专利名称：非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体突变的检测方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及表皮生长因子受体(EGFR)突变的检测方法，尤其涉及非吸烟者肺腺癌中EGFR突变的检测方法。
背景技术：
肺癌是世界范围内癌症死亡的首位原因，中国也是一样，预计2005年中国将有429,000人死于肺癌，下个世纪肺癌死亡率将翻倍1。目前，进展期或复发肺癌病人的主要治疗方法是化疗。然而，酪氨酸激酶抑制剂(TKLs)如gefitinib和erlotinib的最新研究进展有望改变传统治疗方法，为肺癌病人带来福音。gefitinib在欧美、日本和北京非小细胞肺癌患者中使用显示有临床效果，其有效率分别为欧美10％、日本26％和北京36％2-4。
最近确定，美国和日本的可切除早期肺肿瘤中有编码EGFR基因的体细胞突变，其突变频率分别为8％和26％2-3。一生中吸烟次数少于100次的“非吸烟”个体，这些突变更为常见，且与激酶抑制剂gefitinib(Iressa)5，6和erlotinib(TarcebaTM)7的治疗敏感性有关。一组美国的“非吸烟”肺腺癌病例，15例中有7例(47％)EGFR突变7。另一组临床实验显示服用gefitinib和erlotinib后，具EGFR TK domain区域突变的病例，31例中25例(81％)有疗效，而无EGFR突变的病例，29例中无一例有疗效。中国肺癌患者EGFR突变率还未见报道。为此，我们特别检测在中国大陆非吸烟肺腺癌患者的EGFR的突变情况，并与免疫组织化学检测结果比较。
发明内容
本发明的目的是提供非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体(EGFR)突变的检测方法，通过下列步骤实现肿瘤组织中基因组DNA是从石蜡包埋块中提取，酚-氯仿法抽提DNA，然后测定DNA浓度，对28个位点(EGFR中酪氨酸激酶的28个外显子)进行检测，引物序列见SEQ ID NO1-56，PCR扩增采用25μl反应体系，10*buffer(Promega公司产品)2.5μl，dATP、dCTP、dGTP各0.5μl(终浓度200μmol/L)，Mgcl 21.5μl(终浓度1.5mmol/L)，每条引物1μl(终浓度500nmol/L)，Taq酶(Promega公司产品)0.2μl(1U)，模板DNA1μl.循环参数95℃ 5min，95℃ 30s，退火温度为58℃(exons 1，3，4，7-10，12-25，27，28)，56℃(exons 2，5，6，and 26)，52℃(exon 11)，时间30s，72℃ 30s，30个循环，72℃ 5min，4℃。PCR产物用PCR Product Pre-Sequencing(Amersham Pharmacia Bioteth公司)试剂盒纯化。对每一个外显子进行正、反双向序列测定，测序分析使用HotStar Taq MasterMix(Qiagen Hilden公司，德国)DNA测序仪完成。
本发明方法提供了中国非吸烟肺腺癌具有EGFR突变现象，且为EGFR的酪氨酸激酶(TK)结构域外显子高频率突变，为使用酪氨酸激酶抑制剂(如gefitinib和erlotinib)作为治疗选择提供了依据。本发明检测方法操作简便，易于推广。
图1为一例中国非吸烟肺腺癌特殊的EGFR外显子19缺失的序列分析。
图2为肿瘤中表皮生长因子受体基因突变位置。
具体实施例方式
按本发明检测方法，5/8例肺癌病例检测到EGFR突变。见表1.EGFR突变实例分析。
表1.肺腺癌EGFR突变实例分析
肿瘤临床分期和组织学分型按照美国癌症协会(AJCC)的非小细胞肺癌(NSCLC)标准。吸烟史一生中吸烟少于100支为无。EGFR突变状态-注意观察氨基酸改变。Del-deletion(缺失)；ins-insertion(插入)。
肿瘤预处理随机选择的8例肺癌病例，均为浙江大学医学院附属第一医院2003-2004年住院手术病例。病人中男性1例女性7例，平均年龄55岁(41-70岁)，根据患者病史评定为非吸烟者，手术时完整切除肿瘤，所有肿瘤都经同一高年资病理医生确诊为腺癌。
