专利名称：一种肝癌－睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽。
背景技术：
肿瘤-睾丸(cancer-testis，简称CT)抗原蛋白质是目前鉴定的肿瘤抗原中最多的一类，它们编码基因的特点是在很多类型的肿瘤中都有表达，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表达，但在除睾丸外的正常组织都不表达，在胎盘、卵巢、胰腺中有一定量的表达。因为睾丸是免疫特许部位，所以这一类抗原在治疗上被认为是肿瘤特异性的抗原，是最有希望用作为肿瘤免疫治疗用途的一类抗原。目前试用于临床上的也主要就是这一类抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定类型的肿瘤中有高阳性率的表达，又有很好的免疫原性的抗原蛋白质，用于肿瘤的免疫治疗时有很好的前景。
原发性肝细胞癌是人类原发性肝癌中最常见的一种类型，也是全世界最常发生的恶性肿瘤之一，尤其在东南亚及非洲，它的发病率更高。就中国而言，每年约有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人数的四分之一。这种高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特异临床症状，导致大部分患者就诊迟，而又缺乏有效治疗手段及术后易复发所致。发病率高、恶性度高、诊断迟、治疗方法少、预后差，是肝癌的几大特点。尽管国内外科研人员都对肝癌进行了多方面的研究，但目前肝癌发生发展的分子机理还不太清楚，对肝癌的治疗也主要是采取手术治疗及局部或全身化疗，少数病人辅以肿瘤生物疗法，但术后生存期仍不尽人意。为此，对肝癌发生发展机理的研究成为当前的迫切要求，希望籍此早日阐明肝癌发生发展的分子基础，或与肝癌发生发展密切相关的分子，以便随访高危人群，有效预防、早日诊断、综合治疗、减少复发。
以前的研究表明，肝癌的发生是一个多阶段、多步骤的过程，这一过程中伴随着机体许多的细胞学、遗传学的改变，在细胞内存在的正向调控和负向调控之间的相对平衡被打破，出现多种基因表达异常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因灭活，激发异常的信号转导通路，导致细胞周期及细胞凋亡异常，从而使得细胞恶性转化，并随着各种分子异常的累积，肿瘤出现进展、转移。而且，肝癌在分子水平的改变是异质性的，可能存在多个基因，多个途径交叠作用。同时，细胞内在的自我防护机制也可能会诱导产生拮抗性分子。所以，明确这些差异表达的基因，对于肝癌发生发展机制的阐明和对肝癌的临床诊断、治疗都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于肝癌治疗的肿瘤睾丸特异性抗原蛋白和肿瘤睾丸特异性抗原肽。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供一种肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质TFDP-3(HCA661)，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有图1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同或相似的功能。
本发明提供一种编码上述肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的基因。
本发明所述的基因属于DP家族，其具有图2所示的核苷酸序列，在基因文库中登录号为AF219119。
本发明提供一种包含上述肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的融合蛋白。
本发明提供一种肝癌-睾丸特异性抗原肽，其具有如下(c)或(d)所述的氨基酸序列(c)其为上述肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的特异性DNA结合结构域的含84个氨基酸的肽段，其氨基酸序列为在图1所示的序列中起止AA108-AA191；(d)将(c)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生肽，且该衍生肽与(a)的肽具有相同或相似的功能。
本发明提供一种编码上述肝癌-睾丸特异性抗原肽的基因。
本发明提供一种包含上述肝癌-睾丸特异性抗原肽的融合蛋白。
本发明提供的肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质、抗原肽、及其们的融合蛋白在pRB/E2F信号转导中可作为E2F活性阻断剂，对其同源类似物TFDP-1发挥拮抗作用。该蛋白质/肽及编码其的DNA可作为CT抗原或抗原基因而制成疫苗，这种肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，激发免疫反应而达到治疗癌症的目的，从而可以应用于制备治疗癌症，特别是肝癌的药物中。应用本发明的肿瘤抗原蛋白质可以提供活化抗肿瘤免疫的医药、可提供肿瘤的诊断方法。抗本发明的肿瘤抗原蛋白质的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。
本发明克隆的新基因是一个肝癌-睾丸特异性表达的、与肝癌发生相关的基因，对于它的功能的研究，将有助于肝癌发生发展机理的阐明。该基因编码的新蛋白TFDP-3(HCA661)是一个新的CT抗原，在原发性肝细胞性肝癌中，TFDP-3(HCA661)阳性约占1/3，作为肿瘤疫苗具有应用于肝细胞性肝癌治疗的潜在的临床应用价值。同时，与其它CT抗原不同，该蛋白具有明显的功能，是DP家族的新成员，该家族可以与E2F形成异源二聚体，从而增强E2F的转录调节功能，处于pRB/E2F信号通路中的核心位置。pRB蛋白是多种DNA肿瘤病毒立早基因产物作用的靶蛋白，如猴病毒40大T抗原、乳头状瘤病毒E7蛋白、腺病毒E1a蛋白等。这些癌基因产物可以与E2F竞争结合pRB蛋白，破坏E2F与pRB的作用与结合，导致pRB对E2F活性的抑制被消除，激活E2F依赖性靶基因的转录。在多数人类肿瘤中，E2F的调控机制是失调的，而E2F功能的失调往往会伴随着细胞的转化，甚至肿瘤的发生。以前的许多研究都已证明，DP蛋白或E2F蛋白具有原癌基因的特性。TFDP-3(HCA661)的结构分析表明，它具有与TFDP-1相似的结构，即含有一个DNA结合结构域和一个二聚化结构域。功能研究表明，TFDP-3(HCA661)可以与E2F家族的所有具有二聚化结构域的蛋白形成异二聚体，在蛋白相互作用的水平上，TFDP-3(HCA661)具有与TFDP-1完全一致的生物学特性。但在蛋白与DNA相互作用的水平上，TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白形成的异二聚体极大地削弱了E2F结合DNA的能力，并可抑制E2F的转录活性，亦可抑制TFDP-1对E2F的别构激活。TFDP-3(HCA661)对E2F功能影响的独特性质使其可望作为当病毒感染或pRB突变导致的pRB/E2F信号通路失控时的拮抗剂，从而弥补pRB的功能，至少是部分弥补。TFDP-3(HCA661)在组织表达的特异性以及它所具有的与pRB相似的抑制E2F活性的特性，可视为肝癌睾丸特异性的抑癌基因，这个基因和蛋白可能为将来发展肝癌特异性治疗提供一个较好的靶点。
