乳蔗糖高含量糖及其制造方法和用途的制作方法

专利名称：乳蔗糖高含量糖及其制造方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于乳蔗糖高含量糖及其制造方法和用途，更详细地说，是关于作为糖组成，含有大于或等于70％的乳蔗糖、合计不到3％的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的乳蔗糖高含量糖及其制造方法，进而是关于以将该乳蔗糖高含量糖通过使用树脂的层析，提取作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的级分为特征的高纯度乳蔗糖的制造方法，进一步涉及结晶乳蔗糖的制造方法。
背景技术：
近年来，低聚糖等各种糖类具有的功能正陆续变得明确。在功能性低聚糖中，乳蔗糖[β-D-半乳糖基-(1，4)-α-D-葡糖基-(1，2)-β-D-果糖苷]具有难消化性、双歧菌繁殖促进性、难致龋性、保湿性等优良的机能，是在食品、化妆品、医药等广泛用途中有用的低聚糖。乳蔗糖是在含有蔗糖和乳糖的水溶液中，使来自属于节杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶发生作用，通过该β-呋喃果糖苷酶催化的糖转移反应而工业制造的(参照特开平3-27285号公报)。但是，仅用β-呋喃果糖苷酶的转移反应，所得到的反应物的乳蔗糖的含量，作为糖组成低到大约30％程度，另外，该反应物含有较多量的未反应的乳糖，蔗糖，反应残渣的葡萄糖、果糖，副产物的1-蔗果三糖、果糖基乳蔗糖等，因而难说能够充分发挥乳蔗糖本来的机能的糖组合物。因此，为了提高乳蔗糖的纯度，在酶反应后，使未反应的乳糖部分地结晶化，然后或进行过滤·去除，或在酶反应时，添加转化酶缺失酵母来实施使葡萄糖等单糖被利用的方法，来制造含乳蔗糖糖类(注册商标“乳果Oligo”)(参照藤田孝辉，“バイオセパレ-シヨンプロセス便览”(生化分离工艺便览)，196-201页，共立出版发行，1996年)。尤其，在β-呋喃果糖苷酶的转移反应中并用转化酶缺失酵母的方法，不仅从反应液去除葡萄糖等单糖，而且通过去除单糖，转移反应倾向于乳蔗糖的生成，因此有乳蔗糖的生成量也提高这样的益处，生成的乳蔗糖达到作为反应物的糖组成的约65％(参照特开平4-293494号公报)。再有，在原料中将该乳蔗糖含量已提高的反应物进行使用离子交换树脂的层析，将乳蔗糖纯度提高至约80％，接着，借助使用十八烷基二氧化硅树脂(ODS)的层析就能够得到纯度约99％的精制乳蔗糖(参照藤田孝辉，“バイオセパレ-シヨンプロセス便览”(生化分离工艺便览)，196-201页，共立出版发行，1996年)。
但是，来自节杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶，除将蔗糖的果糖基转移至乳糖上而生成乳蔗糖的反应以外，也催化作为副反应的将果糖基转移至蔗糖自身上而生成1-蔗果三糖的反应，或催化将果糖基再转移至已生成的乳蔗糖上而生成果糖基乳蔗糖的反应。作为副产物的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖等的生成，从乳蔗糖的制造这一观点看，是不可取的，成为使乳蔗糖生成量降低的一个原因。另外，上述的副产物，不被转化酶缺失酵母利用，因此蓄积在使β-呋喃果糖苷酶和转化酶缺失酵母同时作用而得到的反应物中，它们的含量都达到5至10％。再有，在以含有较多量的作为副产物的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的反应物为原料，制造高纯度乳蔗糖时，由于必须使用上述的离子交换树脂和十八烷基二氧化硅树脂(ODS)的层析等多种精制手段，存在进行精制得到的高纯度乳蔗糖的收率低这样的问题，据认为不适合高纯度乳蔗糖的工业制造。
另一方面已知，含乳蔗糖粉末，通过提高其纯度而减低吸湿性，可得到稳定性较高的粉末(特开平4-281795号公报)。但是，在此后的研究中已清楚，该粉末在夏季的高温高湿的环境下，例如在温度27℃、相对湿度75％时，也极易吸湿、是不稳定的，处理是困难的，因而希望提供更稳定的乳蔗糖固态物。
另一方面，Gad Avigad在Journal Biological Chemistry，1957年，第229卷，121至129页中公开了乳蔗糖的结晶，是从90％(V/V)乙醇水溶液得到的含5水结晶乳蔗糖。但是，该结晶吸湿性强，并且，结晶化往往是困难的，因而结晶乳蔗糖尚未达到工业规模的生产。

发明内容
鉴于这样的状况，本发明的课题是提供，作为副产物的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖含量低，而且作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖的乳蔗糖高含量糖，另外，提供适合于工业地制造的乳蔗糖高含量糖及作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的高纯度乳蔗糖的制造方法，还在于提供结晶乳蔗糖的制造方法及含有吸湿性低的结晶乳蔗糖的固态组合物。
