专利名称：表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和细胞遗传学领域，尤其涉及一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法。本发明具有深远的研究性和广泛的应用性，包括用于研究宿主细胞免疫反应具有稳定性及可表达所需蛋白的哺乳动物细胞的永生化。
背景技术：
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种以损害鸡中枢免疫器官-法氏囊淋巴滤泡未成熟细胞为特征的急性高度接触性免疫抑制性传染病。1957年Cosgrove在美国Delaware的Gamboro镇首先发现此病，1962年Winterfield分离鉴定出IBDV。该病在美国及世界各国均有发生和流行。88-92年IBD在我国大面积爆发，发病率和死亡率高达30-70％，造成了巨大的经济损失。近年来，IBD的发生和流行出现了新的特征，即由临床感染转化为以亚临床感染为主、死亡率降低、免疫抑制作用增强。
IBDV病毒基因组为dsRNA，编码VP1、VP2、VP3、VP4、VP5共5种蛋白，除VP1由B片段编码外，余者均由A片段编码。其中VP2、VP3是病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳的主要成分。VP2具有一个构象依赖性(不连续)的中和抗原决定簇，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染(变异株和超强毒株除外)，故一般认为VP2是病毒的宿主保护性抗原；VP3具有一个非构象依赖性(连续)的抗原决定簇，是病毒群特异性抗原。VP4是一种具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟过程中起着重要作用。L512A↓A513和M755A↓A756分别对于VP2-VP4和VP4-VP3的剪切是必需的，但是VP4在翻译中和翻译后加工过程中会因其结构和拓扑学变化而行使功能。基因组A节段中大ORF上游并与之部分重叠的另外小ORF A编码非结构蛋白(NP)，即VP5蛋白。VP1是RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)，与病毒dsRNA复制有关，同时还具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法。
它的步骤如下1)自传染性法氏囊病毒浙江分离株(NB)的鸡胚成纤维细胞(CEF)适应毒中用蛋白酶K消化法抽提病毒dsRNA，长距离一步法RT-PCR扩增病毒全长cDNA，并以此为模板PCR扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI-neo构建表达质粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，经42℃热击转化CaCl2法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞；2)用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5OD600值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，各重组质粒经Opti-MEM稀释后在Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞；4)在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；5)单克隆化细胞经PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。
本发明制备的表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞，容易培养，增殖快速，可无限扩大，性质稳定，易保存，研究方便。方法技术成熟，重复性强，一般研究人员就可完成。
图1是传染性法氏囊病毒基因组及编码蛋白的物理图谱；图2是真核细胞表达载体pCI-neo的质粒图谱；图3是IBDV A片段编码基因的PCR扩增电泳图；图4是IBDV系列VP2截断体克隆化细胞的RT-PCR电泳图；图5是IBDV VP5基因克隆化细胞系的Southern blot图；图6是IBDV编码基因克隆化细胞Northern blot图；图7是IBDV编码基因克隆化细胞IFA/IPMA图。
具体实施例方式