此外，本发明首次将TFDP-3(HCA661)基因鉴定为肿瘤-睾丸特异性抗原基因；在使用免疫方法治疗癌症时，可以用本发明的肿瘤抗原蛋白质诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而在不杀伤正常细胞的前提下，特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用；同时，可以通过对该肿瘤抗原基因或抗体的检测，对肿瘤的发生、发展以及是否有转移进行诊断。
图1为本发明提供的肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的氨基酸序列；图2为本发明提供的编码肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的核苷酸序列；图3为使用CLUSTAL W(1.82)分析程序对TFDP-3(HCA661)蛋白的氨基酸序列与其DP家族同源类似物TFDP-1的氨基酸序列的对比分析结果；其中，“*”指序列中的氨基酸残基完全一致；“”指序列中的氨基酸残基属于保守替换；“.”指序列中的氨基酸残基属于半保守替换；图4为TFDP-3(HCA661)mRNA在肝细胞性肝癌(HCC)中的Northern blot验证图；其中，Testis为睾丸组织；Adj为邻近非癌组织；HCC为肝细胞性肝癌；Normalliver为正常肝组织；图5为TFDP-3(HCA661)在HCC细胞系中的表达分布；其中，L02为正常肝细胞系，Jurkat为急性T淋巴细胞白血病细胞系，其余为HCC细胞系；图6为TFDP-3(HCA661)与E2F家族蛋白相互作用的GST Pull-down分析；其中，A图E2F的可溶性GST融合蛋白在大肠杆菌JM109中诱导和表达，可溶性蛋白的表达水平通过考马斯亮蓝染色评估；箭头所示为可溶性蛋白的特异性迁移带；无融合基因的GST蛋白作为阴性参照。B图作为阴性参照的GST蛋白和E2F的GST融合蛋白分别与谷胱甘肽-琼脂糖微珠结合，然后与体外转录、翻译的TFDP-3(HCA661)蛋白相互作用，并洗掉未结合的蛋白，剩余的与谷胱甘肽-琼脂糖微珠结合的蛋白通过电泳、放射自显影分析。体外转录、翻译的TFDP-3(HCA661)蛋白作为阳性参照；图7为TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白相互作用的免疫共沉淀分析；其中，上图为采用抗HA多克隆抗体通过免疫印迹分析从共转染的HeLa细胞中提取的免疫共沉淀蛋白；中图为采用抗HA多克隆抗体通过免疫印迹分析共转染的HeLa细胞裂解物中的E2F蛋白的表达水平；下图为采用抗FLAG M2单克隆抗体通过免疫印迹分析共转染的HeLa细胞裂解物的TFDP-3(HCA661)蛋白的表达水平；箭头所示为TFDP-3(HCA661)或E2F蛋白的特异性迁移带；图8为TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白相互作用形成的异二聚体的DNA结合能力分析(EMSA)；图9为TFDP-3(HCA661)亚细胞定位分析；其中，A，E2F或DP蛋白单独转染时的亚细胞定位；B，E2F和DP共转染时的亚细胞定位；所有图像通过配备了CCD的免疫荧光倒置显微镜在放大倍数为480倍的视野下摄取；图10为TFDP-3(HCA661)对E2F转录活性影响的分析；其中，A为TFDP-3(HCA661)抑制E2F的转录活性结果；B为TFDP-3(HCA661)抑制E2F/TFDP-1介导的转录激活结果；C为TFDP-3(HCA661)过表达能抑制内源性E2F活性结果；所显示的数据是三次实验的平均值及其标准差；图11为TFDP-3(HCA661)突变体的图示；其中，A为两个已知的人DP家族蛋白TFDP-1和TFDP-2的DNA结合结构域与TFDP-3(HCA661)的DNA结合结构域的氨基酸残基的比较；“*”指序列中的氨基酸残基完全一致；“”指序列中的氨基酸残基属于保守替换；“.”指序列中的氨基酸残基属于半保守替换；序列分析所使用的分析程序为CLUSTAL W(1.82)；“Δ”指该氨基酸残基参与了与DNA碱基的相互作用；“▲”指该氨基酸残基参与了与DNA骨架的相互作用；“■”指该氨基酸残基参与了与蛋白质的异二聚化的相互作用；B为从全长TFDP-3(HCA661)和TFDP-1的氨基酸序列中衍生出的替换突变体的图示；TFDP-3(HCA661)和TFDP-1根据结构域的组成可以将氨基酸序列分成4个部分，即N端未知功能区(UNT)、DNA结合结构域(DBD)、异二聚化结构域(HD)和C端未知功能区(UCT)；C为TFDP-3(HCA661)和TFDP-1在DNA结合结构域内进行的替换衍生出的突变体的图示；TFDP-3(HCA661)的氨基酸残基用阴影标记；同时在突变体的右侧也简要地标注了该突变体的转录性质；图12为TFDP-3(HCA661)独特功能产生的分子基础分析；其中，A为TFDP-3(HCA661)和TFDP-1突变体的蛋白表达；B和C为TFDP-3和TFDP-1的替换突变体对E2F-4的转录活性的影响的报告基因评估；所显示的数据是三次实验的平均值及其标准差。
具体实施例方式
实施例1.基因分析TFDP-3(HCA661)是通过SEREX方法从病人的肝癌组织中用血清筛选出的新基因。根据生物信息学分析，TFDP-3(HCA661)基因定位于人基因的X染色体上，是一个单外显子组成的基因。其转录本大小为1,680bp，其中编码框为1,218bp，起止点为90-1,307，共编码405个氨基酸的蛋白(如图1所示)。该蛋白是转录因子DP家族的新成员，与其DP家族同源类似物TFDP-1有高度的相似性(75.2％氨基酸一致性；82.0％氨基酸相似性)。二者的氨基酸序列的对比分析如图3所示，与TFDP-1类似，TFDP-3的氨基酸序列包括一个进化保守的DNA结合结构域(AA108-AA191)和一个进化保守的异二聚化结构域(AA192-AA264)，而且，在DNA结合结构域中，也含有一个在E2F家族和DP家族普遍具有的RRXYD DNA识别基序(AA162-AA166)。在已知的E2F和DP家族中，RRXYD DNA识别模序中的第三位氨基酸通常为疏水性的氨基酸(Valine(V)或Isoleucine(I))，但在TFDP-3(HCA661)中，该氨基酸为亲水性的Threonine(T)，这种非保守性的氨基酸替换对TFDP-3(HCA661)的DNA结合功能是否有影响尚不清楚。此外，TFDP-3(HCA661)的羧基端的20个氨基酸有15个是酸性氨基酸，而TFDP-1和TFDP-2只有13个和11个酸性氨基酸。这些分析结果强烈地提示TFDP-3(HCA661)是人的DP家族的第三个新成员。
实施例2.TFDP-3(HCA661)mRNA Northern blot分析为执行Northern blot分析，从HCC标本和对应的非癌组织标本以及睾丸组织中提取总RNA。RNA的完整性通过电泳分析。电泳时，每孔总RNA的上样量为30mg，然后转膜。用特异性32P标记的cDNA探针与硝酸纤维素膜在65℃杂交过夜。用0.1×SSC/0.1％SDS溶液洗涤三次，每次30分钟，在-70℃放射自显影。全长mRNA的大小通过与28S和18S的核糖体RNA的迁移程度对比得出。
由于核苷酸序的高度相似性，Northern blot杂交结果(如图4所示)显示，在睾丸组织的RNA中出现了两条强带，分别为～1.7kb和2.1kb。在HCC组织的RNA中只出现～1.7kb的带，而非癌组织以及正常肝组织只检测到了2.1kb的带。DNA序列分析表明，2.1kb的基因是TFDP-1，1.7kb的基因是TFDP-3(HCA661)。