为了解决上述的课题，本发明人等，在使用β-呋喃果糖苷酶的乳蔗糖制造中，不仅着眼于并用蔗糖非利用性酵母，而且也着眼于β-呋喃果糖苷酶由来和反应条件，研究了乳蔗糖的制造方法。其结果已清楚，尽管过去认为即使并用β-呋喃果糖苷酶和转化酶缺失酵母，由该反应产生的反应物中的乳蔗糖含量，作为糖组成也仅达到最大约65％，但完全意外的是，在含有蔗糖和乳糖的水溶液中，并用来源于属于相同专利申请人的特开平9-224665号公报中记载的芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母进行反应，通过将反应液的pH控制在4.0至5.5，所得到的反应物中的乳蔗糖含量，作为糖组成达到70％以上。再有，考查所得到的反应物时明确，作为副产物的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖，作为糖组成极低至合计不到3％。而且也清楚，如果以该反应物作为原料，用层析进行精制，就能够容易以高收率制备更高纯度的乳蔗糖。另外，意外地发现，从上述副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量低的乳蔗糖的过饱和水溶液容易析出乳蔗糖(含5水结晶)结晶，发现获得的结晶乳蔗糖，即使在夏季的高温高湿的环境下，例如温度27℃、相对湿度75％时，吸湿性也低，是处理容易的乳蔗糖的固态制品，除此之外，已清楚，能够有利地利用于含有结晶乳蔗糖的各种固态物的制造中。
即，本发明提供作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％的乳蔗糖高含量糖；还提供以在含有蔗糖和乳糖的水溶液中使来源于属于芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母发生作用，形成作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％的反应物，提取该反应物为特征的乳蔗糖高含量糖的制造方法；以及提供以将该乳蔗糖高含量糖通过使用树脂的层析，得到作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的级分为特征的高纯度乳蔗糖的制造方法；进而提供用上述方法得到的乳蔗糖高含量糖或者高纯度乳蔗糖制造结晶乳蔗糖的方法及含有该乳蔗糖的各种固态组合物，由此解决上述课题。
按照本发明，即使不使用柱层析等精制方法，从蔗糖和乳糖出发，仅用同时使用β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母的生成反应，可以制造作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、而且副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量作为糖组成低至合计不到3％的乳蔗糖高含量糖。再有，将该乳蔗糖高含量糖通过使用树脂的层析，能够容易地制造作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的高纯度乳蔗糖。另外，按照本发明，使以往结晶化困难的乳蔗糖从乳蔗糖的过饱和水溶液容易地析晶成为可能，并且，所得到的结晶乳蔗糖，即使在夏季的高温高湿的环境下，吸湿性也低，处理是容易的，通过含有该结晶乳蔗糖，就能够提供吸湿性低的、稳定的各种固态组合物。
具体实施例方式
本发明的乳蔗糖高含量糖，作为糖组成，含有大于或等于70％乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖，其特征在于由β-呋喃果糖苷酶的副反应生成的1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量，与以往的含乳蔗糖糖类相比极低。
本发明的乳蔗糖高含量糖中所含的乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖以外的糖类，可举出未反应的蔗糖和乳糖、乳糖的碱性异构化物乳果糖、因β-呋喃果糖苷酶的作用产生的蔗糖的分解物葡萄糖和果糖、以及由蔗糖非利用性酵母作用产生的葡萄糖和乳糖的发醇产物甘油等。也如在后述的实施例中所示，这些糖类的大部分，未被β-呋喃果糖苷酶分解，不被蔗糖非利用性酵母利用·分解的乳糖。