表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法的步骤如下1、传染性法氏囊病毒全长cDNA的克隆用9-11日龄SPF种蛋制备鸡胚成纤维细胞，培养至单层，接种传染性法氏囊病毒浙江分离株(NB)细胞适应毒，继续培养96小时，收集含病毒的细胞液，经过复冻融3次，14000rpm，4℃，离心5min；取上清，35000rpm，4℃，超离心2.5小时；将沉淀悬浮于适量TEN溶液，再经过40-60％蔗糖密度梯度，40000rpm，4℃，离心2小时，获得纯化的IBD病毒粒子。取50μl含病毒的蔗糖溶液在含0.5％SDS条件下，加入20mg/ml蛋白酶K直至终浓度为1mg/ml，置50℃消化3小时后，酚/氯仿抽提病毒RNA，RT扩增IBDV A或B节段cDNA，核苷酸序列序列如下IBDV A核苷酸序列GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTCACCCGGGGACAGGTCGCCAAGGCCTTGTTCCAGGATGGAACTCCTCCTTCTATAACGCTATCATTGATGGTCAGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCAACAGATTGTTCCGTTCATGCGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGACACCCTGGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGGGACACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGCTCAATTGTGGGTGCTCACTACACACTGCAGAGCAATGGGAACTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAACCTACCGGCCAGTTACAACTACTGCAGGCTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAGGTCAAGCACACTTCCTGGTGGCGTTTATGCACTAAACGGCACCATAAACGCCGTGACCTTCCAAGGAAGCCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTTGATGTCTGCAACAGCCAACATCAACGACAAAATTGGGAACGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTCACCGTCCTCAGCTTACCCACATCATATGATCTTGGGTATGTGAGGCTTGGTGACCCCATTCCCGCAATAGGGCTTGACCCAAAAATGGTAGCCACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGATGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAACCAGGTGGGGTAACAATCACACTGTTCTCAGCCAACATTGATGCCATCACAAGCCTCAGCGTTGGGGGAGAGCTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCATGGCCTTGTACTGGGCGCCACCATCTACCTCATAGGCTTTGATGGGACAGCGGTAATCACCAGGGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGACCGGCACCGACAACCTTTTGCCATTCAATCTTGTGATTCCAACAAACGAGATAACCCAGCCAATCACATCCATCAAACTGGAGATAGTGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCAGGGGATCAGATGTCATGGTCCGCAAGAGGGAGCCTAGCAGTGACGATCCATGGTGGCAACTATCCAGG
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3、一系列重组传染性法氏囊病毒基因的质粒转染Vero细胞及相应的单克隆细胞系的建立用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5 OD600值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；在转染实验前一天在24孔培养板接种细胞，用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium培养基进行培养，转染当天细胞应达到90-95％融合并融合；混合好溶液A和溶液B，①溶液A用Opti-MEM稀释DNA(pCI-neo、相应的重组传染性法氏囊病毒基因的pCI-neo)各0.8-1.0μg到总体积50μl。②溶液B用Opti-MEM稀释2μl脂质体Lipofectamine2000到终容积50μl。③混合溶液A和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育30min，将100μl脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)逐滴加入对应孔，边加边轻摇培养板；5％CO237℃孵育24小时后，消化并进行细胞计数，用极限稀释法克隆单细胞，并改用含500μg/ml浓度G418的培养基培养；在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养。