实施例3.TFDP-3(HCA661)在HCC和邻近非癌组织标本中的表达分布TFDP-3(HCA661)mRNA的表达谱通过RT-PCR分析，结果列于表1。组织包括从Clontech购买的16种正常组织cDNA脑、心、肾、肝、肺、胰腺、胎盘、骨骼肌、结肠、卵巢、外周血白细胞、前列腺、小肠、脾、睾丸和胸腺，从HCC组织和与之配对的邻近非癌组织提取的总RNA逆转录成cDNA。使用特异性引物对扩增TFDP-3(HCA661)片段。Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)mRNA作为内参。所用引物如下TFDP-3，forward，5’-TAC ACT CGG CCT GGA AGA ATT G-3’；reverse，5’-TCT TCC TCC TCG ACT GCT G-3’，size，1,244 base pairs(bp)。
在16种正常组织中，只有睾丸检测到了TFDP-3(HCA661)mRNA的高水平表达，在正常胰腺组织中表达很弱，其余各种正常组织未检测到表达。在HCC组织中，17份HCC组织标本中阳性标本有5份，与17份HCC组织标本相对应的邻近非癌组织中仅有2份标本有微弱的表达，9份正常肝组织无一表达，是一个典型的癌-睾丸(CT)抗原。
表1、TFDP-3(HCA661)在HCC和邻近非癌组织标本中表达的RT-PCR分析
实施例4.TFDP-3(HCA661)mRNA在HCC细胞系中的表达采用TRIZOL(GIBCO BRL)从L02(人正常肝细胞系)，CH-Hep-1，CH-Hep-2，CH-Hep-3，CH-Hep-4，CH-Hep-5，CH-Hep-6，Hep 3B，Bel-7402，Bel-7405，SSMC7721，Hep G2和HLE HCC细胞系，SK-Mel-37和Mel-526黑色素瘤细胞系，Jurkat(人急性T淋巴细胞白血病细胞系)细胞提取总RNA。总RNA逆转录并使用特异性引物对扩增TFDP-1，TFDP-2和TFDP-3(HCA661)片段，G3PDH mRNA作为内参。使用下列参数执行RT-PCRTFDP-3(HCA661)，35个循环，94℃30秒；60℃30秒；72℃90秒，72℃延伸10分钟；TFDP-1，35个循环，94℃30秒；55℃30秒；72℃90秒，72℃延伸10分钟；TFDP-2，35个循环，94℃30秒；55℃30秒；72℃60秒，72℃延伸10分钟；G3PDH，25个循环，94℃15秒；64℃20秒；72℃20秒，72℃延伸10分钟。TFDP-3(HCA661)，TFDP-1，TFDP-2和G3PDH引物序列和PCR产物片段长度如下TFDP-3，forward，5’-TAC ACT CGG CCT GGA AGA ATT G-3’；reverse，5’-TCT TCC TCC TCG ACT GCTG-3’，size，1，244base pairs(bp)；TFDP-1，forward，5’-ATG GCA AAA GAT GCC GGTCTA ATT G-3’；reverse 5’-TCG TCC TCG TCA TTC TCG TTG-3’，size，1，229bp；TFDP-2，forward，5’-CCC TGC ACC AGC AAT GGT TAC TCA G-3；reverse，5’-ACTGCT GGA CTG GTG ACT GTT TGG G-3’，size，997bp；G3PDH，forward，5’-ACC ACAGTC CATGCCATCAC-3，reverse，5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，size，452bp。
我们将DP家族的各个成员TFDP-1、TFDP-2和TFDP-3(HCA661)在肿瘤细胞系尤其在HCC细胞系中的表达水平通过RT-PCR进行分析。使用G3PDH作为内参，评估mRNA的质量。我们检测了TFDP-3(HCA661)在肝癌组织中的表达，在这个实验中，我们设计了如上所示的特异性引物对，分别扩增TFDP-3(HCA661)，TFDP-1和TFDP-2基因的片段，检测DP家族各成员在肿瘤细胞系尤其在HCC细胞系中的表达分布。TFDP-1和TFDP-2mRNA表达于所有细胞系的细胞中，而TFDP-3(HCA661)mRNA的表达在不同的细胞系中有很大的差异。在SMMC-7721中表达相对较高的水平，HepG2，HLE和Jurkat中则表达水平较低，其余细胞系未检测到TFDP-3(HCA661)mRNA的表达(如图5中所示)，与TFDP-3(HCA661)在肝癌组织中的表达分布相一致。与TFDP-1和TFDP-2的广泛表达不同，TFDP-3(HCA661)的表达具有明显的组织细胞限制性。因此，TFDP-3(HCA661)具有不同于DP家族其它成员的表达谱。
实施例5.TFDP-3(HCA661)蛋白与E2F蛋白在体外的相互作用为了产生E2F-1～-6的GST融合蛋白以利于蛋白纯化和后续的GST Pull-down分析，E2F基因构建入pGEX-4T2，然后转化Escherichia coli(JM109)，通过传统方法获取和纯化大量的GST-E2F融合蛋白(见图6A)。TFDP-3(HCA661)蛋白通过Promega的TNTQuick Coupled Transcription/Translation system试剂盒于50μl反应体系中在放射性35S-methionine存在下体外转录和翻译来获取。体外结合反应中，适宜量的纯化过的GST或GST-E2F融合蛋白先与谷胱苷肽-琼酯糖微珠反应，然后加入含50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，10mg/ml lysozyme，0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，50mg/ml leupeptin，50mg/ml protease inhibitor，50mg/ml aprotinin和50mM dithiothreitol的TFDP-3(HCA661)裂解缓冲液中。于4℃作用2.5小时后，离心并收集沉淀物，用裂解缓冲液洗涤四次，去除未结合的蛋白。加入SDS上样缓冲液，在12.5％的聚丙烯酰氨凝胶上电泳、干胶，放射自显影。体外转录和翻译的TFDP-3(HCA661)蛋白作为阳性参照，非融合的GST蛋白作为阴性参照。结果显示，TFDP-3(HCA661)能与E2F-1～E2F-6相互作用(见图6B，lanes 3 to 8)。TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白之间的相互作用是高效率的而且是特异性的，因为TFDP-3(HCA661)与阴性参照GST蛋白之间无相互作用(见图6B，lane2)。这个体外结合数据支持TFDP-3(HCA661)是DP家族的一个新成员。