本发明的乳蔗糖高含量糖的制造方法(以下，有时只称为“本发明的制造方法”或者“该制造方法”)，以利用来自芽孢菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母为特征。本发明中所说的β-呋喃果糖苷酶意味着，至少使蔗糖、棉子糖和吡喃葡糖基蔗糖的β-呋喃果糖苷键水解，而使果糖游离的反应以及以这些具有β-呋喃果糖苷键的糖类作为糖供体，将β-呋喃果糖基转移至选自糖供体以外的其他糖类、糖醇和醇类的受体上的反应进行催化的酶。能够在本发明中利用的β-呋喃果糖苷酶是这样地定义的源自属于芽孢杆菌属的微生物，而且和在下列详述的本发明中使用的蔗糖非利用性酵母并用而发生作用时，只要是能够制造作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖，而且副产物蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量作为糖组成含有低至合计不到3％乳蔗糖高含量糖，制备方法等就不特别的限制。例如，在和本申请相同的专利申请人的特开平9-224665号公报中公开的来自芽孢杆菌属种V230(FERM BP-5054)起源的天然型β-呋喃果糖苷酶，以及和本申请相同的申请人的特开平10-66586号公报中公开的、使用编码上述β-呋喃果糖苷酶的DNA、用基因重组技术制备成的重组型的β-呋喃果糖苷酶都能够有利地利用于本发明。不用说，在重组型酶的场合，从属于芽孢杆菌属的微生物以外的宿主细胞得到的β-呋喃果糖苷酶在本发明中也能够利用。再有，对同一号公报中公开的编码β-呋喃果糖苷酶的DNA应用蛋白质工程学的技法得到的变异酶只要实质上使期待的转移作用不消失，也能够在本发明中利用。
所谓在本发明中所说的蔗糖非利用性酵母意味着，能够利用单糖类，但不能利用和/或不能分解二糖以上的低聚糖类的酵母。本发明中采用的蔗糖非利用性酵母，只要是可以利用葡萄糖和果糖，但不能利用和/或不能分解蔗糖、乳糖和乳蔗糖的酵母，其种类就不特别地限制。例如，用各种突变剂使从天然分离的酵母发生突变，使转化酶缺失，或者也可以使用使蔗糖利用能力丧失，根据目的而培育成的酵母。另外，作为转化酶缺失酵母，已知的公知菌酿酒酵母ATCC56741或酿酒酵母ATCC56742等都能有利地用于本发明。
成为本发明的制造方法中的原料的蔗糖和乳糖，其制备方法或形态不特别地限制，例如，包括市售品，由天然分离的调制品、酶方法或者化学方法制备乃至合成的调制品，进而，在进行本发明的制造方法中的酶反应或在蔗糖非利用性酵母对单糖的利用中，或在由该制造方法产生的生成物的利用中，在不产生妨碍的范围内，也可以是含有这样的糖类以外的夹杂物质的调制品，或组合像以上的调制品而组成的组合物。
同时使用来自属于芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母，如果在包含蔗糖和乳糖(以下，指代蔗糖和乳糖的任一个或者两者，有时称为“底物”)的水溶液中，除了将反应液的pH控制在4.0至5.5以外，在根据所用的β-呋喃果糖苷酶的酶学的性质和蔗糖非利用性酵母的生理学的性质适宜地选择的条件下发生作用，就能够得到作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、而且副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖含量作为糖组成低至合计不到3％的反应物。仅以该乳蔗糖生成反应得到的反应物的乳蔗糖含量，通常作为糖组成是大于或等于70％、不到80％，达不到80％或以上。作为乳蔗糖生成反应的条件，例如在利用来自属于相同专利申请人的特开平9-224665号公报中公开的芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酿酒酵母ATCC56741时，该酶不完全失活，而且该酵母能够利用葡萄糖和乳糖的条件，即，温度通常大约0至40℃的范围，合适的是希望大约15至35℃的范围，pH，通常控制在4.0至5.5的范围是可取的。反应混合物中的底物浓度，只要是可以使所希望的反应进行而得到反应物，作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖，而且作为糖组成，副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量合计不到3％，就不特别地限制，例如，通常使蔗糖和乳糖分别是0.1至40质量％的范围，希望优选1至30质量％的范围，优选两者的量比为1∶0.65至1.3。
关于β-呋喃果糖苷酶的使用量，相对于反应原料(底物)中的蔗糖的每1g干燥质量，通常是0.1至50单位的范围，合适的是希望达到0.5至10单位的范围。再者，所谓本说明书中所说的β-呋喃果糖苷酶活性的1单位意味着，按照相同专利申请人的特开平9-224665号公报中记载的方法，在pH6.0、40℃以蔗糖作为底物进行反应时，每1分钟使还原能力增加相当于2μmol的D-葡萄糖的量的酶量。
关于蔗糖非利用性酵母的使用量，相对于反应原料(底物)中的蔗糖的每1g干燥质量，通常，以湿质量计0.01至1g的范围，合适的是希望达到0.05至0.2g的范围。
同时使用β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母的方法，只要是使所得到的反应物，作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖，而且副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量合计不到3％，就不特别地限制，例如，可以在含有蔗糖和乳糖的水溶液中同时或者在不同时刻添加β-呋喃果糖苷酶和酵母使其发生作用，或者在反应中适宜地追加β-呋喃果糖苷酶和酵母的任一个或两者使其发生作用。再有，在各自的反应容器中进行利用β-呋喃果糖苷酶反应和蔗糖非利用性酵母的处理，通过使各个的反应液彼此循环也可以连续地发生反应，在像这样的情况下，使用固定化β-呋喃果糖苷酶和固定化蔗糖非利用性酵母的生物反应器能够有利地利用。