4、单克隆细胞系基因组DNA的PCR扩增及Southern blot检测扩大培养每个克隆细胞，用胰酶消化后再离心收集细胞，重新悬浮于预冷的PBS，漂洗2次，用7.5倍细胞容积的细胞裂解液(6M盐酸胍，0.1M NaAc，pH5.5)悬浮细胞，将离心管固定于多角度摇匀器上，于室温慢速摇动1小时；在一新离心管中加入3倍细胞裂解液体积的无水乙醇，然后小心将细胞裂解物铺于乙醇之上；用一带钩的玻璃棒在裂解液与乙醇交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA将挂在玻璃棒上，继续搅拌直到裂解液与乙醇完全混匀；将缠绕的DNA的玻璃棒重新浸入1个含5ml乙醇的离心管中，室温下浸泡2分钟；将缠绕的DNA的玻璃棒放在1张保水蜡膜上，室温将乙醇蒸发；再将缠绕的DNA的玻璃棒重新浸入1个含5ml乙醇的离心管中，室温下浸泡2分钟，重复上一步骤；将玻璃棒浸入含0.5ml TE(pH8.0)的离心管中，4℃下过夜，使DNA吸水膨胀，便于与玻璃棒分离；过夜后，将胶状DNA从玻璃棒上分离下来。(参考Sambrook and Russell主编的分子克隆实验指南(第三版))。取1μl基因组DNA稀释50倍后做模板PCR扩增相应的目的基因(见图3)。
用限制性内切酶消化10μg基因组DNA样品；在1V/cm的电压下进行琼脂糖凝胶电泳；完毕后，琼脂糖凝胶经0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤，变性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)使DNA变性，中和液(0.5mol/L Tris-HCl，1.5mol/LNaCl)使之中和；裁尼龙膜预先用蒸馏水浸湿后用20×SSC浸泡；安装转移装置，上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸(Whatman 3MM)，平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，赶出滤纸中所有气泡；将凝胶面向下倒扣在滤纸上，凝胶与滤纸间无气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中(虹吸短路)；三张大小合适20×SSC浸湿的3MM滤纸铺在滤膜表面；放一叠干燥的吸水纸(约5～8cm高)，置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约0.75～1kg的物体；确保槽内有足够的20×SSC，通过毛细管原理转移DNA，转移12-16h；完毕，拆卸印迹装置，将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上，凝胶在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，撕去凝胶；5×SSC漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹，在干燥滤纸上稍微晾干后，经80℃高温烘烤2小时，使DNA固定于滤膜上，用相应的α-32P标记的DNA探针在Church & GilbertHybridization buffer体系中杂交16-18小时，洗膜，将尼龙膜压于磷屏下曝光以获得放射自显影影像，经Typhoon9200检测仪对放射信号进行检测(见图5)。
5、单克隆细胞系总RNA的RT-PCR扩增及Northern bloting检测每个克隆细胞扩大培养，按10cm2贴壁细胞1ml比例加入Trizol抽提液，摇动使其匀浆，室温下放置5分钟，将抽提液移入离心管；按1ml Trizol加200μl氯仿比例加氯仿，剧烈摇荡15sec，于室温放置2-3分钟；于4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液于一新离心管中，加入600μl的异丙醇，颠倒混匀；室温放置10分钟；于4℃，12000rpm离心10分钟，弃去上清液；加1ml 75％酒精轻洗RNA沉淀，重复1次；4℃，7500rpm离心5分钟，弃去上清，室温干燥，溶解在30μl DEPC处理的水中。取1μg总RNA用于RT-PCR扩增相应的目的基因(见图4)。
取20μg样品总RNA加入20μl灭菌的并经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液，70℃处理10min后置冰上；制备甲醛变性胶凝胶并预电泳5min，电压为5V/cm，随后将样品加至凝胶加样孔；3-4V/cm电压下电泳至溴酚蓝迁出凝胶2/3，电泳结束；用DEPC处理水漂洗凝胶数次，除去甲醛，0.05mol/L氢氧化钠浸泡，无RNA酶的水淋洗凝胶，并用20×SSC浸泡凝胶后，裁尼龙膜预先用蒸馏水浸湿后用20×SSC浸泡；安装转移装置，上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸(Whatman 