用启动子模板扩增核苷序列的方法

专利名称：用启动子模板扩增核苷序列的方法
技术领域：
本发明涉及核酸扩增领域。
背景技术：
微阵列技术已经成为一种产生和分析基因表达概况的有力工具。然而，微阵列表达分析通常需要一般无法获得的大量RNA(见Wang等，BioTechniques 34394-400(2003))。已经开发了几种RNA扩增技术来克服这些问题。然而，这些技术通常会出现称为扩增偏倚(bias)的现象(参见，例如，美国专利6582906)。在这些情况下，扩增的RNA分子群体不能相应表示原始样品中存在的RNA分子群体。
例如，在Eberwine及其同事公开的方法中(参见，例如，美国专利5545522；5716785；5891636；5958688和6291170)，复合寡核苷酸(compound oligonucleotide)被用于扩增，其中的寡核苷酸与T7启动子和引物一起提供。用复合寡核苷酸从最初的mRNA转录物产生cDNA拷贝，随后合成第二链以产生双链cDNA。由复合寡核苷酸的启动子部分引导RNA扩增，并从cDNA的第二链转录。由于第二链被用于转录，因此Eberwine法产生的扩增的RNA与最初的mRNA序列反义。
然而，由于所用酶的持续加工能力不完全(即酶不能维持与核酸分子的结合)和RNA聚合酶启动子的定位，Eberwine法在其每个步骤中都引入了3’偏倚(参见，例如，美国专利6582906和美国专利公开US2003/0104432)。例如，用于产生第一链cDNA的复合寡核苷酸将启动子放置在与信使的3’末端相对应的cDNA的5’末端。这与RNA聚合酶无法完整转录一些模板(可能由于长的聚腺苷酸尾区域或模板中二级和三级结构的干扰)相结合可能在扩增的反义RNA群体中造成3’偏倚。此外，如果DNA聚合酶不能完成第二链cDNA的合成，这些cDNA将缺乏功能性启动子，导致扩增群体中代表原始RNA分子的减少(或者可能完全缺乏)。
发明概述申请人发明了从各种核酸模板产生有义RNA(sRNA)分子的方法，其中的单链RNA聚合酶启动子不能用体外转录sRNA分子的DNA聚合酶延伸。申请人发现，采用不能延伸的启动子模板比采用可作为DNA聚合酶介导的第二链cDNA合成起点的启动子引物更加有效。
本发明的一个方面涉及产生sRNA分子的方法，该方法包括提供具有5’和3’末端的单链cDNA分子；在所述单链cDNA分子的3’末端加上寡脱氧核苷酸尾；使单链RNA聚合酶启动子模板与所述寡脱氧核苷酸尾退火，其中所述单链RNA聚合酶启动子模板不能用DNA聚合酶延伸；延伸所述寡脱氧核苷酸尾，从而所述单链RNA聚合酶启动子模板被转变成双链RNA聚合酶启动子；和用识别所述双链RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶启动RNA转录，从而产生sRNA分子。
本发明的另一方面涉及产生sRNA分子的方法，所述方法包括提供具有5’和3’末端的RNA(例如mRNA)转录物；从所述RNA(例如mRNA)转录物合成具有5’和3’末端的单链cDNA分子；在所述单链cDNA分子的3’末端加上寡脱氧核苷酸尾；使单链RNA聚合酶启动子模板与所述寡脱氧核苷酸尾退火，其中所述单链RNA聚合酶启动子模板不能用DNA聚合酶延伸；延伸所述寡脱氧核苷酸尾，从而所述单链RNA聚合酶启动子模板被转变成双链RNA聚合酶启动子；和用识别所述双链RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶启动RNA转录，从而产生sRNA分子。
申请人还发明了从各种核酸模板产生有义RNA分子的试剂盒，其中，不能用DNA聚合酶延伸的单链RNA聚合酶启动子模板被用于sRNA分子的体外转录。
因此，本发明的再一方面涉及产生至少一种sRNA分子的试剂盒，该试剂盒中装有不能用DNA聚合酶延伸的单链RNA聚合酶启动子模板，和用所述模板产生sRNA分子的指导材料。一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种将寡脱氧核苷酸尾加到具有5’和3’末端的单链cDNA分子3’末端的第一种酶，和至少一种将所述RNA聚合酶启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子的第二种酶。
附图简述

图1a-f都是描述本发明方法实施方案的流程图。
图2描述了在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖变性凝胶上观察到的用本发明方法产生的各种量的sRNA。