实施例6.TFDP-3(HCA661)蛋白与E2F蛋白在体内的相互作用人宫颈癌细胞系HeLa细胞于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，所用培养基为含100units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin和10％新生小牛血清的DMEM培养基。转染前，HeLa细胞用胰酶消化，用无双抗的含10％新生小牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞稀释于6孔板中，培养至细胞汇合度达到转染所需的90-95％。转染时，1.4μg的HA-tagged E2F质粒DNA和1.4μgFLAG-tagged DP质粒DNA，或1.4μg的空载体DNA，DNA总量加至2.8μg。LipofectAMINE 2000reagent(Invitrogen)用来将DNA带入细胞内。HeLa细胞转染24-36小时后，按常规方法制备非变性细胞裂解物。这些蛋白的表达水平通过抗HA兔多克隆抗体或抗FLAG M2小鼠单克隆抗体的免疫印迹分析细胞裂解物来监控E2F蛋白(如图7中图)或TFDP-3(HCA661)蛋白(如图7下图)的表达。为了执行免疫共沉淀分析，转染的HeLa细胞先用1×PBS洗涤二次，再加入适量的含20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1％Triton X-100，1mM EDTA，5μg/ml aprotinin，5μg/ml leupeptin，and 2mM PMSF的裂解缓冲液裂解细胞，制备非变性细胞裂解物。通过Bradford分析总蛋白的浓度。免疫共沉淀时，细胞裂解物在4℃含2μg/ml抗FLAG抗体和25μl的protein A-agarose的细胞裂解缓冲液中至少作用2小时。离心后的沉淀用含500mM NaCl的细胞裂解缓冲液洗涤三次，去除未结合的蛋白。洗涤离心后沉淀物加入上样缓冲液，在12.5％的聚丙烯酰氨凝胶上电泳、转膜。电转后的硝酸纤维膜先用含5％脱脂奶粉的TBS封闭缓冲液封闭1小时，然后用含1μg/ml抗HA抗体的封闭液温育1小时，最后用HRP偶联的抗兔IgG的二抗反应，ECL显色。E2F蛋白在所有转染了E2F DNA的免疫共沉淀物中检测到，但未在只转染空载体DNA或TFDP-3(HCA661)DNA免疫共沉淀物中检测出。这些数据表明TFDP-3(HCA661)能有效率地与E2F家族中含有异二聚化结构域的成员相互作用并形成异二聚体，进一步支持TFDP-3(HCA661)是DP家族新成员的推测。
实施例7.TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白相互作用形成的异二聚体的DNA结合能力分析(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)。
人宫颈癌细胞系HeLa细胞于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，所用培养基为含100units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin和10％新生小牛血清的DMEM培养基。转染前，HeLa细胞用胰酶消化，用无双抗的含10％新生小牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞稀释于6孔板中，培养至细胞汇合度达到转染所需的90-95％。转染时，1.4μg的E2F DNA和1.4μgDP DNA，或1.4μg的空载体DNA，DNA总量加至2.8μg。
ipofectAMINE 2000reagent(Invitrogen)用来将DNA带入细胞内。HeLa细胞转染24-36小时后，按常规方法制备非变性细胞蛋白提取物，等量的HeLa细胞蛋白提取物加入含有10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid(HEPES；pH7.9)，375mM KCl，12.5mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，15％Ficoll，10mg/ml BSA，and 1mg/ml polydI/dC的EMSA缓冲液中，同时加入0.1ng的放射性32P同位素标记的含有特异性野生型E2F结合位点的寡核苷酸探针(ATTFAAGTTTCGCGCCCTITCCAA)在室温温育10～15分钟。反应混合物然后注入5％非变性聚丙烯酰氨凝胶在4℃恒压180V电泳2.25小时，干胶，在-70℃放射自显影分析4-16小时。为了检测蛋白结合野生型DNA探针的特异性，反应液中加入20倍于野生型探针量的含有E2F突变位点的未标记的双链寡核苷酸探针作为竞争分子(ATTTAAGTTTCGatCCCTITCTCAA)。
如图8所示，因为有内源性E2F基础水平的存在，单个E2F或DP转染时，它们的DNA结合能力仍处在基础水平(显影带2、3、6、9与1比较)，表明单独转染E2F或DP并不能提高其DNA结合活性。当TFDP-1与E2F共转染时，E2F/TFDP-1异二聚体结合DNA的能力与单独转染E2F相比显著地增强了(显影带5与3、8与6、11与9相比)。相反，TFDP-3(HCA661)与E2F共转时，E2F/TFDP-3(HCA661)异二聚体的DNA结合能力并没有得到显著地提高(显影带4与3、7与6、10与9相比)。这表明，TFDP-3(HCA661)蛋白中可能存在着破坏DNA结合力的尚未鉴定的基序，从而导致E2F/TFDP-3异二聚体丧失结合E2F DNA识别位点。
实施例8.TFDP-3(HCA661)的亚细胞定位SV40转化的绿猴肾细胞系COS-7细胞于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，所用培养基为含100units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin和10％新生小牛血清的DMEM培养基。转染前，COS-7细胞用胰酶消化，用无双抗的含10％新生小牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞稀释至8×104cells/ml，各加入1ml于24孔板中，培养至细胞汇合度达到转染所需的90-95％。单独转染时，280ng的EGFP-tagged E2F质粒DNA或280ng FLAG-tagged DP质粒DNA与280ng的空载体DNA，DNA总量加至560ng，同时，pEGFP-N1作为阴性参照。共同转染时，280ng的EGFP-tagged E2F质粒DNA和280ng FLAG-tagged DP质粒DNA，DNA总量加至560ng。LipofectAMINE 2000reagent(Invitrogen)用来将DNA带入COS-7细胞内。转染后24小时用1×PBS稍加洗涤，然后加入-70℃预冷的甲醇在-20℃固定20分钟，加入含0.2％Triton X-100的1×PBS通透细胞膜4分钟。用含1％BSA的1×PBS封闭液封闭非特异性抗体结合位点后，固定的COS-7细胞在室温于含1μg/ml抗FLAG M2单克隆抗体和1％BSA的1xPBS中温育1小时，用1xPBS洗涤三次后，加入含1∶100稀释的tetramethylrhodamineisothiocyanate(TRITC)偶联的山羊抗小鼠IgG的二抗和1％BSA的1x PBS于室温反应1小时。COS-7细胞核用10μg/ml Hoechst 33342逆染，E2F采用EGFP标记和检测。通过配备了CCD的荧光显微镜采集免疫荧光图像，所有图像通过Adobe Photoshop7.0.1版处理。
实验结果表明，当单独转染时，TFDP-3(HCA661)和TFDP-1均定位于COS-7细胞的细胞浆内，E2F-1定位于细胞核内，而E2F-4则定位于细胞浆内(见图9A)。E2F-2、E2F-3也定位于细胞核内，而E2F-5定位于细胞浆内(未显示)。