3MM)，平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，赶出滤纸中所有气泡；将凝胶面向下倒扣在滤纸上，凝胶与滤纸间无气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中(虹吸短路)；三张大小合适20×SSC浸湿的3MM滤纸铺在滤膜表面；放一叠干燥的吸水纸(约5～8cm高)，置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约0.75～1kg的物体；确保槽内有足够的20×SSC，通过毛细管原理转移DNA，转移12-16小时；完毕，拆卸印迹装置，将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上，凝胶在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，撕去凝胶；6×SSC漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹，在干燥滤纸上稍微晾干后，经80℃高温烘烤2小时，使DNA固定于滤膜上，用相应的α-32P标记的DNA探针在Church & Gilbert Hybridization buffer体系中杂交16-18小时，洗膜，将尼龙膜压于磷屏下曝光以获得放射自显影影像，经Typhoon9200检测仪对放射信号进行检测(见图6)。
6、单克隆细胞系的传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的表达检测将单克隆细胞接种于96孔细胞培养板，等细胞长成单层后，移去培养液，用PBS清洗，细胞在-20℃下，用100μl等量丙酮和甲醇的混合液中渗透和固定45min，室温晾干；在37℃下，细胞用200μl 5％奶粉液中，孵育90min；用含0.25％Tween 20的100μl PBS(PBST)清洗三次；每孔加入50μl用含3％奶粉、0.05％Tween 20的PBS(即PBS-M-T)稀释成适当浓度的一抗，37℃下孵育60-90min；PBST清洗三次；HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG，孵育60-90min；PBST清洗三次；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，阳性细胞呈橙红色，后者直接在倒置荧光显微镜下观察，阳性细胞发绿色荧光。
本发明运用重组DNA技术、细胞重组技术，采用反转录PCR方法得到了传染性法氏囊病毒A节段cDNA，以之为模板扩增构建了一系列表达编码蛋白的真核表达载体，经脂质体Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞，在G418抗性压力和96孔极限稀释法克隆抗性单细胞，运用RT-PCR、Southern bloting和Northern bloting技术证实传染性法氏囊病毒外源基因已经成功转染进Vero细胞，并整合到细胞基因组中，在mRNA水平转录，通过IFA/IPMA证实传染性法氏囊病毒外源基因表达蛋白在细胞内表达。
本发明将参照附图在下列实施例中做进一步描述。这些实施例展示的是在G418压力下表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的永生化细胞系的建立，具有遗传稳定性。
实施例11、寡核苷酸引物的设计与合成根据GenBank中注册的鸡传染性法氏囊病毒A节段核苷酸序列(X84034)，设计1对半RT-PCR引物上游引物5’-GGAATTCGGATACGATCGGTCTGACCCCGG-3’下游引物15’-GGGGACCCGCGAACGG-3’(RT)下游引物25’-TTACTGAAATTTATTAAATATCATCTA-3’(PCR)根据GenBank中不同IBDV毒株基因组B片段核苷酸序列，设计并合成了下列RT-PCR引物上游引物B15’-GGAATTCGGATACGATGGGTCTGACCCT-3’下游引物B25’ATTTCTAGAGGGGGCCCCCGCAGGCGAA-3’2、传染性法氏囊病毒的RNA的提取用9-11日龄SPF种蛋制备鸡胚成纤维细胞，培养至单层，接种IBDV-NB毒株细胞适应毒，继续培养96小时，收集病毒液，经过复冻融3次，14000rpm，4℃，离心5min；取上清，35000rpm，4℃，超离心2.5小时；将沉淀悬浮于适量TEN，再经过40-60％蔗糖密度梯度，40000rpm，4℃，离心2小时，获得纯化的IBD病毒粒子。取50μl含病毒的蔗糖溶液在含0.5％SDS条件下，加入20mg/ml蛋白酶K直至终浓度为1mg/ml，置50℃消化3小时后，酚/氯仿抽提病毒dsRNA。
3、传染性法氏囊病毒A片段全长cDNA合成病毒dsRNA和不含酶切位点的下游引物1在98℃变性5分钟使双链RNA解链，立即放置冰上，在50℃条件下加入(5×First-Strand Buffer，0.1M DTT，dNTP)混合液，利用SuperscriptII酶反转录合成全长cDNA，经RNase H除去杂交链的RNA后，用位于病毒基因组非编码区(NCR)两端的上游引物和下游引物2一步扩增出IBDV A节段的片段(3.3Kb)。割胶回收PCR产物，PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌Top10，经蓝白斑筛选、酶切和PCR鉴定重组质粒。步行法测定A片段的核苷酸序列。