同时使用β-呋喃果糖苷酶和非利用性酵母进行反应的时间，可以根据同时使用β-呋喃果糖苷酶和非利用性酵母的方法或反应进行的程度适宜地选择，通常是2至200小时的范围，合适的是希望10至80小时的范围。
反应中使用的β-呋喃果糖苷酶和/或蔗糖非利用性酵母，根据需要，利用离心分离、膜过滤等方法分离、回收反应物，也能够再在该反应中有利地实施使用。
通过采用像以上的本发明的乳蔗糖高含量糖的制造方法，作为乳蔗糖高含量糖，能够得到作为糖组成含有大于或等于70％，而且，副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量作为糖组成低至合计不到3％的反应物。这样的含有乳蔗糖高含量糖，能够以原封不动地状态使用，另外，通过碱处理将残存的乳糖部分地异构化成乳果糖，而使乳糖含量减低，成为抑制所含有的乳糖的结晶析出的乳蔗糖高含量糖后，也可以随意使用。再有，用惯用的方法，例如由活性炭处理等引起的脱色、由离子交换树脂处理等引起的的脱盐、由碳酸浸渍使得杂质不溶化、通过结晶化使乳糖去除、使用硅藻土等助剂的过滤、使用蒸发器等的浓缩，根据需要，再利用从喷雾干燥等选择的适宜的工艺精制至所要求的水平的纯化制品，能够利用于各种用途。
另外，也可以本发明的乳蔗糖高含量糖作为原料，再借助使用离子交换树脂的层析进行精制，回收作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的级分，进行浓缩，形成糖浆状高纯度乳蔗糖，或者再使用从喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥等中选择的适宜的干燥工艺使其形成粉末化的粉末或者颗粒制品，用于各种用途。
另外，也可以使用已上述的乳蔗糖高含量糖或者高纯度乳蔗糖，形成乳蔗糖的过饱和水溶液，接着，使结晶乳蔗糖析晶，有利地实施提取该结晶乳蔗糖。作为结晶条件，只要是乳蔗糖的过饱和水溶液，使结晶乳蔗糖析出就行，通常，乳蔗糖浓度大于或等于75％的水溶液是合适的。如果具体地说明，例如以纯度约大于或等于75％、更希望大约80至95％的乳蔗糖形成浓度约75至95质量％或者的浓度，其溶液的温度，只要是溶液不发生冻结，并且在结晶的熔点以下、不容易引起乳蔗糖的褐变、分解的温度，例如使水分大约5至25质量％的溶液在20至60℃进行析晶就行。另外，在进行结晶时，为了调整溶液的过饱和度、粘度等，例如使甲醇、乙醇、丙酮等共存也是随意的。
析晶方法，通常使含有过饱和乳蔗糖溶液的较高温的溶液在助结晶罐中，希望使种晶共存0.1至20质量％，一边慢慢地搅拌一边缓冷，促进结晶，而成为糖膏(マスキツト)就行。
从析晶了的糖膏制造结晶乳蔗糖的方法，只要能够获取结晶乳蔗糖就行，例如，可以利用分蜜方法、块粉碎方法、流化造粒方法、喷雾干燥法等公知的方法。
例如，分蜜方法，通常是使用篮式离心分离机，使结晶乳蔗糖和糖蜜分离的方法，根据需要，向该结晶中喷雾少量的冷水，进行洗净也是容易的，对制造较高纯度的结晶乳蔗糖是合适的。其他的三种方法不分离糖蜜，因而虽然在得到的结晶制品中未能使纯度上升，但具有产品收获量多的特征。因此，在本制品的情况下，通常在结晶制品中，在乳蔗糖以外含有来自原料或者制造工艺的糖类，例如蔗糖、乳糖等。
在喷雾干燥方法的情况下，通常用高压泵从喷嘴将结晶率约20至50％的糖膏喷雾，在结晶粉末不熔融的温度，例如用约40至65℃的暖风干燥，接着，如果用温风进行干燥熟化，就能够容易地制造非吸湿性或者难吸湿性的含有结晶的粉末。
另外，块粉碎法，通常将结晶率大约10至60％的糖膏静置约0.5至5天，使全体结晶固化成块状，再用粉碎或者切削等方法将其破碎，进行干燥，就能够容易地制造含有非吸湿性、难吸湿性的结晶的粉末。
另外，按照常规方法，将含乳蔗糖的水溶液加热浓缩至水分低于5质量％，形成呈熔融状态的乳蔗糖的过饱和水溶液，在低于或等于结晶的熔点的温度，向该水溶液中混捏种晶，使其直接形成各种状态，例如粉体、颗粒、棒状、板状、立方体等，制造非吸湿性或者难吸湿性的含结晶的固体也是随意的。
由本发明的制造方法得到的乳蔗糖高含量糖和高纯度乳蔗糖，还有结晶乳蔗糖，在和以往公知的乳蔗糖及含乳蔗糖糖类相同的用途中，例如作为甜味剂、难消化性甜味剂、低致龋性甜味剂、保湿剂、淀粉老化防止剂、整肠剂、矿物吸收促进剂等，在包括健康食品、饮料的饮食品领域、化妆品领域、医药领域、饲料领域等各种领域能够有利地利用。尤其，结晶乳蔗糖，除了上述的各种机能以外，实质上是非吸湿性的，是流动性的，不容易粘附、固着，容易处理，具有在其包装、运输、贮藏等的管理上需要的物和人的经费能够大幅度地削减的特征。
