复实验证实未获得对半夏CMV有保护作用的弱病毒株CMV-BXs1，组织中侵染有原辅助病毒CMV-YI。以电泳分离CMV中的卫星RNA，其活性的保持具有一定的难度，完全与基因组的分离也需要较高的技术性，其工作的难度较体外重组系统要大得多。
对照例2自然分离携带卫星RNA的CMV分离物作为弱毒株，自2003年3月-2004年1月，每周采集田间具有明显CMV侵染症状的茄科样品8株，通过提取病毒ds-RNA确认是否存在携带卫星RNA的CMV分离物，共获得携带卫星RNA的CMV分离物四株，对其进行病毒分离鉴定后，实验室仅保存有三株分别携带有卫星RNA的CMV分离物CMV-YI；CMV-LJ；CMV-TJ；其中仅CMV-YI具有明显的弱毒病症，而其他两株卫星RNA的存在并无致弱效果。分离纯化工作长达一年，工作量非常之大，其工作效率较体外重组系统要低得多。
权利要求
1.一种构建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于方法步骤如下1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT-PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后按照常规分子克隆方法进行测序，确定其序列；2)将全长卫星RNA的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；3)预先接种强毒株至系统寄主，2-55天，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，获得假重组；或者将转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，与辅助病毒的总RNA或从强病毒株侵染的植株组织中提取的总RNA，同时接种敏感的系统寄主，获得假重组。假重组后1-20天，取接种叶扩大接种，获得具备一个或者多个卫星RNA的弱病毒株。
2.根据权利要求1所述的一种构建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述设计的PCR引物分为上游引物和下游引物，上游引物为5’>TAAGCTTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNN<3’，其中TAAGCTTAATACGACTCACTATA为T7启动之序列，紧随其后的是1-2个G；N为所需要转录的卫星RNA对应序列，其长度为3-30；进行卫星RNA转录的下游引物为卫星RNA的反向引物。
3.一种构建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于方法步骤如下1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT-PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后按照常规分子克隆方法进行测序，确定其序列；2)在DNA水平上对卫星RNA之cDNA序列进行点突变，获得卫星RNA因子；3)将上述经点突变改造获得的卫星RNA的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；4)预先接种强毒株至系统寄主，2-55天，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，获得假重组；或者将转录的1种或2-20种卫星RNA转录产物，与辅助病毒的总RNA或从强病毒株侵染的植株组织中提取的总RNA，同时接种敏感的系统寄主，获得假重组。假重组后1-20天，取接种叶扩大接种，获得具备一个或者多个卫星RNA的弱病毒株。
4.根据权利要求3所述的一种构建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述cDNA序列进行点突变是碱基的插入、碱基的缺失、序列删除或序列的替换。
5.根据权利要求3所述的一种构建植物病毒弱病毒株的方法，其特征在于在所述设计的PCR引物分为上游引物和下游引物，上游引物为5’>TAAGCTTAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNN<3’，其中TAAGCTTAATACGACTCACTATA为T7启动之序列，紧随其后的是1-2个G；N为所需要转录的卫星RNA对应序列，其长度为3-30；进行卫星RNA转录的下游引物为卫星RNA的反向引物。
全文摘要
本发明公开了一种构建植物病毒弱病毒株的方法。步骤如下1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT－PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后进行测序，确定其序列；2)将全长卫星RNA的cDNA或者序列改造后的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；3)预先接种强毒株至系统寄主，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的卫星RNA转录产物获得假重组，假重组后，取接种叶扩大接种，获得具备卫星RNA的弱病毒株。本发明的方法大大提高筛选植物病毒弱病毒株的速度，通过在cDNA水平上的卫星RNA序列改造，可以获得性状更优的卫星RNA变异株，提高卫星RNA介导的弱病毒保护效果，明显提高果实品质。
文档编号C12N7/01GK1654638SQ20051004895
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月12日 优先权日2005年1月12日
发明者陈集双, 竺锡武, 金波, 廖乾生, 商晗武, 陈海敏 申请人:浙江理工大学