免疫组织化学切片经脱蜡至水，3％H2O2-甲醇阻断内源性过氧化物酶。以柠檬酸缓冲液(pH6.0)抗原修复液内微波修复20分钟，冷至室温。羊血清封闭非特异性抗体结合。一抗EGFR(1∶100)，37℃，60分钟，pH7.2缓冲液洗后滴加Envision二抗，37℃，60分钟。缓冲液洗后DAB显色2～3分钟，流水冲洗终止显色。苏木素淡染，脱水，透明，封固。以代替一抗EGFR设阴性对照肺肿瘤的EGFR突变分析肿瘤组织中基因组DNA是从石蜡包埋块中提取，PCR法分析EGFR突变，引物设计参照文献，特别注意EGFR在外显子18-21处突变的情况。使用HotStarTaq Master Mix系统，进行正、反两个方向序列反应，通过PCR扩增两种独立的DNA片段(isolates)来确定所有突变，由两个人进行序列分析(chromatograms)，参见图2，EGFR分子二聚体与EGF配体结合。图示三部分-①细胞外区(含二个受体位配体L区和一个furin-like区)，②穿膜区和③胞浆区(含催化激酶区(catalytic kinase))。酪氨酸位(Y1068)的磷酸化是受体激活的靶位，EGFR磷酸化导致其下游的STAT3，MAPK和AKT被激活。肿瘤发生时的突变位置均在酪氨酸激酶区，以箭头表示。其中delE746-A750和L858R为本发明所检测到的。
结果免疫组织化学结果为8例肺腺癌的肿瘤细胞6例阳性，正常组织阴性。与EGFR突变检测结果比较无相关性。
本组8例肺腺癌的其中5例肿瘤(62.5％)检测到EGFR突变，其基因组DNA的EGFR外显子发生突变，突变组平均年龄58岁，无突变组50岁，突变组5例中1例为男性，无突变组3例均为女性，参见表2。可知第4、5例为外显子19区域内多核苷酸缺失，第6例突变也发生在外显子19，其缺失很奇特，包括13个核苷酸的缺失和4个核苷酸的插入，这些改变导致了氨基酸E746-A750(编码ELREA)的缺失、谷氨酰胺和脯氨酸2个残基的插入，参见图1，图1为一例中国非吸烟肺腺癌特殊的EGFR外显子19缺失的序列分析，突变涉及5个氨基酸残基丢失，2个残基插入(delE746-A750insQP)。此例肿瘤形态学表现为较多黏液分泌，瘤细胞漂浮在黏液湖上，符合黏液腺癌的诊断。第7、8例肿瘤发生外显子21的L858R突变。剩下3例肿瘤(第1-3例)具有野生型EGFR序列。
这是首次报告的中国非吸烟肺腺癌具有EGFR突变现象，本研究中，8例中5例发生EGFR突变，其发生率为62.5％。虽然样本较小，但这些样本是从一大医院非吸烟肺癌病例中随机选择取得的，因此可能有一定代表性。中国非小细胞肺癌患者中，非吸烟、曾吸烟和现正吸烟者的EGFR突变率均无资料，值得化一定的财力和人力深入研究。
肺腺癌中EGFR的酪氨酸激酶(TK)结构域发生突变，均位于外显子18-21。90％的文献提到突变发生在外显子19和21，位于外显子19的多核苷酸框架缺失，常导致氨基酸LREA被删除；而位于外显子21的点突变，导致858位点(L858R)的亮氨酸替代精氨酸。我们在第4、5例和第7、8例发现的突变类型与美国和日本报道的类型相同5-7。
本组有一例呈特殊的EGFR外显子19缺失，缺失引起746到750位点氨基酸残基丢失，谷酰胺和脯氨酸2个残基插入(delE746-A750insQP)。邻近745位点赖氨酸残基的LREA序列对于结合ATP非常重要，突变造成的EGFR外显子19缺失，恰好丢失了LREA序列。
文献提示EGFR蛋白表达与肿瘤对gefitinib治疗的反应无关系8，有人在异种皮移植模型中使用gefitimb进行实验，发现EGFRmRNA和EGFR蛋白水平也无关系9，我们的检测结果示EGFR蛋白表达与EGFR突变无相关性。
EGFR酪氨酸激酶域突变状况与酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的治疗反应相关，而TKIs的发展很快，gefitinib和erlotinib是目前已在美国、欧洲等应用的TKIs药物，中国还没有广泛应用这两种药物，本组结果提示中国非吸烟肺腺癌患者可能受益于这些药物。本组检测显示中国非吸烟肺腺癌EGFR突变频率高，是选择gefitinib和erlotinib在中国使用的依据。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.Yang L，Parkin DM，Li LD，et al.Estimation and projection of the nationalprofile of cancer mortality in China1991-2005.Br J Cancer 2004；902157-2166.