另外，本发明的结晶乳蔗糖是实质上非吸湿性乃至难吸湿性的粉末，耐热性高，稳定性也良好，因此作为以往极难形成的各种固态组合物，例如粉末状混合甜味剂，巧克力，口香糖，速溶果汁，快餐汤，颗粒、片剂等的固定抑制剂，赋形剂、增量剂、粉末基质等，希望使含有大于或等于1质量％结晶乳蔗糖，例如即使制造饮食品、化妆品、医药、成形物等各种固态组合物，进而作为试剂、化学工业原料等也能够有利地利用。
另外，本发明的乳蔗糖，与其他的结晶糖类，例如麦芽糖、乳糖、麦芽糖醇、海藻糖、帕拉金糖、蔗糖等，希望相对结晶乳蔗糖的质量，以0.01至100倍量的配合比并用，也能够有利地实施吸湿性低、操作容易的各种固态组合物的制造。
再有，像上述那样制作而得到的高纯度乳蔗糖粉末品或者结晶品，以适宜的水溶性高分子，例如茁霉多糖、水溶性茁霉多糖醚、水溶性茁霉多糖酯、明胶、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、海藻多糖类等作为结合剂，利用常规方法造粒，形成流动性优良、处理容易的造粒品，也能够有利地实施在各种用途中利用。
以下，基于实施例更详细地说明本发明。
实施例1乳蔗糖高含量糖的制造实施例1-1β-呋喃果糖苷酶的制备按照相同专利申请人的特开平9-224665号公报中记载的方法，在作为碳源含有蔗糖的培养基中以40L的培养规模培养芽孢杆菌种V230(FERM BP-5054)。继续按照上述公报中记载的方法，离心分离培养物，提取约38L的其上清液，进行β-呋喃果糖苷酶的活性测定，证实了该培养上清液显示β-呋喃果糖苷酶活性。将上述的培养上清液进行UF膜浓缩，得到每1ml具有约360单位的β-呋喃果糖苷酶活性的粗酶液360ml。继续按照上述公报中记载的方法，将该粗酶液供给使用“DEAE-トヨパ-ル”凝胶(东曹株式会社制)的离子交换层析、使用“ブチル-トヨパ-ル”凝胶(东曹株式会社制)的疏水层析、以及再供给使用“DEAE-トヨパ-ル”凝胶的离子交换层析，在7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳中，得到显示单一的条带的β-呋喃果糖苷酶的精制标准品。得到的精制标准品的比活性是每1mg蛋白质大约205单位。
实施例1-2蔗糖非利用性酵母的制备在500ml容量的三角形烧瓶中放入200ml由2.0％(w/v)葡萄糖、2.0％(w/v)酵母提取物和水构成的液体培养基，在加压釜中进行121℃、20分钟灭菌，然后冷却，接种酿酒酵母ATCC56741，以在27℃，以230r/min进行24小时旋转振荡培养的培养液作为种培养。在容量30L的发酵器中放入和种培养相同组成的培养基，进行加热灭菌、冷却，达到温度27℃后，接种1％(容量/容量)种培养液，一边在温度27℃保持pH4.0至7.0，一边进行48小时通气搅拌培养。培养后，离心分离(8000rpm、20分钟)培养液，该酵母的菌体按湿质量，回收约680g。
实施例1-3乳蔗糖的生成反应将分别含有20质量％的蔗糖和乳糖的水溶液调整成pH6.0，以每1g蔗糖1单位以及以每固态物质量为6.9％的比例分别向其中加入实施例1-1中制备的β-呋喃果糖苷酶精制标准品和实施例1-2中制备的酵母，一边用1N的氢氧化钠溶液将该反应液控制成pH4.0至5.5，一边在30℃反应24小时和42小时。反应后，用高效液相层析(HPLC)测定反应液的糖组成。HPLC使用“TSK-GEL AMIDE-80”柱(东曹株式会社制)，在柱温35℃、作为洗脱液使用乙腈∶水(71∶29)、流速1.0ml/min的条件下进行，使用差示折射计“RI-8012”(东曹株式会社制)进行检测。糖组成的分析的结果示于表1中。再者，作为对比实验，用藤田孝辉等，Agric Biol.Chem.，54卷，913-919页(1990)中记载的方法，精制来自节杆菌属种K-1的β-呋喃果糖苷酶，以每1g蔗糖加入10单位精制的β-呋喃果糖苷酶，除了将反应液控制成pH5.5至6.5以外，进行完全相同的操作。得到的结果示于表1中。
表1

表中的Gly、DPl、Suc、Lac、Kes、LS、F-LS和UN分别意味着甘油、葡萄糖和果糖合称的单糖、蔗糖、乳糖、1-蔗果三糖、乳蔗糖、果糖基乳蔗糖及其他的未知糖类。
如表1所示，已清楚，本发明中使用的芽孢杆菌属种V230的β-呋喃果糖苷酶，作为糖组成，生成71.0％(反应时间24小时)至73.6％(反应时间42小时)的乳蔗糖，大于或等于70％，而且副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计仅生成0.1％(反应时间24小时)至0.3％(反应时间42小时)，不到1％。另一方面，是对比的节杆菌属种K-1的β-呋喃果糖苷酶，作为糖组成仅生成63.3％(反应时间24小时)至63.0％(反应时间42小时)的乳蔗糖，不到65％，并且已清楚，副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计生成5.9％(反应时间24小时)至12.4％(反应时间42小时)，显著生成。