实施本发明的最佳方式本发明涉及产生sRNA分子的方法和试剂盒。术语“sRNA分子”、“RNA分子”、“mRNA分子”和“cDNA分子”分别指单个分子、单一种类的多个分子和不同种类的多个分子。所述方法包括在至少一种单链cDNA分子的3’末端加上寡脱氧核苷酸尾；使单链RNA聚合酶启动子模板与所述寡脱氧核苷酸尾退火，其中所述单链RNA聚合酶启动子模板不能用DNA聚合酶延伸；和延伸所述寡脱氧核苷酸尾，从而所述单链RNA聚合酶启动子模板被转变成双链RNA聚合酶启动子。所得含有启动子的单链cDNA然后用于体外转录反应用RNA聚合酶产生一种或多种sRNA分子。这种sRNA分子代表了获得单链cDNA的原始RNA(例如mRNA)转录物的扩增拷贝。
本发明的方法不同于常规的在第一链cDNA分子的5’末端掺入启动子序列的技术。在那些技术中，就原始mRNA转录物而言，RNA转录的方向与第一链cDNA合成的方向相同，从而制得在接近原始mRNA转录物3’聚腺苷酸尾的核苷酸含有偏倚的反义RNA分子。通过将启动子序列掺入cDNA分子的3’末端，本发明的方法能够拷贝和扩增原始RNA(列如mRNA)转录物两端的遗传信息。与通过现有技术方法获得的sRNA分子相比，所得sRNA分子更能代表各原始RNA(例如mRNA)转录物的完整长度并能更好地反应mRNA转录物混合物中各RNA(例如mRNA)转录物的相对丰度。本发明的方法也可与随机引导(priming)组合，而不会引入任何额外的引导偏倚。所述sRNA分子可含有聚腺苷酸尾以更加有效地用于下游测定。此外，由于掺入了在其3’末端被封闭的RNA聚合酶启动子模板，这样可以防止DNA聚合酶介导的模板转变成双链RNA聚合酶启动子期间会带来问题的第二链cDNA合成，因此本发明的方法比常规技术更加有效(参见，例如，WO 02/065093)。
本发明的方法利用了分子生物学领域的常规技术。揭示常规分子生物学方法的基础课本包括Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)(第三版，2001)和Ausubel等的《分子生物学最新进展》(Current Protocols inMolecular Biology)(1994)。
许多合成第一链cDNA分子的方法和商业试剂盒是本领域熟知的。其例子包括SuperscriptTM双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Array 50TM、Array 350TM和Array 900TM检测试剂盒(Genisphere，Hatfield，PA)以及CyScribeTM标记后试剂盒(Amersham，Piscataway，NJ)。通常，来自感兴趣来源的高质量mRNA分子(即原始mRNA转录物)被用作反转录反应的模板。RNA可获自任何组织或细胞来源，包括在任何生物或环境样品中发现的病毒体、原核和真核来源。优选的来源是真核组织，更优选哺乳动物组织，最优选人类组织。在其它实施方案中，模板RNA的形式可以是微小RNA(“miRNA”)。微小RNA是非常大的一组在生物中天然产生的小RNA，至少其中的一些调节靶基因的表达。MiRNA可用标准技术如微小RNA分离试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)；QuickPrep微小RNA纯化试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech Inc.，Piscataway，NJ)从RNA制备。
任何反转录酶都可用于反转录反应，包括热稳定酶和RNA酶H-反转录酶。优选使用RNA酶H-反转录酶。
第一链cDNA合成的引物可通过商业获得或者用本领域熟知的技术合成和纯化。第一链cDNA合成的引物包括在其3’末端含有寡脱氧胸苷尾的单链寡脱氧核苷酸。这种尾的长度通常约为10-30个核苷酸，优选长度约17-24个核苷酸，并与任何含有3’聚腺苷酸尾的原始RNA(例如mRNA)转录物退火(见图1a)。或者可用随机引物启动反转录反应。该引物的长度通常约4-20个核苷酸，优选长度约6-9个核苷酸，并沿各原始RNA(例如mRNA)转录物的长度与各个位置退火。本领域的一般技术人员将知道，相比用寡脱氧胸苷引物产生的sRNA分子，使用随机引物可最终导致产生较好代表各原始RNA(例如mRNA)转录物完整长度的sRNA分子。此外，在所公开方法的最初步骤中使用随机引物来产生cDNA意味着可用通常无法扩增的RNA，如降解的RNA或衍生自细菌的RNA来产生扩增的sRNA分子。所述随机引物可被修饰以使其5’末端含有长度约10-30个核苷酸，优选长度约17-24个核苷酸的寡脱氧胸苷区域，从而在随后的体外转录中制得的扩增的sRNA分子将含有聚腺苷酸尾。