4、传染性法氏囊病毒B片段全长cDNA合成采用上海生工反转录试剂盒(RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase)进行。冰上将IBDV dsRNA和引物B2混合均匀，于95℃作用3min使RNA充分变性，迅速置冰上2min。加入反转录混合液(含5×RT buffer，20U Ribonucleaseinhibitor，1mM dNTP)，在反转录酶的作用下，45℃反转录合成B节段全长cDNA，经RNase H除去杂交链的RNA后，用位于病毒基因组B节段非编码区(NCR)两端的引物B1和引物B2一步扩增出IBDV B节段的全长片段(2.8Kb)。割胶纯化PCR产物。纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，经蓝白斑筛选，酶切和PCR鉴定重组质粒。步行法测定B片段的核苷酸序列。
实施例21、IBDV基因组A节段在真核表达细胞系的建立在一步法RT-PCR克隆IBDV A全长cDNA的基础上，构建包括两端非编码区的完整的A片段的真核表达载体pCI-neo-A(载体图谱见图1)。重组pCI-neo-A转化大场杆菌Top10。挑取含目的基因的单菌落，37℃振荡培养至OD600为1.0-1.5，超纯化pCI-neo-A质粒。取0.8-1μg重组质粒在2μl Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的单层Vero细胞。转染后1天，消化细胞并计数，采用极限稀释，制备约10个细胞/ml的细胞悬液(含G418的MEM培养基)，铺若干块96孔板，待细胞贴壁后，在显微镜下观察，标记好单个细胞孔。每隔3-4天换液，大约两周至三周后，可以看到扩长的单克隆细胞成团状成长，然后将细胞消化逐级扩大培养。对于不能确定为单细胞的克隆孔必要时按同样方法进行第二次克隆。pCI-neo-A在通过连续两次克隆获得3个单细胞7B4、9B4、9C4。
2、IBDV多聚蛋白VP243在真核表达细胞系的建立BDV A全长cDNA为模板，通过上游引物5’-CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’和下游5’-GCGCGCGGCCGCTCACTCAAGGTCCTCATCAG-3’PCR扩增IBDV大ORF编码的由1012个氨基酸组成的多聚蛋白基因片段，其他质粒纯化、转染、单细胞克隆的方法步骤同上，两次克隆获得三个表达IBDV VP2蛋白的细胞系4G8、3C4和3C6。
3、表达IBDV VP5蛋白的细胞株的建立以IBDV A全长cDNA为模板，通过上游引物5’-CCGGAATTCATGGTTAGTAGATATCAGACAAACG-3’和下游引物5’-GATCGTCGACTCACTCAGGCTTCCTTGGAAGGTC-3’扩增IBDV小ORF编码的含145个氨基酸的完整VP5基因，并定向克隆到pCI-neo载体，通过重组质粒超纯纯化(High purity Plasmid Miniprep System)后，在Lipofectamine2000介导下转染90-95％融合的单层Vero细胞，在G418抗性筛选下，通过96孔极限稀释法，克隆获得相应的单克隆细胞。一次单克隆在筛选获得8个阳性克隆，分别为B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4，二次单克隆获得2F11阳性克隆。
4、VP2以及VP2(CΔ60)、VP2(CΔ25)、VP2(CΔ18)、VP2(CΔ11)4个截短突变体编码蛋白的细胞株的建立表1扩增一系列不同长度VP2基因的引物
以IBDV A全长cDNA为模板，运用上述引物组合，扩增并构建了5个不同VP2基因片段载体，即pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)。其他质粒纯化、转染、单细胞克隆的方法步骤同上(1)pCI-neo-VP2(CΔ60)一次单克隆在筛选获得8个阳性克隆，分别为B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4，二次单克隆获得7C5阳性克隆。
(2)pCI-neo-VP2(CΔ25)通过连续两次克隆获得到3E5、4C7、3D3、4B11阳性克隆。
(3)pCI-neo-VP2(CΔ18)连续两次克隆的基础上获得5G3、5D9 2个阳性克隆。
(4)pCI-neo-VP2(CΔ11)连续两次克隆一个阳性克隆5C1。
(5)pCI-neo-VP2通过连续两次筛选到阳性3B2、3B3、3D2、3E2、3C4 5个。
5、表达IBDV VP3蛋白的细胞株的建立以IBDV A全长cDNA为模板，通过上游引物5’-CCGGAATTCATGGCATCAGAGTTCAAAGAG-3’和下游引物5’-GCGCGCGGCCGCTCACTCAAGGTCCTCATCAG-3’扩增IBDV VP3蛋白编码基因，上游引物中自带ATG使VP3的ORF完整。其他质粒纯化、转染、单细胞克隆的方法步骤同上。一次单克隆获得5个阳性细胞系D2、D7、G9、F4、F6。
6、表达IBDV VP1蛋白的细胞株的建立以IBDV B节段全长cDNA为模板，通过VP1基因上游引物5′-CCGGAATTCATGAGTGACATFTTCAACAGT-3’和下游引物5’-AATCTCGAGTCATGGCTGTTGGCGGCTCTCC-3’PCR扩增IBDV B节段ORF编码的由879个氨基酸组成的RdRp蛋白基因片段，其他质粒纯化、转染、单细胞克隆的方法步骤同上，一次单克隆获得6个表达IBDV VP1蛋白的阳性细胞系B10、C2、C10、D7、D9和E12。
