专利名称：产碱杆菌及其在降解甲胺磷中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌，尤其是一种产碱杆菌及其在降解甲胺磷中的应用。
背景技术：
生物技术在环境领域的应用已有多年历史，其中有较早的活性污泥法处理工业废水以及近20年来发展起来的生物修复技术。微生物可降解的污染物种类大致可分为多环芳烃(PAHs)、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃等。目前，应用生物降解原理治理被污染的环境所具有的潜在优势得到了广泛认可。它不仅经济、安全，而且所能处理的污染物阈值低、残留少，其应用前景看好。
在有机污染物的高效降解菌方面，国内有不少单位获得了不同有机污染物相应需要的降解菌株，有些已成功地开发应用。例如，中国农业科学院原子能所陈明等人(2000年)从工业废水污染的水体和污泥中分离筛选到6株对氯苯和苯酚类有机污染物高浓度耐受力和不同程度降解能力的细菌菌株；中山大学曾锋等人(2001年)从处理石化厂废水的活性污泥中分离出一株邻苯二甲酸酯降解菌FS1(Pseudomonas fluorescens FS1)；中国水产科学研究院黄海水产研究所李秋芬等人(2001年)筛选到虾池有机污染物降解菌10株，对养殖对虾没有致病作用，且其中6株可提高仔虾的成活率；中国科学院微生物研究所贾省芬等(2000年)从城市污水及工业废水中分离选育出一种高效多功能混合菌群，包括芽孢杆菌7株、其他细菌6株和酵母7株等；华南理工大学化工学院侯轶等(1999年)分离到1株能有效降解硝基苯的枯草芽孢杆菌，直接用好氧技术就可将废水完全无害化；张志杰等(2000)人从处理废水的活性污泥中分离出2株萘降解菌和1株吡啶降解菌，经微生物共代谢能促进难降解有机物的降解，当三者协同作用时效果最好；南开大学蔡宝立等(1998年)从工业污水中分离到5个能以苯甲酸为唯一碳源和能源的细菌菌株；安徽农业大学章健等人(1997年)从长期受苯胺污染的土壤中筛选到2株对苯胺降解能力很强的细菌；李淑彬等(1999年)报道分离到一株能高效降解有机磷农药甲胺磷的假单胞菌；刘玉焕等(2000)从被有机磷污染的土壤中分离到能降解甲胺磷的曲霉M-2和降解乐果活性较高的华丽曲霉Z58；庄铁诚等(2000)的研究结果表明，饱受工农业和生活污水污染的红树林土壤中存在着降解甲胺磷的优势细菌种群；黄志勇等(1999)从印染厂污泥钟分离到一株沼泽红假单胞菌H3，该菌对酸性红B2GL染料有很强的厌氧脱色和降解作用；李惠蓉等分离到的一株白腐真菌OGC101对偶氮染料、噻嗪染料、酞菁染料等染料大类均具有广谱且有效的降解能力；曹孟德等从印染废水污染环境中分离到一株对偶氮染料活性艳红X-3B驼色的气单孢菌RD2。
甲胺磷是一种水溶性的广谱、剧毒的有机农药，化学名称为O，S-二甲基胺基硫代磷酰胺。该农药具有胃毒、触杀和内吸作用，用于防治多种害虫，在农业上广为施用。1964年，由西德和美国相继开发了甲胺磷。近年来，随着有机氯农药的禁用，甲胺磷的用量迅速上升，已成为我国目前用量最大的农药品种之一。1996年用量已达到6万吨，占杀虫剂总量的21.4％，位居诸多杀虫剂之首(华小梅，1996)。人们在大量使用其防治虫害的同时，致使粮食、蔬菜等的农药残留超标，甲胺磷农药中毒事件及职业性中毒病例相继增加(Bellis，1994；Sundaranc，1993)。并且，大量排放的甲胺磷农药的生产废水，其有机磷浓度高、组分复杂、生物降解性差、生化处理效应低，造成土壤、水体环境污染，生态平衡破坏。它现已成为我国优先监测的十大农药品种之一(江希流，1993)。因此，应加强对其降解的研究。在生态系统中，微生物的代谢类型多，具有很强的生化适应能力，能较快地产生相应酶系来利用各类人工合成的农药作为碳、氮源生长，并常能完全降解成无机物，这些都是其它途径无法比拟的。微生物对农药的分解作为一种有效的环境治理措施，在消除污染、净化环境方面具有重要现实意义(阮少江，2000)。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产碱杆菌(Alcaligenes sp.)，并且人为转入卡纳(Kn)抗性的绿色荧光蛋白(GFP)质粒做为生物标记，可以在开放环境降解过程中随时检测该菌株的丰度。