第一链cDNA合成之后，RNA通常被降解，然后再纯化第一链cDNA分子(见图1b)。可采用任何降解RNA的方法，如用NaOH处理。或者，可使RNA保持原样，从RNA/cDNA双链体纯化第一链cDNA分子。存在许多纯化DNA分子的方法和试剂盒。其例子包括MinEluteTMPCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)、SpinPrepTMPCR提纯试剂盒(Novagen，Madison，WI)以及其它基于类似DNA分离原理的纯化系统。
第一链cDNA纯化之后在cDNA分子的3’末端加上单链寡脱氧核苷酸尾(见图1c)。可用任何在单链DNA上加上脱氧核苷酸的方法掺入寡脱氧核苷酸尾。优选在存在合适的脱氧核苷酸时用末端脱氧核苷酸转移酶或其它合适的酶在单链cDNA上加上寡脱氧核苷酸尾。优选的，所述寡脱氧核苷酸尾是同聚物尾(即聚脱氧腺苷、聚脱氧鸟苷、聚脱氧胞苷或聚脱氧胸苷)。优选的，所述寡脱氧核苷酸尾是聚脱氧胸苷尾，其长度通常约为3到500个以上核苷酸，优选长度约20-100个核苷酸。
在单链cDNA分子的3’末端加上单链寡核苷酸尾之后，单链RNA聚合酶启动子模板被加到3’寡脱氧核苷酸尾上(见图1d)。这是通过3’寡脱氧核苷酸尾和存在于单链RNA聚合酶启动子模板3’末端的互补脱氧核苷酸序列之间的互补碱基配对实现的。例如，如果寡核苷酸尾是聚脱氧胸苷尾，则启动子模板将在其3’末端含有腺苷碱基序列，其长度通常约为3到50个以上核苷酸，优选长度约10-30个核苷酸。对于被认为是相互互补的序列，3’启动子模板序列的特定核苷酸序列不一定要与3’寡脱氧核苷酸尾的特定核苷酸序列互补，3’启动子模板序列的长度也不需要与3’寡脱氧核苷酸尾的长度相同。精通本领域的技术人员将认识到，所要求的只是两个序列之间要有充足的互补性，从而RNA聚合酶启动子模板将与cDNA分子3’末端的的寡脱氧核苷酸尾退火。
单链RNA聚合酶启动子模板在其5’末端还含有被RNA聚合酶特异性识别的启动子序列。可采用任何RNA聚合酶，只要特定的启动子序列已知被聚合酶识别即可。优选地，采用的启动子序列被噬菌体RNA聚合酶，如T7、T3或SP6 RNA聚合酶识别。T7聚合酶启动子有义序列的例子是TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO1)。T3聚合酶启动子有义序列的例子是AATTAACCCTCACTAAAGG(SEQ ID NO2)。SP6聚合酶启动子有义序列的例子是AATTTAAGGTGACACTATAGAA(SEQ ID NO3)。
单链RNA聚合酶启动子模板还在其3’末端被封闭从而不能用DNA聚合酶延伸。这样，加入DNA聚合酶(如Klenow DNA聚合酶)能将单链启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子，但不能催化第二链cDNA的合成(见图1e)。申请人发现，相比使用能作为DNA聚合酶介导的第二链cDNA合成起点的启动子引物，使用不能用DNA聚合酶延伸的启动子模板能更精确地维持未扩增的RNA样品中发现的mRNA转录物的相对丰度。可用任何方法封闭启动子模板，只要这种方法能使启动子模板不能用DNA聚合酶延伸即可，例如在合成期间或之后加上末端封闭基团、化合物或分子。优选地，启动子模板可用3’氨基修饰剂(modifier)、3’脱氧终止子、3’双脱氧终止子或类似分子封闭。合适的封闭剂不限于这里所述的那些，并且可包括任何能防止DNA聚合酶延伸RNA聚合酶启动子模板3’末端的分子。
尽管本发明的方法宜在不存在第二链cDNA合成时进行，但本领域的熟练技术人员将了解，可在采用随机引物将单链启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子期间任选合成第二链cDNA。随机引物将沿着第一链cDNA的各个位置退火，且与启动子模板不同，随机引物可在启动子合成期间通过DNA聚合酶延伸。各种第二链cDNA片段可任选结合在一起以形成一个第二链cDNA分子。这种第二链cDNA分子在体外转录期间可稳定(例如，除去二级和三级结构)第一链cDNA，从而导致较高的sRNA分子产量。
单链启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子之后可加入合适的RNA聚合酶和核糖核苷酸启动体外转录(见图1f)。这种转录可导致产生大量扩增的sRNA。进行体外转录的方法和试剂盒是本领域熟知的，其中包括MEGAscriptTM转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)和AmpliScribeTM高产率转录试剂盒(Epicentre Technologies，Madison，WI)。