实施例2乳蔗糖高含量糖粉末的制造将含有24质量％蔗糖和16质量％乳糖的水溶液调整成pH6.0，以每1g蔗糖1单位以及以每原料固态物湿质量为7.5％的比例分别向其中加入实施例1-1中制备成的β-呋喃果糖苷酶粗酶液和实施例1-2中制备成的蔗糖非利用性酵母，一边用1N的氢氧化钠溶液将该反应液调整成pH4.0至5.5，一边在30℃反应45小时。反应后，用HPLC测定反应液的糖组成，含有2.0％甘油、合计2.1％葡萄糖和果糖、5.4％蔗糖、14.7％乳糖、1.4％1-蔗果三糖、73.0％乳蔗糖、0.1％果糖基乳蔗糖和1.3％其他的未知糖类。得到的反应液在90℃加热30分钟，使酶失活后，按照常规方法用活性炭过滤。将得到的滤液调整到60℃后，每固态物质量加入消石灰1.5％，调整成pH11，保持15分钟后，吹入二氧化碳，成为pH8，进行碳酸饱和。按照常规方法将其过滤，用离子交换树脂脱盐，浓缩后，进行喷雾干燥，制成作为糖组成含有1.9％甘油、合计2.2％葡萄糖和果糖、5.5％蔗糖、10.8％乳糖、3.3％乳果糖、1.3％1-蔗果三糖、73.5％乳蔗糖、0.1％果糖基乳蔗糖和1.4％其他的未知糖类的乳蔗糖高含量糖粉末。
本品作为甜味剂、难消化性甜味剂、低致龋性甜味剂、保湿剂、淀粉老化防止剂、整肠剂等，能够有利地用于包括健康食品、饮料的饮食品领域，化妆品领域，医药领域、饲料领域等各种领域。
实施例3乳蔗糖高含量糖浆的制造将含有18质量％蔗糖和22质量％乳糖的水溶液调整成pH6.0，以每1g蔗糖1单位以及以每固态物湿质量为5.0％的比例分别向其中加入实施例1-1中制备成的β-呋喃果糖苷酶粗酶液和实施例1-2中制备成的蔗糖非利用性酵母，一边用1N的氢氧化钠溶液将该反应液调整成pH4.0至5.5，一边在32℃反应42小时。反应后，用HPLC测定反应液的糖组成，含有1.9％甘油、合计0.1％葡萄糖和果糖、1.2％蔗糖、22.6％乳糖、0.3％1-蔗果三糖、72.4％乳蔗糖、0.1％果糖基乳蔗糖和1.4％其他的未知糖类。按照常规方法，用SF膜过滤得到的反应液而去除酵母，再按照常规方法，用UF膜过滤，去除β-呋喃果糖苷酶等高分子成分，接着用活性炭过滤后，进行减压干燥，得到固体物约80质量％的浓缩液。将该浓缩液调整成温度约25℃后，加入所加入的乳糖的约3质量％的结晶乳糖粉末，使乳糖部分结晶。按照常规方法通过过滤去除结晶出的乳糖后，用离子交换树脂脱盐，进行浓缩，制成作为糖组成含有2.2％甘油、合计0.1％葡萄糖和果糖、1.4％蔗糖、10.1％乳糖、0.4％1-蔗果三糖、84.1％乳蔗糖、0.1％果糖基乳蔗糖和1.6％其他的未知糖类的乳蔗糖高含量糖浆。
本品作为甜味剂、难消化性甜味剂、低致龋性甜味剂、保湿剂、淀粉老化防止剂、整肠剂等，能够有利地用于包括健康食品、饮料的饮食品领域，化妆品领域，医药领域、饲料领域等各种领域。
实施例4高纯度乳蔗糖粉末的制造将含有20质量％蔗糖和20质量％乳糖的水溶液调整成pH6.0，以每1g蔗糖1单位以及以每固态物湿质量为5.0％的比例分别向其中加入实施例1-1中制备成的β-呋喃果糖苷酶粗酶液和实施例1-2中制备成的蔗糖非利用性酵母，一边用1N的氢氧化钠溶液将该反应液调整成pH4.0至5.5，一边在30℃反应30小时。反应后，用HPLC测定反应液的糖组成，含有2.0％甘油、合计0.2％葡萄糖和果糖、1.6％蔗糖、19.2％乳糖、0.6％1-蔗果三糖、74.7％乳蔗糖、0.1％果糖基乳蔗糖和1.7％其他的未知糖类。按照常规方法，用SF膜过滤得到的反应液而去除酵母，再按照常规方法，用UF膜过滤，去除β-呋喃果糖苷酶等高分子成分，接着用活性炭过滤后，进行减压干燥，得到固体物约60质量％的浓缩液。以该乳蔗糖高含量糖浆作为原糖浆，为了提高乳蔗糖的纯度，使用强酸性阳离子交换树脂(商品名“アンバ-ライトCR-1310”(Na+型)，オルガノ株式会社制)，实施柱层析。即，在10个内径12.5cm的带夹套不锈钢制柱中填充上述树脂，将这些柱串联连接，使树脂层全长达到16m。一边使柱内温维持在40℃，一边相对树脂量加入1.5％(v/v)上述糖浆，以SV(空速)0.2使40℃的温水在其中流过进行，在用HPLC法监测洗脱液的糖组成的同时分离乳蔗糖高含量级分，按照常规方法过滤该级分，使用离子交换树脂、活性炭进行脱盐、脱色精制，浓缩后，进行喷雾干燥，制成作为糖组成含有0.1％蔗糖、2.3％乳糖、1.1％1-蔗果三糖、96.0％乳蔗糖、0.2％果糖基乳蔗糖和0.3％其他的未知糖类的高纯度乳蔗糖粉末。
本品作为甜味剂、难消化性甜味剂、低致龋性甜味剂、保湿剂、淀粉老化防止剂、整肠剂等，能够有利地用于包括健康食品、饮料的饮食品领域，化妆品领域，医药领域、饲料领域等各种领域。
实施例5高纯度乳蔗糖造粒品的制造对100质量份实施例4得到的高纯度乳蔗糖粉末，以最终浓度成为约3％(重量/体积比)预先使茁霉多糖(商品名“Pullulan PF-20”，株式会社林原商事销售)溶解在去离子水中而得到的茁霉多糖水溶液约6质量份按照常规方法进行喷雾而实行造粒。得到的造粒品用筛孔孔径1.7mm的筛分级，得到高纯度乳蔗糖造粒品。测定该造粒品的粒度分布，与原料高纯度乳蔗糖粉末的粒度分布进行比较时，与原料高纯度乳蔗糖粉末中粒径小于或等于106μm的粒子占大于或等于85％相反，高纯度乳蔗糖造粒品中粒径大于或等于150μm的粒子占大于或等于70％。