本发明的另一目的在于提供产碱杆菌在降解甲胺磷中的应用。
本发明提供一株产碱杆菌，为Alcaligenes sp.LY-5，已于2005年4月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM205027。
本发明所提供的细菌Alcaligenes sp.LY-5经16srDNA序列分析为产碱杆菌，并且被转入卡纳(Kn)抗性的绿色荧光蛋白(GFP)质粒作为生物标记，具有Kn抗性和诱导剂异丙基-Beta-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导的GFP表达能力，可在荧光显微镜下检测到其发光现象，可以在开放环境降解过程中随时检测该细菌的丰度。
产碱杆菌Alcaligenes sp.LY-5可以以甲胺磷为唯一营养源，将甲胺磷降解为磷酸根形式并且与环境中的重金属源形成磷酸盐沉淀，一次达到减毒和除磷的作用。用产碱杆菌Alcaligenes sp.LY-5降解甲胺磷时，液体培养基的组成为NaCl 0.2g，KCl 0.2g，无水MgSO40.2g，MnCl20.2g，NH4NO31.0g，纯净水1000mL，pH＝7.0。甲胺磷1g。
将甲胺磷降解为无毒的磷酸根形式可通过高效液相色谱仪(HPLC)和NMR检测。
产碱杆菌Alcaligenes sp.LY-5的选育方法如下1.降解菌的采集沿三明市沙溪污染河段周围的农药厂的排污口、生化池等区段，共6个采样点①福建省三明化工厂总排污口(简称三化总口)污泥；②渣厂NaCl堆积池污泥；③生化池一级及二级池混合污水；④福建省三明市磷排污口(简称黄磷口)污水；⑤生化池污泥；⑥渣厂渗滤液。
2.甲胺磷降解菌的驯化与分离取土样5g或水样10ml，分别接种入80ml甲胺磷浓度为100mg/L的基础培养基中，于37℃，120r/min摇床培养一周后，取10ml接入甲胺磷浓度为200mg/L的基础培养基中，以后每周接种一次，逐步提高甲胺磷浓度，依次为400mg/L、800mg/L，并在800mg/L的浓度条件下再培养一周。
在含有800mg/L甲胺磷的LB固体培养基平板上涂布菌液。37℃温箱中培养，挑出单菌落再划线培养，直至没有杂菌出现。
3.甲胺磷降解的检测高效液相色谱仪(HPLC)条件Varian Prostar210高效液相色谱仪，C18反相柱(150×4.6mm)，流动相为20％甲醇，80％水；检测范围210-300nm，监测波长为215nm。
磷谱Varian UNITY+500核磁共振仪，将挑取的单菌落接种入装有5ml富集培养基(甲胺磷含量为500mg/L)的螺口试管，置于37℃，120r/min摇床培养过夜，每株按照10％的接种量，接入甲胺磷含量为1000mg/L的基础培养基中(20ml)，置于37℃，120r/min摇床，10min后取出菌液0.5ml，离心(3000rpm，10min)后，.取上清用于HPLC检测，以后每隔3天，取一次样品，进行HPLC检测，同时将以上的离心菌液上清取0.5mL用于500兆核磁进行磷谱分析。
4、结果HPLC检测结果表明，筛选出14株甲胺磷降解细菌对于甲胺磷的降解效能都比较高，在培养4，7，14天后对甲胺磷平均降解率分别为67.6％、81.1％和85.9％。对样品进行同步的磷谱分析，发现随着色谱中甲胺磷峰面积的减弱，磷谱中甲胺磷42.6ppm处的峰也逐渐减弱，并向低场漂移，在10ppm，24ppm和1ppm处出现新的峰。不同的菌株降解甲胺磷后产物的磷谱峰不完全相同，14株菌株可分为3种类型(A，B，C)。降解一周后的核磁结果见图1。
选取可以把甲胺磷降解为磷酸根的A组的三株细菌中降解力最高的一株，进行16sRNA测序分析，发现其为产碱杆菌属细菌。对该细菌转入厦门大学细胞肿瘤重点实验室构建的GFPxm18质粒，使其产生Kn抗性，并且通过诱导剂(ITPG)诱导，在低温17℃下培养，可在荧光显微镜下检测到其发光现象。
该菌株降解过程中的摇床培养阶段(14天)结束后，静置一周左右，发现培养液中出现细小的晶体。对其进行X射线衍射分析，得知其为MnHPO4晶体。该晶体为正交晶系，空间型P2(1)，晶包参数为a＝11.234(5)nm，b＝6.145(3)nm，c＝6.948(3)nm；α＝90deg；β＝90deg，γ＝90deg.Z＝4。可见其培养基中的Mn离子可以用于降解甲胺磷产生的磷酸根离子结合沉淀，达到初磷的效果。