可用上述同样的方法对所得sRNA分子再进行几轮扩增。例如，从寡脱氧胸苷介导的第一链cDNA产生的sRNA分子(即，第一轮sRNA分子)将在其3’末端具有再生的聚腺苷酸尾，这种尾可作为第二轮寡脱氧胸苷介导的第一链cDNA合成的引导位点。或者，可用随机引物反转录第一轮sRNA分子的第一链cDNA。寡脱氧胸苷和随机引物的组合和混合物也可用于第二轮cDNA合成。然后如上所述将启动子模板加入第二轮cDNA分子，然后在合适RNA聚合酶的作用下进行第二轮体外转录。进行额外轮数的扩增使得在第一轮扩增中可使用较小量的mRNA。
可用市售的聚腺苷酸加尾试剂盒将聚腺苷酸尾加到缺少聚腺苷酸尾的扩增的sRNA分子(如从常规的随机引物介导的第一链cDNA产生的那些)的3’末端。这种试剂盒的一个例子是Poly(A)试剂盒(Ambion)。或者，在合适的缓冲液中将聚腺苷酸聚合酶(购自Amersham、Invitrogen和Ambion)与ATP以及扩增的sRNA分子混合可用来在sRNA分子的3’末端合成聚腺苷酸尾。加入聚腺苷酸尾增加了下游试验可用的扩增sRNA分子的数目和类型，并允许在那些试验中使用更加便宜的RNA标记替代物。
用本发明方法产生的sRNA分子可直接用于任何对于mRNA来说是典型用途的用途，其中包括基因表达研究、遗传克隆和减除杂交。例如，可用随机引物、寡脱氧胸苷引物或其组合首先将sRNA分子反转录成cDNA分子。反转录反应可在存在可检测标记的核苷酸如荧光标记的核苷酸时进行。这种核苷酸包括用Cy3和Cy5标记的核苷酸。或者，cDNA分子可在合成后标记。优选地，cDNA分子是在合成后采用3DNATM技术(Genisphere)用核酸树状聚体(dendrimer)标记的。这些树状聚体还描述于Nilsen等，J.Theor.Biol.，l87273-284(1997)；Stears等，Physiol.Genomics 393-99(2000)；和美国专利5175270；5484904；5487973；6072043；6110687和6117631。
从本发明的sRNA分子产生的标记的单链cDNA分子被用作基因表达研究的探针。cDNA分子可与含有互补多核苷酸的核酸微阵列退火。优选地，该微阵列是GeneChip微阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)。由于用本发明方法产生的sRNA分子更能代表各原始RNA(例如mRNA)转录物的完整长度并能更好反映各原始RNA(例如mRNA)转录物的相对丰度，因此基因表达研究获得的结果相比那些用先前的核酸扩增技术得到的结果更有意义(例如更加准确)。
本发明还提供了包含供实施本发明方法的试剂的试剂盒或套装(package)。这种试剂盒可用于各种研究和诊断应用。例如，本发明的方法和试剂盒可用来帮助比较分析不同细胞或组织、相同细胞或组织的不同亚群、相同细胞或组织的不同生理状态、相同细胞或组织的不同不同发育阶段或者相同组织的不同细胞群中一个或多个基因的表达。这种分析可揭示统计学上显著的基因表达水平的差异，这种差异取决于所分析的细胞或组织，并且然后可用于帮助诊断各种疾病状态。
根据本发明可制备多种试剂盒。例如，试剂盒中可含有不能用DNA聚合酶延伸的单链RNA聚合酶启动子模板(例如，含有3’封闭剂或者与3’端连接的封闭部分的模板)以及用这种模板产生sRNA分子的指导材料。尽管所述指导材料通常包括书写或印刷材料，但不限于此。能够储存这种说明并将它们传达给最终用户的任何介质都包括在本发明之内。这种介质包括但不限于电储存介质(例如，磁盘、带、盒式磁盘、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。这种介质可包括能提供这种指导材料的因特网地址。
本发明的试剂盒还可装有一种或多种以下组分或试剂反转录酶；RNA酶抑制剂；将寡脱氧核苷酸尾连接到单链cDNA分子的酶(例如，末端脱氧核苷酸转移酶)；将RNA聚合酶启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子的酶(例如，Klenow酶)；和识别启动子的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)。该试剂盒还装有缓冲液、引物(例如，寡脱氧胸苷引物、随机引物)、核苷酸、标记的核苷酸、无RNA酶的水、容器、小瓶、反应管、以及与本发明方法产生sRNA分子相容的组分。所述组分和试剂可单独提供或与合适的储存介质一起提供在容器内。
下面的实施例将描述本发明方法的特定实施方案。这些实施例只是为了阐述而不能理解为以任何方式进行限制。