要发挥功能，DP家族成员必须与E2F家族成员形成异二聚体。因此，我们分析了蛋白与蛋白之间的相互作用对TFDP-3(HCA661)的亚细胞定位的影响。正如所推测的一样，TFDP-3(HCA661)与E2F-1(见图9B)、E2F-2或E2F-3(未显示)共同转染时，与TFDP-1类似，均定位于细胞核内。与E2F的第一个亚家族的定位相反，当与E2F-4(见图9B)或E2F-5(未显示)共同转染时，TFDP-3(HCA661)和TFDP-1仍然定位于细胞浆内。这些数据表明，TFDP-3(HCA661)的亚细胞定位与TFDP-1相一致。
实施例9.TFDP-3(HCA661)的报告基因分析人正常肝细胞系L02于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，所用培养基为含100units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin和10％新生小牛血清的DMEM培养基。转染前，L02细胞用胰酶消化，用无双抗的含10％新生小牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞稀释至1×105cells/ml于24孔板中各加入1ml，并培养细胞使之汇合度达到转染所需的90-95％。报告基因分析中，DNA总量加至560ng，其中含140ng的报告基因6xE2F-firefly luciferase。执行TFDP-3(HCA661)对E2F/TFDP-1介导的转录激活的抑制效应实验中，DNA总量加至1，120ng。执行TFDP-3(HCA661)或TFDP-1对内源性E2F活性的影响时，DNA总量加至840ng。LipofectAMINE 2000reagent(Invitrogen)用来将DNA带入细胞内。L02细胞转染24小时后先用1xPBS稍加洗涤，将残留的培养基去除，然后加入被动裂解缓冲液(PLB)，室温裂解15分钟后，收获裂解液并离心，除去细胞碎片，收获上清，按照厂商提供的操作手册使用双特异性luciferase分析系统分析产物。为了消除转染效率的差异对报告基因6xE2F-firefly luciferase值的影响，每次转染都加入140ng的pRL-SV40Renilla luciferase质粒作为内参。
报告基因分析结果如图10A所示，表明E2F基因和DP基因单独转染时，140ng的TFDP-1对报告基因6xE2F-firefly luciferase产生了大约2倍的转录激活，同样，20ng的E2F-1或E2F-3也分别产生了10倍或30倍的转录激活，70ng的E2F-4或140ngE2F-5也产生了17倍或11倍的转染激活。当E2F与TFDP-1共转染时，别构激活了报告基因6xE2F-firefly luciferase，达到了30至70倍。然而，与TFDP-1形成鲜明对比的是，当E2F与TFDP-3(HCA661)共转染时，观察到了TFDP-3(HCA661)对E2F介导的转录激活产生了显著的抑制效应。同一实验至少重复三次(P＜0.01)。
TFDP-3(HCA661)具有抑制E2F介导的转录激活能力，因此，我们想进一步分析TFDP-3(HCA661)与E2F的相互作用是否能有效地抑制E2F/TFDP-1异二聚体介导的转录激活。实验中，E2F/TFDP-1的各种组合与0、140、280或560ng的TFDP-3(HCA661)共转染L02细胞，采用6xE2F-firefly luciferase报告基因分析系统分析TFDP-3(HCA661)对E2F/TFDP-1异二聚体的作用。
如上所述，所有E2F/TFDP-1的组合显著地提高了6xE2F-firefly luciferase报告基因的转录活性。当E2F/TFDP-1组合在TFDP-3(HCA661)存在时，E2F/TFDP-1的转录活性显著地被抑制了，而且是剂量依赖性的。甚至能完全阻断TFDP-1对E2F的别构激活(如图10B所示)。这个发现表明，尽管TFDP-3(HCA661)是DP家族的一个新成员，但它是作为一个抑制因子发挥功能的，抑制E2F依赖性靶基因的转录调节。
最后，我们也评估了TFDP-3(HCA661)对内源性E2F活性的影响。如期所愿，FLAG-tagged TFDP-1增强了6xE2F-firefly luciferase报告基因的转录活性，而FLAG-tagged TFDP-3(HCA661)则抑制了6xE2F-firefly luciferase报告基因的转录活性，而且是剂量依赖性的(见图10C)，这表明，TFDP-3(HCA661)有能力阻断内源性E2F复合物对6xE2F-firefly luciferase报告基因的转录激活。而且，我们也从用E2F的靶基因CyclinA天然调控序列构建的CyclinA-firefly luciferase报告基因中得到了相似的结果(未显示)。
TFDP-3(HCA661)对E2F介导的转录的抑制能力与TFDP-3(HCA661)/E2F异二聚体丧失结合特异性E2F DNA结合序列的能力相一致。而且，TFDP-3(HCA661)的抑制效应也表明，TFDP-3(HCA661)可能在TFDP-3(HCA661)和TFDP-1共存时扮演着拮抗TFDP-1的角色。
总之，所有上述结果表明，TFDP-3(HCA661)和TFDP-1之间的功能差异可能源于E2F/TFDP-3(HCA661)异二聚体的DNA结合力的丧失，抑制作用的分子基础应该存在于TFDP-3(HCA661)分子中，因为对某一个特定的E2F蛋白而言，其转录活性的高低取决于由E2F蛋白和DP蛋白共同组成的完整的DNA结合结构域的DNA结合能力的强弱。
实施例10.TFDP-3(HCA661)独特功能产生的分子基础的探索为了探索TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白形成的异二聚体的DNA结合能力的丧失以及TFDP-3(HCA661)对E2F转录活性的抑制的分子基础，我们构建了TFDP-3(HCA661)和TFDP-1的替换突变体，采用6xE2F-luciferase报告基因分析系统分析其突变体的转录性质，间接评估TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白形成的异二聚体的DNA结合能力。TFDP-3(HCA661)和TFDP-1的替换突变体以相应质粒为模板，通过PCR方法构建而成。先在替换位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，引物内含有相应的需要替换的碱基，分别与TFDP-3(HCA661)或TFDP-1ORF的反向引物(DP3CF-OA或DP1CF-OA)和正向引物(DP3CF-OS或DP1CF-OS)配对，通过PCR合成两条小片段，然后再通过连接PCR将两条小片段连接成一个完整的基因。
下列突变体以pCDNA3-TFDP-3-FLAG and pCDNA3-TFDP-1-FLAG为模板，所用的突变引物如下所示TFDP-3M，forward，5’-CGG CGC gtc TAC GAT GCC TTA AACGTG-3’；reverse，5’-ATC GTA gac GCG CCG TTT TAT GTT TTT C-3’；TFDP-1M，forward，5’-CGG CGC acc TAC GAT GCC TTA AAC GTG-3’；reverse，5’-ATC GTA ggtGCG CCG TCT TAT GTT TTT C-3’；TFDP-3MR，forward，5’-aag ggc cta cgg cat ttc tccatg aag gtc tgc gag aag GTG CAG AGG-3’；reverse，5’-ctt ctc gcagac ctt cat gga gaa atgccg tag gcc ctt GCC ATT CTTC-3’；TFDP-1MR，forward，5’-atg ggc ctg tgc cgt ctt tcc atgaag gtc tgg gag acg GTG CAG AGG-3’；reverse，5’-cgt ctc cca gac ctt cat gga aag acg gcacag gcc cat GCC ATT CTT C-3’.3D-1H，forward，5’-ggt ctg acc acc AAC TCG GCTCAG-3’；reverse，5’-ctg agc cga gtt GGT GGT CAG ACC-3’；1D-3H，forward，5’-ggt ctgccc acc AAC TCG GCT CAG-3’；reverse，5’-ctg agc cga gtt GGT GGG CAG ACC-3’。