图1为3组细菌一周的降解甲胺磷的磷谱结果。
具体实施例方式
取我们构建的Kn抗性产碱杆菌，在开放环境中进行模拟的甲胺磷降解实验。取3组2L的基础培养基，其中第一组加入甲胺磷2g，不人为接种任何细菌，作为对照组，第二组加入2g甲胺磷和20ml我们构建的Kn抗性产碱杆菌培养液，第三组在第二组的基础再加入20ml的20g土壤的浸出液。通气培养，每2天取样，分别通过HPLC和涂板检测其甲胺磷降解率和细菌生长量(无抗性平板中的菌落数/Kn抗性平板中的菌落数)。检测8天，结果如下表所示。并且取第二天的工作菌液，加入IPTG低温诱导培养，在荧光显微镜下检测到发光现象。通过以上实验可以证实，我们的细菌在开放环境中保持其甲胺磷降解活性，且为含有较高甲胺磷浓度的水环境中的绝对优势菌种，当甲胺磷压力解除后，其优势消失，环境中菌株分布趋于正常。
甲胺磷降解率 (％)
生长量 (菌数/105)
权利要求
1.一种产碱杆菌，为Alcaligenes sp.LY-5，已于2005年4月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM205027。
2.如权利要求1所述的一种产碱杆菌，其特征在于经16srDNA序列分析为产碱杆菌，并且被转入卡纳抗性的绿色荧光蛋白质粒作为生物标记，具有Kn抗性和诱导剂异丙基-Beta-D-硫代半乳糖苷诱导的绿色荧光蛋白表达能力，可在荧光显微镜下检测到其发光现象，可以在开放环境降解过程中随时检测该细菌的丰度。
3.如权利要求1所述的一种产碱杆菌，其特征在于以甲胺磷为唯一营养源，将甲胺磷降解为磷酸根形式并且与环境中的重金属源形成磷酸盐沉淀，一次达到减毒和除磷的作用。
4.如权利要求1所述的一种产碱杆菌，其特征在于用产碱杆菌Alcaligenes sp.LY-5降解甲胺磷时，液体培养基的组成为NaCl 0.2g，KCl 0.2g，无水MgSO40.2g，MnCl20.2g，NH4NO31.0g，纯净水1000mL，pH＝7.0，甲胺磷1g。
5.如权利要求1所述的一种产碱杆菌，其特征在于产碱杆菌Alcaligenes sp.LY-5的选育方法如下1).降解菌的采集沿三明市沙溪污染河段周围的农药厂的排污口、生化池等区段，共6个采样点①福建省三明化工厂总排污口污泥；②渣厂NaCl堆积池污泥；③生化池一级及二级池混合污水；④福建省三明市磷排污口污水；⑤生化池污泥；⑥渣厂渗滤液；2).甲胺磷降解菌的驯化与分离取土样5g或水样10ml，分别接种入80ml甲胺磷浓度为100mg/L的基础培养基中，于37℃，120r/min摇床培养一周后，取10ml接入甲胺磷浓度为200mg/L的基础培养基中，以后每周接种一次，逐步提高甲胺磷浓度，依次为400mg/L、800mg/L，并在800mg/L的浓度条件下再培养一周；在含有800mg/L甲胺磷的LB固体培养基平板上涂布菌液.37℃温箱中培养，挑出单菌落再划线培养，直至没有杂菌出现；3).甲胺磷降解的检测高效液相色谱仪条件Varian Prostar210高效液相色谱仪，C18反相柱，流动相为20％甲醇，80％水；检测范围210-300nm，监测波长为215nm；磷谱Varian UNITY+500核磁共振仪，将挑取的单菌落接种入装有5ml富集培养基，甲胺磷含量为500mg/L的螺口试管，置于37℃，120r/min摇床培养过夜，每株按照10％的接种量，接入甲胺磷含量为1000mg/L的基础培养基中，置于37℃，120r/min摇床，10min后取出菌液0.5ml，离心后，取上清用于HPLC检测，以后每隔3天，取一次样品，进行HPLC检测，同时将以上的离心菌液上清取0.5mL用于500兆核磁进行磷谱分析。
全文摘要
产碱杆菌及其在降解甲胺磷中的应用，涉及一种细菌，提供一株产碱杆菌以及在降解甲胺磷中的应用。产碱杆菌为Alcaligenes sp.LY－5，保藏编号为CCTCC NOM205027。以甲胺磷为唯一营养源，将甲胺磷降解为磷酸根形式并且与环境中的重金属源形成磷酸盐沉淀，一次达到减毒和除磷的作用。
文档编号C12N1/21GK1687402SQ20051007452
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者赵玉芬, 路杨, 纪思遥, 黄耀坚, 许鹏翔 申请人:厦门大学