实施例实施例1第一链cDNA的合成简言之，将1-10μl用RNAqueous试剂盒(Ambion)纯化的大鼠脑总RNA(至多1μg)与2μl寡dT24引物(50ng/μl)(5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’；SEQ ID NO4)混合，并加入无RNA酶的水至11μl。该RNA/引物混合物在80℃加热10分钟并立即在冰上冷却1-2分钟。混合物然后与9μl主混合物溶液混合，使其终体积为20μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM各种dNTP、10U Superase-InTM(Ambion)和200U SuperscriptTM反转录酶II(Invitrogen)。将混合物短暂离心并在42℃培育2小时。加入3.5μl 0.5M NaOH/50mMEDTA并在65℃加热15分钟以中止反应。短暂离心后用5μl 1M Tris-HCl，pH 7.5中和反应物并用1X TE，pH8.0调至50μl。反应物用MinEluteTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)按照制造商的步骤纯化。第一链cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱。
第一链cDNA的加尾第一链cDNA分子在80℃加热10分钟并立即在冰上冷却1-2分钟。然后将10μlcDNA分子与15μl主混合物溶液混合，使其终体积为25μl，其中含有6.5μl无RNA酶的水、1X加尾缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、1.5mM dTTP和30U末端脱氧核苷酸转移酶(Invitrogen)。将混合物短暂离心并在37℃培育30分钟。在80℃加热15分钟并在室温冷却1-2分钟以中止反应。
T7启动子的合成在寡脱氧胸苷加尾的cDNA分子中加入2μl含3’氨基修饰剂(5’-TAA TAC GACTCA CTA TAG GGA AAA AAA AAA AAA AAA AX-3’；SEQ ID NO5)的T7 RNA聚合酶启动子模板(250ng/μl)，混合物在37℃培育10分钟以使该链退火。然后将27μl加尾的cDNA/启动子模板混合物与23μl主混合物溶液混合，使其终体积为50μl，其中含有14μl无RNA酶的水、1X聚合酶缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、0.4mM各种nNTP和20U大DNA聚合酶I(Klenow酶)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)。将混合物短暂离心并在室温培育30分钟。反应物用1X TE，pH 8.0调至100μl。反应物用MinEluteTMPCR纯化试剂盒按照制造商的步骤纯化。T7启动子-cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱。
体外转录将1μl T7 RNA聚合酶启动子模板加入T7启动子-cDNA分子并用RNA酶-水将体积调至17μl。混合物在37℃加热10-15分钟以重新退火T7启动子DNA链，然后与13μl主混合物溶液混合物使终体积为30μl，其中含有1X反应缓冲液、5mM各种rNTP和2μl T7 RNA聚合酶(MEGAscriptTM转录试剂盒，Ambion)。将混合物短暂离心并在37℃的加热块上培育15分钟，然后在37℃的空气杂交器中培育6-14小时。扩增的sRNA分子用Rneasy试剂盒按照制造商的方法纯化。sRNA分子用50μl无RNA酶的水洗脱，用相同的洗脱液再次洗脱，并用UV-分光光度法在260/280的波长下量化。
实施例2采用实施例1的方法，但用随机引物代替寡dT24引物进行第一链cDNA的合成。简言之，将1-10μl总RNA(至多1μg)与2μl随机9聚体引物(250ng/μl)(5’-NNN NNNNNN-3’；SEQ ID NO6)混合，并加入无RNA酶的水至11μl。该RNA/引物混合物在80℃加热10分钟并立即在冰上冷却1-2分钟。混合物然后与9μ1主混合物溶液混合，使其终体积为20μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、0.5mM各种dNTP、10U Superase-InTM和200U SuperscriptTM反转录酶II。将混合物短暂离心并在42℃培育2小时。加入3.5μl 0.5M NaOH/50mM EDTA并在65℃加热15分钟以中止反应。短暂离心后用5μl 1M Tris-HCl，pH 7.5中和反应物并用1X TE，pH 8.0调至50μl。反应物用MinEluteTMPCR纯化试剂盒按照制造商的步骤纯化。第一链cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱，并按实施例1的描述进一步处理。