实施例31、单克隆细胞系的PCR鉴定扩繁后的各个单克隆细胞经细胞裂解液(6M盐酸胍，0.1M NaAc，pH5.5)法提取细胞基因组DNA，经ddH2O 50倍稀释后做PCR模板扩增相应的目的基因，体系如下1μl稀释后的模板，5μl 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μl 10mM dNTPMix，0.5μl TaqPlus，各1μl 12μM相应的上下游引物，加水至50μl体系。反应条件95℃预变性2min，95℃变性15s，(58-61℃)退火15s，72℃延伸Xmin(根据扩增序列大小，按1分钟合成1000bp计算)，共30个循环，72℃再延伸10min。取5μl PCR产物跑电泳，观察(见图3以1-5号样品为例，分别为pCI-neo-VP2-3E2、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5，其他克隆省略)。
2、单克隆细胞系的Southern blot鉴定单克隆细胞样品基因组DNA抽提；限制性内切酶消化；1V/cm电压下琼脂糖凝胶电泳；凝胶经DNA脱嘌呤、变性、中和处理；将DNA转移到带正电的尼龙膜；探针标记(TaKaRa的Random Prime DNA Labeling Kit Ver.2)；0.5MNa2HPO4平衡膜，Church & Gilbert Hybridization buffer预/杂交；洗膜；磷屏对滤膜曝光以获得放射自显影影像；Typhoon9200检测仪(Apharmacia公司)对放射信号进行检测(见图5以样品pCI-neo-VP5-2F11为例，1号为阴性对照，2号为阳性对照，其他克隆省略)。
3、单克隆细胞系的Northern blot鉴定单克隆细胞样品总RNA抽提(Trizol法)；3-4V/cm电压下甲醛变性凝胶电泳；凝胶经DEPC处理水漂洗、0.05mol/L氢氧化钠浸泡、20×SSC浸泡处理；将DNA转移到带正电的尼龙膜；探针标记(TaKaRa的Random Prime DNALabeling Kit Ver.2)；0.5M Na2HPO4平衡膜，Church & Gilbert Hybridization buffer预/杂交；洗膜；磷屏对滤膜曝光以获得放射自显影影像；Typhoon9200检测仪(Apharmacia公司)对放射信号进行检测(见图6以1-15号样品为例扩增VP2内的高变区450bp大小片段，分别为pCI-neo-VP2-3D2、pCI-neo-VP2-3B3、pCI-neo-VP2-3C4、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(CΔ25)-4C7、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5、pCI-neo-VP2(Δ60)-C12、pCI-neo-VP2(Δ60)-D8、pCI-neo-A-9C4、pCI-neo-A-7B4、pCI-neo-VP243-4G8、pCI-neo-VP243-3C4、pCI-neo-VP5-2F11，其他克隆省略)。
4、单克隆细胞系的RT-PCR鉴定Trizol法抽提各个单克隆细胞样品总RNA，使用特异性引物反转录合成目的基因的cDNA，体系步骤如下1μg Total RNA，1μl 12μM相应的特异性下游引物，补DEPC处理水至12μl，70℃变性5min，冰上放置2min，加入混合液(4μl5×Reaction Buffer，1μl Ribonuclease inhibitor，2μl 10mM dNTP Mix)，37℃孵育5min，加入1μl 200U/μl的M-MuLV transcriptase，42℃孵育60min，70℃灭活10min，直接用PCR。PCR体系1μl cDNA反应液，5μl 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1μl 10mM dNTP Mix，0.5μl TaqPlus，各1μl 12μM相应的上下游引物，加水至50μl体系。反应条件95℃预变性2min，95℃变性15s，(58-61℃)退火15s，72℃延伸Xmin(根据扩增序列大小，按1分钟合成1000bp计算)，共30个循环，72℃再延伸10min。取5μl PCR产物跑电泳，观察(见图4以1-17号样品为例扩增VP2内的高变区450bp大小片段，分别为pCI-neo-VP2-3E2、pCI-neo-VP2-3D2、pCI-neo-VP2-3B3、pCI-neo-VP2-3C4、pCI-neo-VP2(CΔ11)-5C1、pCI-neo-VP2(CΔ18)-5D9、pCI-neo-VP2(CΔ25)-3E5、pCI-neo-VP2(CΔ25)-4C7、pCI-neo-VP2(Δ60)-7C5、pCI-neo-VP2(Δ60)-C12、pCI-neo-VP2(Δ60)-D8、pCI-neo-A-9B4、pCI-neo-A-9C4、pCI-neo-A-7B4、pCI-neo-VP243-4G8、pCI-neo-VP243-3C6、pCI-neo-VP243-3C4，其他克隆省略)。