TFDP-3ΔH和TFDP-3ΔD、TFDP-1ΔH和TFDP-1ΔD的结构域替换突变体以3D-1H and 1D-3H为模板，PCR所用的突变引物如下TFDP-3ΔH，forward，5’-acc agcaag aag ACC GTC ATC AAC-3’；reverse，5’-gtt gat gac ggt CTT CTT GCT GGT G-3’；TFDP-1ΔH，forward，5’-agt age aag aag ACG GTC ATC GAC-3’；reverse，5’-gtc gat gaccgt CTT CTT GCT AC-3’；TFDP-3ΔD，forward，5’-gga gag aag aat GGC AAG GGC CTAC-3’；reverse，5’-tag gec ctt gcc ATT CTT CTC TCC-3’；TFDP-1ΔD，forward，5’-gga gagaag aat GGC ATG GGC CTG-3’；reverse，5’-cag gcc cat gcc ATT CTT CTC TCC-3’。
TFDP-3ΔDH以TFDP-3ΔD和TFDP-3ΔH为模板，突变引物如下forward，5’-ggtctg ccc acc AAC TCG GCT CAG-3’；reverse，5’-ctg agc cga gtt GGT GGG CAG ACC-3’.TFDP-1ΔDH以TFDP-1ΔD和TFDP-1ΔH为模板，突变引物如下forward，5-ggt ctg accacc AAC TCG GCT CAG-3；reverse，5-ctg agc cga gtt GGT GGT CAG ACC-3’。
TFDP-3MR2～TFDP-3MR5替换突变体以pCDNA3-TFDP-3-FLAG质粒为模板，突变引物如下TFDP-3MR2，forward，5’-tac aac gaa gtg gca gac gag ctg gtt gcg gag ttc agtgct gcc gac AACC-3’；reverse，5’-gtc ggc agc act gaa ctc cgc aac cag ctc gtc tgc cac ttc gttgta GGAAG-3’；TFDP-3MR3，forward，5’-atc tta cca aac gag tca gct tat gac cag aaa aac ataaga CGGCGC-3’；reverse，5’-tct tat gtt ttt ctg gtc ata agc tga ctc gtt tgg taa gatGTGGTTG-3’；TFDP-3MR4’，forward，5’-aag gag aag aag gag atc aag tgg att ggt ctg cccACCAACTCG-3’；reverse，5’-ggg cag acc aat cca ctt gat ctc ctt ctt ctc ctt GGAGATG-3’；TFDP-3MR5，forward，5’-gca gac gag ctg gtt gcg gag ttc agt GCT GCC AGC-3’；reverse，5’-act gaa ctc cgc aac cag ctc gtc tgc CACTTC CTG-3’。
下列突变体以pCDNA3-TFDP-3-FLAG质粒为模板，突变引物如下TFDP-3CY，forward，5’-G ACC ACT TCC tac CAG GAA GTG-3’；reverse，5’-CAC TTC CTG gtaGGAAGT GGT C-3’；TFDP-3QN，forward，5’-C ACT TCC TGC aac GAA GTG GTG-3’；reverse，5’-CAC CAC TTC gtt GCA GGAAGT G-3’；TFDP-3VA，forward，5’-CAG GAAGTG gca GGC GAG CTG-3’；reverse，5’-CAG CTC GCC tgc CAC TTC CTG-3’；TFDP-3GD，forward，5’-GAA GTG GTG gac GAG CTG GTC-3’；reverse，5’-GAC CAGCTC gtc CAC CAC TTC-3’；TFDP-3KE，forward 5’-CTG GTC GCC gag TTC AGAGC-3’；reverse，5’-GC TCT GAA ctc GGC GAC CAG-3’；TFDP-3RS，forward，5’-C AAGTTC agt GCT GCC AGC AAC-3’；reverse，5’-GTT GCT GGC AGC act GAA CTT G-3’；TFDP-3SD，forward，5’-C AGA GCT GCC gac AAC CAC GC-3’；reverse，5’-GC GTGGTT gtc GGCAGC TCT G-3’。
所有突变体测序校正后，经Hind III-BamHI限制性内切酶消化后，克隆进pCDNA3-FLAG表达载体中，图11显示了突变体的氨基酸序列。图12A显示了各个突变体的蛋白表达。通过6xE2F-luciferase报告基因分析系统分析其突变体对E2F-4转录活性的影响，间接评估TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白形成的异二聚体的DNA结合能力。具体实验程序与实施例9中所述方法相同。
首先，我们根据以前的研究结果分析了TFDP-3(HCA661)与TFDP-1的DNA结合结构域的氨基酸组成的差异，在RRXYD DNA识别模序中对第三个氨基酸进行了单个氨基酸替换，产生两个替换突变体(TFDP-3Maa164T→V；TFDP-1Maa169V→T)，分析该位氨基酸的非保守性替换是否是导致TFDP-3(HCA661)的独特功能的原因。6xE2F-firefly luciferase报告基因分析表明，该位氨基酸的替换与TFDP-3(HCA661)的功能无关。此外，根据晶体结构，在DNA结合结构域内，另有13个氨基酸参与了与蛋白的异二聚化和DNA磷酸骨架的相互作用。其中，在TFDP-3(HCA661)中，有三个氨基酸与TFDP-1和TFDP-2不同，为此，我们设计了一个13个氨基酸的替换(TFDP-3MRaa109-121MGLCRLSMKVWET→KGLRHFSMKVCEK；TFDP-1MRaa114-126KGLRHFSMKVCEK→MGLCRLSMKVWET)。然而，这些替换仍然不能逆转TFDP-3(HCA661)的功能。