实施例3采用实施例1或2的方法，但在第一链cDNA合成之后不对RNA进行处理(即不进行碱水解)，然后将其加到MiniEluteTM纯化柱。第一链cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱，并按实施例1的描述进一步处理。
实施例4采用Poly(A)加尾试剂盒(Ambion)将聚腺苷酸尾加到用实施例2和3的随机引物法产生的扩增的sRNA分子上。用Array350TM检测试剂盒(Genisphere)将聚腺苷酸加尾的sRNA转变成标记的cDNA，并用该检测试剂盒产品手册中公布的标准技术与微阵列杂交。
实施例5目测观察用溴化乙锭染色的1％琼脂糖变性凝胶上通过上述方法产生的各种量的sRNA。从图2中可以看到，相比商品化的基于Eberwine的方法(表示为MessageAmpTM，Ambion，泳道B-D)，本发明的方法(表示为SenseAmp，泳道E-G)产生了较多扩增的RNA分子。用本发明方法获得的产量比原始RNA样品放大了1000倍。通过比较用MessageAmpTM产生的扩增的反义RNA(aRNA)和用本发明方法产生的扩增的sRNA得到的实验数据说明，就维持未扩增的原始RNA样品中发现的mRNA转录物的相对丰度而言，本发明的方法比基于Eberwine的方法更精确。泊松对数相关系数分别为0.93和0.86。未扩增样品和扩增样品之间完全相关反映为泊松对数相关系数为1.00。
实施例6采用实施例1或3的寡脱氧胸苷法，但对纯化的sRNA分子进行第二轮RNA扩增。
简言之，含第一轮扩增的sRNA分子的体外转录反应物用30μl无RNA酶的水从Rneasy柱洗脱，并用相同的洗脱液再次洗脱。洗脱液与1μl寡dT24引物(50ng/μl)(SEQID NO4)和2μl随机9聚体引物(25ng/μl)(SEQ ID NO6)混合并加入无RNA酶的水至37μl。RNA/引物混合物在80℃加热10分钟并立即在冰上冷却1-2分钟。混合物然后与23μl主混合物溶液混合，使其终体积为60μl，其中含有50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)、0.33mM各种dNTP、10USuperase-InTM和200U SuperscriptTM反转录酶II。将混合物短暂离心并在42℃培育2小时。反应物用1X TE，pH 8.0调至100μl。反应物用MinEluteTMPCR纯化试剂盒按照制造商的步骤纯化。第一链cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱。
第一链cDNA分子在80℃加热10分钟并立即在冰上冷却1-2分钟。然后将10μlcDNA分子与15μl主混合物溶液混合，使其终体积为25μl，其中含有6.5μl无RNA酶的水、1X加尾缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2)、1.5mM dTTP和30U末端脱氧核苷酸转移酶。将混合物短暂离心并在37℃培育30分钟。在80℃加热15分钟并在室温冷却1-2分钟以中止反应。
在寡脱氧胸苷加尾的cDNA分子中加入2μl含3’氨基修饰剂(SEQ ID N05)的T7RNA聚合酶启动子模板(250ng/μl)，混合物在37℃培育10分钟以使该链退火。然后将27μl加尾的cDNA/启动子模板混合物与23μl主混合物溶液混合，使其终体积为50μl，其中含有14μl无RNA酶的水、1X聚合酶缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.0，10mMMgCl2)、0.4mM各种nNTP和20U大DNA聚合酶I(Klenow酶)。将混合物短暂离心并在室温培育30分钟。反应物用1X TE，pH 8.0调至100μl。反应物用MinEluteTMPCR纯化试剂盒按照制造商的步骤纯化。T7启动子-cDNA分子用10μl由制造商提供的EB缓冲液洗脱。
将1μl T7 RNA聚合酶启动子模板加入T7启动子-cDNA分子并用RNA酶-水将体积调至16μl。混合物在37℃加热10-15分钟以重新退火T7启动子DNA链，然后与24μl主混合物溶液混合物使终体积为40μl，其中含有1X反应缓冲液、7.5mM各种rNTP和4μl T7 RNA聚合酶(MEGAscriptTM转录试剂盒)。将混合物短暂离心并在37℃的加热块上培育15分钟，然后在37℃的空气杂交器中培育6-14小时。扩增的sRNA分子用Rneasy试剂盒按照制造商的方法纯化。
第二轮sRNA分子用50μl无RNA酶的水洗脱，用同样的洗脱液再次洗脱，用UV-分光光度法在260/280的波长下量化，并目测用溴化乙锭染色的1％的琼脂糖变性凝胶。