实施例41、IBDV-A单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞按适当浓度接种于96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，移去培养液，用PBS清洗，细胞用100μl等量丙酮和甲醇的混合液在-20℃渗透和固定45min，室温晾干；在37℃下，细胞用200μl 5％奶粉液中，孵育90min；用含0.25％Tween20的100μl PBS(PBST)清洗三次；每孔加入50μl用含3％奶粉、0.05％Tween 20的PBS(即PBS-M-T)稀释成适当浓度的一抗，37℃下孵育60-90min；PBST清洗三次；每个样品中的2孔加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG，另外2孔加FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG，孵育60-90min；PBST清洗三次；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，阳性细胞呈橙红色，后者直接在倒置荧光显微镜下观察，阳性细胞发绿色荧光。7B4、9B4、9C4被鉴定为阳性(图省略)。
2、IBDV-VP243单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。获得4G8、3C4、3C6 3个阳性克隆(图省略)。
3、IBDV-VP5单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将2F11、B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4等单克隆细胞，按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。2F11、B1、C1、C5、D8、G10、C11、C12、F4鉴定为阳性克隆(见图7以VP5-2F11为例，其他克隆样品省略)。
4、IBDV-VP3单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞，按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。获得5个阳性克隆，即D2、D7、G9、F4、F6(图省略)。
5、IBDV-VP2单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将3B2、3B3、3D2、3E2、3C4等单克隆细胞，按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。3B2、3B3、3D2、3E2、3C4被鉴定为阳性克隆(图省略)。
6、IBDV-VP2(CΔ60)单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞7C5、B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4等单细胞克隆，按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。7C5、B9、C12、C3、D9、D8、D3、E8、E4为阳性单细胞克隆(图省略)。
7、IBDV-VP2(CΔ25)单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞3E5、4C7、3D3、4B11等单细胞克隆按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。其中克隆号(3E5、4C7、3D3、4B11)为阳性克隆(图省略)。
8、IBDV-VP2(CΔ18)单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞5G3、5D9等单细胞克隆按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。5G3、5D9单克隆细胞系经IFA/IPAM鉴定为阳性克隆(图省略)。
9、IBDV-VP2(CΔ11)单克隆细胞系表达产物的IFA/IMPA检测将单克隆细胞5C1等单细胞克隆按适当浓度接种96孔细胞培养板，各4个孔，并设4孔为阴性对照，4孔为IBDV感染细胞为阳性对照，等细胞长成单层后，去培养液，PBS清洗，丙酮/甲醇混合液固定；，在37℃下，5％奶粉液中封闭；PBST清洗；PBS-M-T稀释的一抗37℃下孵育；PBST清洗；加HRP标记的适当稀释的羊抗鼠IgG或FITC标记的适当稀释的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；前者用AEC试剂盒显色后在普通显微镜下观察，后者直接在倒置荧光显微镜下观察。IFA/IPMA结果表明IBDV-VP2(CΔ11)只有5C1为阳性单克隆细胞(图省略)。
权利要求