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<110>浙江大学<120>引物序列<160>56<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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cagctgatct caaggaaaca gg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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gagcagccct gaactccgtc agactg 26<210>44<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>配对于有意义链的引物序列，退火温度为58℃
<400>49gcagctataa tttagagaac caagg 25<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>配对于有意义链的引物序列，退火温度为56℃<400>51cctagttgct ctaaaactaa cg 22<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>配对于反意义链的引物序列，退火温度为56℃<400>52ctgtgaggcg tgacagccgt gcag 24<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>配对于有意义链的引物序列，退火温度为58℃<400>53caacctacta atcagaacca gcatc 25<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>配对于反意义链的引物序列，退火温度为58℃<400>54ccttcactgt gtctgcaaat ctgc 24<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>配对于有意义链的引物序列，退火温度为58℃<400>55cctgtcataa gtctccttgt tgag 24<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>配对于反意义链的引物序列，退火温度为58℃<400>56cagtctgtgg gtctaagagc taatg 2权利要求
1.非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体突变的检测方法，通过下列步骤实现肿瘤组织中基因组DNA是从石蜡包埋块中提取，酚-氯仿法抽提DNA，然后测定DNA浓度，对28个位点进行检测，引物序列见SEQ ID NO1-56，PCR扩增采用25μl反应体系，10*buffer 2.5μl，dATP、dCTP、dGTP各0.5μl，终浓度200μmol/L，Mgcl 21.5μl，终浓度1.5mmol/L，每条引物1μl，终浓度500nmol/L，Taq酶0.2μl，模板DNA 1μl，循环参数95℃ 5min，95℃ 30s，退火温度为58℃，56℃，52℃，时间30s，72℃ 30s，30个循环，72℃5min，4℃，PCR产物用PCR Product Pre-Sequencing试剂盒纯化，对每一个外显子进行正、反双向序列测定，测序分析使用HotStarTaq Master Mix DNA测序仪完成。
2.根据权利要求1所述的非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体突变的检测方法，在非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体突变的检测中应用。
全文摘要
本发明提供非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体(EGFR)突变的检测方法，通过下列步骤实现肿瘤基因组DNA，采用HotStarTaq Master Mix系统，分析EGFR在外显子18－21处突变情况，为使结果优化，采用正、反两个方向进行序列分析。通过本发明方法揭示了中国非吸烟肺腺癌具有EGFR突变现象，且为EGFR的酪氨酸激酶(TK)结构域外显子高频率突变，为使用酪氨酸激酶抑制剂(如gefitinib和erlotinib)作为治疗选择提供了依据。本发明方法可在非吸烟者肺腺癌中表皮生长因子受体突变的检测中应用。本发明检测方法操作简便，易于推广。
文档编号C12Q1/68GK1687457SQ20051004927
公开日2005年10月26日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者任国平, 潘秋炉, 怀静 申请人:浙江大学