实施例7产生sRNA分子的试剂盒含有以下组分寡dT24引物(50ng/μl)；随机9聚体(9mer)引物(250ng/μl)；dNTP混合物(各种10mM)；Superase-InTM(Ambion)；dTTP加尾混合物(10mM)；10X反应缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.0，100mM MgCl2)；末端脱氧核苷酸转移酶(15-30U/μl)；T7 RNA聚合酶启动子模板(50ng/μl)；Klenow酶(1-7.5U/μl)；和无核酸酶的水。
这些组分放在编号的试管中再放在一容器内，该容器中装有用所述试剂盒组分产生扩增的sRNA分子的印刷说明手册。
本说明书中引用的所有出版物，包括专利文献和非专利文献，表示本发明所述技术领域的一般技术人员的水平。所有这些出版社本全文纳入本文作为参考，其程度如同逐一并单独引用各出版物并纳入本文作为参考。
尽管这里已经参照特定实施方案描述了本发明，但应理解为这些实施方案只是为了阐述本发明的原则和应用。因此应理解，可对所例举的实施方案进行诸多修改并设计出其它的方案，而这不会背离如以下权利要求所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种产生有义RNA分子的方法，所述方法包括a)提供具有5’和3’末端的单链cDNA分子；b)在所述单链cDNA分子的3’末端加上寡脱氧核苷酸尾；c)使单链启动子模板与所述寡脱氧核苷酸尾退火，其中所述单链启动子模板不能用DNA聚合酶延伸；d)延伸所述寡脱氧核苷酸尾，从而使得所述单链启动子模板转变成双链启动子；和e)用识别所述双链启动子的RNA聚合酶启动RNA转录，由此产生有义RNA分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，a)包括提供具有5’和3’末端的mRNA转录物；和从所述mRNA转录物合成单链cDNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单链cDNA分子的合成包括使rnRNA分子与RNA酶H-反转录酶反应。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单链cDNA分子的合成还包括使所述mRNA分子与寡脱氧胸苷引物反应。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单链cDNA分子的合成还包括使所述mRNA分子与随机引物反应。
6.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括在加上寡脱氧核苷酸尾之前纯化所述单链cDNA分子。
7.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括在纯化所述单链cDNA分子之前降解所述mRNA转录物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡脱氧核苷酸尾是同聚物尾。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述同聚物尾是聚脱氧胸苷尾。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用末端脱氧核苷酸转移酶将所述寡脱氧核苷酸尾加到所述单链cDNA分子的3’末端。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链启动子模板通过一系列存在于所述模板3’末端的互补脱氧核苷酸与所述寡脱氧核苷酸尾退火。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链启动子模板包扩T7、T3或SP6 RNA聚合酶启动子。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链启动子模板在3’末端被3’氨基修饰剂、3’脱氧终止子或3’双脱氧终止子封闭。
14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括用随机引物合成第二链cDNA，从而在启动RNA转录之前产生随机引导的第二链cDNA片段。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述随机引导的第二链cDNA片段在启动RNA转录之前结合在一起。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，RNA转录是用T7、T3或SP6 RNA聚合酶启动的。