1.一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于它的步骤如下1)自传染性法氏囊病毒抽提病毒RNA，长距离一步法RT-PCR扩增病毒全长cDNA，并以此为模板PCR扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI-neo构建表达质粒pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1，经42℃热击转化CaCl2法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞；2)用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5OD600值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，各重组质粒经Opti-MEM稀释后在Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞；4)在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；5)单克隆化细胞经PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。
2.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的IBDV含两端非编码区A节段、VP243、VP5、VP3、VP2、VP2(CΔ60)、VP2(CΔ25)、VP2(CΔ18)、VP2(CΔ11)、VP1基因与含有CMV启动子的真核表达载体pCI-neo组建成表达载体pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1。
3.根据权利要求2所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的pCI-neo-A、pCI-neo-VP243、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-VP2、pCI-neo-VP2(CΔ60)、pCI-neo-VP2(CΔ25)、pCI-neo-VP2(CΔ18)、pCI-neo-VP2(CΔ11)和pCI-neo-VP1重组质粒，经42℃热击转化CaCl2法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞后，分别构建含上述表达质粒的大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的含目的基因的大肠杆菌经过质粒超纯纯化后，在Lipofectamine 2000介导下转染生长活力旺盛的单层Vero细胞，相应的传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的以独立形式沉积在细胞内。
5.根据权利要求4所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的含目的基因的重组质粒转染后的细胞进行G418抗性筛选，获得G418抗性的细胞。
6.根据权利4或5要求所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的G418抗性的细胞，通过极限稀释法获得单克隆化细胞。
7.根据权利要求6所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的单克隆化细胞，在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中传代、扩繁，经过PCR、RT-PCR、Southernblot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的单克隆永生化细胞。
8.根据权利要求7所述的一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于所述的获得含有目的基因的单克隆永生化细胞为研究传染性法氏囊病毒基因编码蛋白对宿主细胞基因表达调控提供载体，以及表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白应用于传染性法氏囊病的免疫接种。
全文摘要
本发明公开了一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法。反转录获得传染性法氏囊病毒基因组cDNA，PCR扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI－neo构建成重组表达质粒。在Lipofectamine 2000介导下转染Vero细胞，在G418的抗性下，通过极限稀释法克隆单细胞，经PCR、RT－PCR、Southern blot、Northern blot、IFA/IPMA检测，获得含目的基因的克隆化细胞系，经反复传代培养后不丢失。这些细胞系可作为研究传染性法氏囊病毒基因编码蛋白对宿主细胞基因表达调控的载体，以及将表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白应用于传染性法氏囊病的免疫接种。本发明应用基因工程技术、细胞重组技术制备表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的永生细胞，具有重复性强、稳定性好，再生能力强等特点。
文档编号C12N15/33GK1696292SQ20051004930
公开日2005年11月16日 申请日期2005年3月8日 优先权日2005年3月8日
发明者周继勇, 叶菊秀, 陈庆新, 郑肖娟 申请人:浙江大学