运用类似的序列替换分析，我们分析了TFDP-3(HCA661)和TFDP-1的全长氨基酸序列，根据结构域的组成，将其分成4个组成部分，即氨基端未知功能区(UNT)、DNA结合结构域(DBD)、异二聚化结构域(HD)和羧基端未知功能区(UCT)，并构建了3D-1H(含TFDP-3(HCA661)的UNT和DBD和TFDP-1的HD和UCT)和1D-3H(含TFDP-1的UNT和DBD和TFDP-3(HCA661)的HD和UCT)，报告基因分析表明，1D-3H产生的E2F介导的转录激活水平相当于野生型TFDP-1产生的水平，不受TFDP-3(HCA661)的AA192-405的影响。相反，3D-1H表现出对E2F介导的转录激活明显的抑制效应。这表明，TFDP-3(HCA661)独特功能产生的分子基础应该位于TFDP-3(HCA661)的前半部分(AA1-191)。
为了进一步分析功能产生的分子基础，我们通过PCR方法从3D-1H and 1D-3H中衍生出了如下的替换突变体TFDP-3ΔD(含TFDP-1的DBD)、TFDP-1ΔD(含TFDP-3(HCA661)的DBD)、TFDP-3ΔH(含TFDP-1的HD)、TFDP-1ΔH(含TFDP-3(HCA661)的HD)、TFDP-3ΔDH(含TFDP-1的DBD和HD)、TFDP-1ΔDH(含TFDP-3(HCA661)的DBD和HD)。6xE2F-firefly luciferase报告基因结果表明，TFDP-3ΔH和TFDP-1ΔH产生的转录抑制或激活水平分别与它们相应的野生型蛋白相似，相反，随着DNA结合结构域的替换，TFDP-3ΔDH和TFDP-3ΔD产生了类似TFDP-1的对E2F转录的别构激活，而TFDP-1ΔDH和TFDP-1ΔD则产生了类似TFDP-3(HCA661)的对E2F转录的抑制效应。这些数据表明，TFDP-3(HCA661)高效率地抑制E2F介导的转录激活的功能区位于TFDP-3(HCA661)的DNA结合结构域(见图12B)。
接下来，我们采用与TFDP-3MR和TFDP-3M构建方法相同的策略，将TFDP-3(HCA661)的DNA结合结构域中与TFDP-1有差异的其余13个氨基酸划分成三部分，分别用TFDP-1相应氨基酸序列替换TFDP-3(HCA661)序列，产生TFDP-3MR2(AA130-145CQEVVGELVAKFRAAS→YNEVADELVAEFSAAD)，TFDP-3MR3(AA148-161ASPNESAYDVKNIK→ILPNESAYDQKNIR)和TFDP-3MR4(AA179-190REKKKIKWIGLT→KEKKEIKWIGLP)。报告基因分析显示，TFDP-3MR3和TFDP-3MR4替换突变体没有提高E2F的转录活性，产生了与野生型TFDP-3(HCA661)相似的抑制效应。相反，TFDP-3MR2产生的转录激活水平与单独E2F转染时所产生的转染激活相似。该突变体也具有抑制E2F/TFDP-1转当录激活的能力(未显示)。另一个在TFDP-3MR2内部衍生出的替换突变体TFDP-3MR5(AA134-142VGELVAKFR→ADELVAEFS)对E2F介导的转录激活具有较弱的抑制作用。因此，TFDP-3(HCA661)DNA结合结构域的AA130-145序列是产生抑制效应所必需的(见图12C)。此外，为了寻找关键性氨基酸，我们在该区域内产生了另一组单个氨基酸替换突变体TFDP-3CY(AA130C→Y)，TFDP-3QN(AA131Q→N)，TFDP-3VA(AA134V→A)，TFDP-3GD(AA135G→D)，TFDP-3KE(AA140K→E)，TFDP-3RS(AA142R→S)和TFDP-3SD(AA145S→D)，但结果表明，TFDP-3(HCA661)功能的产生可能是多个氨基酸共同作用的结果。
总之，报告基因分析结果表明，TFDP-3(HCA661)的DNA结合结构域(AA108-AA191)是导致TFDP-3(HCA661)与E2F蛋白形成的异二聚体丧失DNA结合能力的根本原因，从而抑制E2F的转录活性，与蛋白的其余部分的空间结构无关，包括异二聚化结构域。对DNA结合结构域的进一步分析表明，AA130-AA145(CQEVVGELVAKFRAAS)是TFDP-3(HCA661)对E2F的DNA结合产生抑制作用的必要条件。
sequence-listing.txtSEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>一种肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽<130>FPI05135<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>405<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Lys Tyr Val Ser Leu Thr Glu Ala Asn Glu Glu Leu Lys Val1 5 10 15Leu Met Asp Glu Asn Gln Thr Ser Arg Pro Val Ala Val His Thr Ser20 25 30Thr Val Asn Pro Leu Gly Lys Gln Leu Leu Pro Lys Thr Phe Gly Gln35 40 45Ser Ser Val Asn Ile Asp Gln Gln Val Val Ile Gly Met Pro Gln Arg50 55 60Pro Ala Ala Ser Asn Ile Pro Val Val Gly Ser Pro Asn Pro Pro Ser65 70 75 80Thr His Phe Ala Ser Gln Asn Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro Pro Trp85 90 95Ala Gly Gln His Asn Arg Lys Gly Glu Lys Asn Gly Met Gly Leu Cys100 105 110Arg Leu Ser Met Lys Val Trp Glu Thr Val Gln Arg Lys Gly Thr Thr115 120 125Ser Cys Gln Glu Val Val Gly Glu Leu Val Ala Lys Phe Arg Ala Ala130 135 140Ser Ash His Ala Ser Pro Asn Glu Ser Ala Tyr Asp Val Lys Asn Ile145 150 155 160Lys Arg Arg Thr Tyr Asp Ala Leu Asn Val Leu Met Ala Met Asn Ile165 170175Ile Ser Arg Glu Lys Lys Lys Ile Lys Trp Ile Gly Leu Thr Thr Asn180 185 190Ser Ala Gln Asn Cys Gln Asn Leu Arg Val G1u Arg Gln Lys Arg Leu