17.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括扩增所得的sRNA分子。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA扩增是用寡脱氧胸苷和随机引物的组合启动的。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA扩增是用寡脱氧胸苷引物启动的，且所得sRNA分子包含聚腺苷酸尾。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述sRNA扩增是用随机引物启动的。
21.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所得sRNA分子上加上聚腺苷酸尾。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，用聚腺苷酸聚合酶加上所述聚腺苷酸尾。
23.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括反转录所得sRNA分子，从而产生单链cDNA分子。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反转录包括在所述单链cDNA分子中掺入可检测标记的核苷酸。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述可检测标记的核苷酸包含荧光染料。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述荧光染料是cy3或cy5。
27.如权利要求23所述的方法，所述方法还包括在所得cDNA分子中加入至少一个可检测标记。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述可检测标记是通过核酸树状聚体加到cDNA分子上的。
29.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA转录物来源于哺乳动物。
30.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA转录物来源于人。
31.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA转录物分离自包含降解RNA的生物来源。
32.如权利要求1所述的方法，其特征在于，a)包括提供具有5’和3’末端的miRNA分子；和从所述miRNA分子合成单链cDNA分子。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，a)还包括在所述miRNA分子上加上聚腺苷酸尾。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，用聚腺苷酸聚合酶加上所述聚腺苷酸尾。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述单链cDNA分子的合成还包括使所述miRNA分子与寡脱氧胸苷引物反应。
36.一种用于产生至少一种sRNA分子的试剂盒，所述试剂盒中包含不能用DNA聚合酶延伸的单链RNA聚合酶启动子模板，和包括用所述模板产生sRNA分子的说明书的指导材料。
37.如权利要求36所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种将寡脱氧核苷酸尾加到具有5’和3’末端的单链cDNA分子3’末端的第一种酶，和至少一种将所述RNA聚合酶启动子模板转变成双链RNA聚合酶启动子的第二种酶，其中所述指导材料还包括用所述模板和所述第一种和第二种酶产生sRNA分子的说明书。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA聚合酶启动子模板包括T7 RNA聚合酶启动子模板，其中所述第一种酶包括末端脱氧核苷酸转移酶，所述第二种酶包括Klenow酶，且其中所述试剂盒还包含以下组分寡dT24引物；随机9聚体引物；dNTP混合物；RNA酶抑制剂；dTTP加尾混合物；10X反应缓冲液；T7 RNA聚合酶；无核酸酶的水；和其中所述产生sRNA分子的指导材料还包括用所述模板、所述第一种和第二种酶和所述组分产生sRNA分子的说明书。
39.一种探测核酸微阵列的方法，所述方法包括使核酸微阵列与权利要求24或27所述的可检测标记的cDNA接触。
全文摘要
提供了产生有义RNA分子的方法和试剂盒。所述有义RNA分子可用于各种研究和诊断用途，如涉及核酸微阵列的基因表达研究。
文档编号C12Q1/68GK1985006SQ200580014395
公开日2007年6月20日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年4月1日
发明者R·C·盖茨, J·斯西沃姆 申请人:杰尼斯菲尔股份有限公司