本品因为是造粒品，所以流动性良好、处理容易，并且，具有在溶解时不易发生仍就是粉的特征。本品作为甜味剂、难消化性甜味剂、低致龋性甜味剂、保湿剂、淀粉老化防止剂、整肠剂等，能够有利地用于包括健康食品、饮料的饮食品领域，化妆品领域，医药领域、饲料领域等各种领域。
实施例6结晶乳蔗糖按照常规方法过滤用实施例4的方法得到的乳蔗糖高含量级分，用离子交换树脂、活性炭脱盐、脱色，进行精制，减压浓缩至水分约25质量％，利用助结晶罐，边加入1质量％种晶边慢慢地搅拌，用24小时缓冷至约30℃。将其放在离心分离机上，以收率约40％得到含5水结晶乳蔗糖。本品是纯度大于或等于约98％的结晶乳蔗糖，即使在夏季的高温高湿环境下，也实质上不显示吸湿性，是容易处理的，作为甜味剂、难消化性甜味剂、整肠剂等，能够有利地用于在饮食品、化妆品、医药等各种领域，尤其能够有利地用于含有结晶乳蔗糖的固态组合物的用途。
实施例7甜味剂在1质量份用实施例6的方法得到的结晶乳蔗糖中，均匀地混合0.05质量份α-葡糖基甜菊苷(东洋精糖株式会社销售，商品名“αG-Sweet”)，用颗粒成形机获得颗粒状甜味剂。本品甜味的品质优良，具有大约2倍的砂糖的甜味，甜度相当时的热量，低至砂糖的大约1/2。本甜味剂，作为低热量甜味剂，对为了限制热量摄取的肥胖者、糖尿病人等的低热量饮食品获得甜味是合适的。另外，本甜味剂由于由龋齿诱发菌引起的酸的生成少，不溶性葡聚糖的生成少，对抑制龋齿的饮食品等获得甜味是合适的的。本甜味剂作为调整肠内的菌丛的整肠剂也是合适的。
实施例8成形甜味剂均匀地混合用实施例6的方法得到的1质量份结晶乳蔗糖和2质量份砂糖，向其中喷雾适量的水，按照常规方法成形而得到成形甜味剂。本品作为具有调整肠内的菌丛的整肠机能的成形甜味剂，在使咖啡、红茶等的获得甜味中能够有效地利用。
实施例9巧克力混合40质量份可可仁、10质量份可可脂、20质量份砂糖、用实施例6的方法得到的30质量份结晶乳蔗糖，在精磨机(レフアイナ-)中通过，使粒度降低后，放入コンチエ中，在50℃进行了2昼夜精炼。其间，加入0.5质量份卵磷脂使其充分地混合分散。接着，用温度调节机调节至31℃，在可可脂即将凝固之前注入模中，用振动机进行脱气，从10℃的冷却风道下穿过20分钟使其固化。将其脱模，进行包装而得到制品。本品没有吸湿性，颜色、光泽都好，内部组织也良好，在口中顺利地溶化，具有上品甜味和满意的风味。另外，本品作为具有整肠作用的巧克力也是合适的。
实施例10口香糖将3质量份胶姆基加热熔融成柔软的程度，向其中加入4质量份无水结晶麦芽糖醇(株式会社林原商事销售，注册商标“マビツト”)和用实施例6的方法得到的3质量份结晶乳蔗糖，再混合适量的香料和着色料，按照常规方法用辊搅和，进行成形、包装而得到制品。本品是结构、风味都良好的口香糖。另外，本品作为具有整肠作用的口香糖也是合适的。
实施例11饮料在水中加入100质量份酸乳、用实施例4的方法得到的50质量份高纯度乳蔗糖粉末、10质量份海藻糖、0.25质量份酸乳调料和0.1质量份柠檬香精，使全体配合成1000质量份，按照常规方法，制成酸乳饮料。本品风味丰富，而且具有调整肠内的菌丛的整肠机能。
实施例12经肠营养剂制备成由用实施例6的方法得到的10质量份结晶乳蔗糖、10质量份海藻糖、1.1质量份甘氨酸、1质量份谷氨酸钠、0.4质量份乳酸钙、0.1质量份碳酸镁、0.01质量份硫胺素和0.01质量份核黄素构成的配合物。每24g该配合物填充在层压铝制小包中，进行热封而得到制品。本品，在约33至500ml的水中溶解1袋量，作为营养补给液，通过经管方法，经鼻腔、肠胃等给药而使用。本品不仅对人，而且也能够作为对家畜等的非经口营养补给液有利地利用。另外，本品具有调整肠内菌丛的整肠作用。
实施例13糖衣片以质量150mg的素片作为芯剂，在芯剂上使用由以实施例6的方法得到的45质量份结晶乳蔗糖、2质量份茁霉多糖(平均分子量20万)、30质量份水、25质量份滑石粉和3质量份氧化钛构成的底层液，包糖衣使片剂质量为大约230mg，接着，使用由65质量份的相同结晶乳蔗糖、1质量份茁霉多糖和34质量份水构成的上层液形成糖衣，再用蜡液进行抛光，得到有光泽外观的优良的糖衣片。本品不仅包糖衣时的操作性良好，而且耐冲击性也优良，长时间维持高品质。另外，本品具有调整肠内的菌丛的整肠机能。
工业实用性如以上所述，按照本发明的乳蔗糖高含量糖的制造方法，即使不使用柱层析等精制手段，仅用同时使用β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母的反应，就能够从蔗糖和乳糖制造作为糖组成含有大于或等于70％的乳蔗糖的乳蔗糖高含量糖。另外，用本发明的制造方法得到的乳蔗糖高含量糖，副产物1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖的含量作为糖组成合计低至不到3％，因而以如果其作为原料用层析进行精制，就能够容易地以高收率制备更高纯度的乳蔗糖。