sequence-listing.txt195200 205Glu Arg Ile Lys Gln Lys Gln Ser Glu Leu Gln Gln Leu Ile Leu Gln210 215 220Gln Ile Ala Phe Lys Asn Leu Val Leu Arg Ash Gln Tyr Val Glu Glu225 230 235 240Gln Val Ser Gln Arg Pro Leu Pro Asn Ser Val Ile His Val Pro Phe245 250 255Ile Ile Ile Ser Ser Ser Lys Lys Thr Val Ile Asn Cys Ser Ile Ser260 265 270Asp Asp Lys Ser Glu Tyr Leu Phe Lys Phe Ash Ser Ser Phe Glu Ile275 280 285His Asp Asp Thr Glu Val Leu Met Trp Met Gly Met Thr Phe Gly Leu290 295 300Glu Ser Gly Ser Cys Ser Ala Glu Asp Leu Lys Met Ala Arg Asn Leu305 310 315 320Val Pro Lys Ala Leu Glu Pro Tyr Val Thr Glu Met Ala Gln Gly Thr325 330 335Phe Gly Gly Val Phe Thr Thr Ala Gly Set Arg Ser Asn Gly Thr Trp340 345 350Leu Ser Ala Ser Asp Leu Thr Asn Ile Ala Ile Gly Met Leu Ala Thr355 360 365Ser Ser Gly Gly Ser Gln Tyr Ser Gly Ser Arg Val Glu Thr Pro Ala370 375 380Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asn Ash Asp Asp Asp Leu Ser Glu385 390 395 400Asn Asp Glu Asp Asp405<210>2<211>1218<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2atggcaaaat atgtcagtct cactgaagct aacgaagaac tcaaggtctt aatggacgag60aaccagacca gccgccccgt ggccgttcac acctccaccg tgaacccgct cgggaagcag120ctcttgccga aaacctttgg acagtccagt gtcaacattg accagcaagt ggtaattggt180atgcctcaga gaccagcagc atcaaacatc cctgtggtag gaagcccaaa cccacccagc240
sequence-listing.txtactcactttg cctctcagaa ccagcattcc tactcctcac ctccttgggc cgggcagcac 300aacaggaaag gagagaagaa tggcatgggc ctgtgccgtc tttccatgaa ggtctgggag 360acggtgcaga ggaaagggac cacttcctgc caggaagtgg tgggcgagct ggtcgccaag 420ttcagagctg ccagcaacca cgcctcacca aacgagtcag cttatgacgt gaaaaacata 480aaacggcgca cctacgatgc cttaaacgtg ctgatggcca tgaatatcat ctccagggag 540aaaaagaaga tcaagtggat tggtctgacc accaactcgg ctcagaactg tcagaactta 600cgggtggaaa gacagaagag acttgaaaga ataaagcaga aacagtctga acttcaacaa 660cttattctac agcaaattgc tttcaagaac ctggtgctga gaaaccagta tgtggaggag 720caggtcagcc agcggccgct gcccaactca gtcatccacg tgcccttcat catcatcagc 780agtagcaaga agaccgtcat caactgcagc atctccgacg acaaatcaga atatctgttt 840aagtttaaca gctcctttga aatccacgat gacacagaag tgctgatgtg gatgggcatg 900acttttgggc tagagtccgg gagctgctct gccgaagacc ttaaaatggc cagaaatttg 960gtcccaaagg ctctggagcc gtacgtgaca gaaatggctc agggaacttt tggaggtgtg1020ttcacgacgg caggttccag gtctaatggc acgtggcttt ctgccagtga cctgaccaac1080attgcgattg ggatgctggc cacaagctcc ggtggatctc agtacagtgg ctccagggtg1140gagaccccag cagtcgagga ggaagaggag gaggacaaca acgatgacga cctcagtgag1200aatgacgagg atgactga 1218
权利要求
1.一种肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有图1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同或相似的功能。
2.一种包含权利要求1所述的肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的融合蛋白。
3.一种权利要求1或2所述的抗原蛋白质在制备治疗肝癌药物中的应用。
4.一种编码权利要求1所述的肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的基因。
5.一种肝癌-睾丸特异性抗原肽，其具有如下(c)或(d)所述的氨基酸序列(c)其为上述肝癌-睾丸特异性抗原蛋白质的特异性DNA结合结构域的含84个氨基酸的肽段，其氨基酸序列为在图1所示的序列中起止AA108-AA191；(d)将(c)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生肽，且该衍生肽与(a)的肽具有相同或相似的功能。
6.一种包含权利要求5所述的肝癌-睾丸特异性抗原肽的融合蛋白。
7.一种权利要求5或6所述的抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.一种编码权利要求5所述的肝癌-睾丸特异性抗原肽的基因。
全文摘要
本发明涉及一种肝癌－睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽。该肝癌－睾丸特异性抗原蛋白质为具有图1所示的氨基酸序列的蛋白质及其衍生蛋白质。所述的抗原肽的氨基酸序列为在图1所示的序列中起止AA108－AA191。本发明提供的肝癌－睾丸特异性抗原蛋白质和抗原肽在pRB/E2F信号转导中可作为E2F活性阻断剂，对其同源类似物TFDP－1发挥拮抗作用。该蛋白质/肽可作为CT抗原或抗原基因而制成疫苗，这种肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)－I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，激发免疫反应而达到治疗癌症的目的，从而可以应用于制备治疗癌症，特别是肝癌的药物中。
文档编号C12N15/12GK1872877SQ20051007339
公开日2006年12月6日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者陈慰峰, 乔欢, 庞学雯, 王俞, 田婵 申请人:北京大学