再有，按照本发明得到的乳蔗糖高含量糖患者高纯度乳蔗糖，作为糖组成含有大于或等于70％或者大于或等于90％的对发挥机能有效的乳蔗糖，因而和以往的乳蔗糖含量低的含乳蔗糖糖类相比，以比较少的量就能够发挥乳蔗糖本来具有的难消化性、双岐菌繁殖促进性、难致龋性、保湿性等优良的机能。由于此，将用本发明得到的乳蔗糖高含量糖或者高纯度乳蔗糖配合制造饮食品、化妆品、医药、饲料等各种组合物时，在和其他的原料配合上，能够选择更宽范围的配合组成。
再有，从含有乳蔗糖高含量糖或者高纯度乳蔗糖的乳蔗糖过饱和水溶液析晶，然后提取而制造的含5水结晶乳蔗糖，实质上是非吸湿性的，流动性良好，不容易粘着、固着，容易处理，因此能够有利地用于各种固态组合物。
本发明是达到这样的显著作用效果的发明，是在本领域有非常大的贡献意义的发明。
权利要求
1.乳蔗糖高含量糖，作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％。
2.根据权利要求1所述的乳蔗糖高含量糖，作为其他的糖类还含有选自甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和乳果糖的1种或者2种以上。
3.权利要求1或2所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其特征在于，在含有蔗糖和乳糖的水溶液中使来自属于芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母发生作用，形成作为糖组成含有大于或等于70％乳蔗糖、1-蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％的反应物，根据需要，再使混合存在的乳糖异构化，形成乳糖和乳果糖的混合物后，将其提取。
4.根据权利要求3所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其中，来自属于芽孢杆菌属的微生物的β-呋喃果糖苷酶是重组酶。
5.根据权利要求3或4所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其中，属于芽孢杆菌属的微生物是芽孢杆菌属种V230(FERM BP-5054)。
6.根据权利要求3～5中的任一项所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其中，蔗糖非利用性酵母是酿酒酵母ATCC56741或酿酒酵母ATCC56742。
7.根据权利要求3～6中的任一项所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其中，作为乳蔗糖生成反应中的反应原料的蔗糖和乳糖的比率是1∶0.65至1.3。
8.根据权利要求3～7中的任一权利要求所述的乳蔗糖高含量糖的制造方法，其中，将乳蔗糖生成反应中的反应液pH调整成4.0至5.5。
9.高纯度乳蔗糖的制造方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的乳蔗糖高含量糖通过使用树脂的层析，获取作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的级分。
10.高纯度乳蔗糖粉末的制造方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的乳蔗糖高含量糖通过使用树脂的层析，获取作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的级分，将该级分浓缩，进行喷雾干燥。
11.根据权利要求9或10所述的高纯度乳蔗糖粉末的制造方法，其中，还包括造粒过程。
12.结晶乳蔗糖的制造方法，其特征在于，使用由权利要求1或2所述的乳蔗糖高含量糖或者权利要求9所述的高纯度乳蔗糖的制造方法得到的高纯度乳蔗糖，使结晶乳蔗糖从乳蔗糖的过饱和溶液中结晶，然后提取该结晶。
13.根据权利要求12所述的结晶乳蔗糖的制造方法，其中，结晶乳蔗糖是含5水结晶乳蔗糖。
14.固态组合物，含有由权利要求12或13所述的结晶乳蔗糖的制造方法得到的结晶乳蔗糖。
15.根据权利要求14所述的固态组合物，其特征在于，含有结晶乳蔗糖的同时，含有相对于结晶乳蔗糖的质量以0.01至100倍量的范围的其他的结晶糖。
16.根据权利要求14或15所述的固态组合物，该固态组合物为饮食物、化妆品或者医药的任一种形态。
全文摘要
本发明提供在含有蔗糖和乳糖的水溶液中通过使来自属于芽孢杆菌属的微生物的β－呋喃果糖苷酶和蔗糖非利用性酵母发生作用，来制造作为糖组成含有大于或等于 70％乳蔗糖、1－蔗果三糖和果糖基乳蔗糖合计不到3％的乳蔗糖高含量糖的方法，并提供通过将该乳蔗糖高含量糖通过层析来制造作为糖组成含有大于或等于90％乳蔗糖的高纯度乳蔗糖的方法，制造结晶乳蔗糖的方法，还提供由该制造方法得到的乳蔗糖高含量糖和高纯度乳蔗糖。
文档编号A23G1/00GK1946853SQ20058001275
公开日2007年4月11日 申请日期2005年4月20日 优先权日2004年4月22日
发明者冈部浩幸, 阿贺创, 久保田伦夫, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所