专利名称：雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺。
背景技术：
雷丸分布于我国浙江、安徽、福建、河南、河北、江苏、广西、云南、贵州、湖南、四川、甘肃、陕西等地，其菌核生长于发黄且开花的老竹根上或老竹兜下面，有时生于棕榈、桐树上或某些朽树上。杀虫消积除热的功效。大量研究表明，雷丸是一具有多重作用的药用真菌。雷丸蛋白酶有多种驱虫作用，对绦虫、蛔虫、阴道毛滴虫、蛲虫、钩虫等多种寄生虫病均有显著疗效；雷丸多糖可调节机体免疫功能，有的还有一定抗癌性；雷丸凝集素具凝血活性。
由于野生资源的匮乏和生长环境的恶化，许多名贵药用真菌濒临灭绝，如何挽救这些宝贵的药用资源、满足药物开发需要显得尤为重要，利用微生物技术分离筛选出活性菌株，采用现代发酵技术进行大规模的药材生产很有必要。加上雷丸生长于竹根下，采集十分困难，故发酵培养雷丸菌药物有广泛的应用前景，其工业化生产不受季节限制，并可缩短生产周期，产品的数量及质量也易于保证和控制。
上个世纪中后期发展起来的现代发酵技术已成功应用于多种药用真菌的大规模生产，其中以液体发酵技术最为成熟。本发明是适合于雷丸菌工业化生产的发酵培养工艺，该发明将液体发酵技术应用到雷丸菌菌丝的大规模生产在国内尚属首例，研究结果表明该方案是可行的。
发明内容
本发明的目的是提供一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺。
工艺的步骤如下1)固体斜面培养将雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养160～240小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养62～96小时，得到雷丸菌液体种子；3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为5～15％，罐温20～30℃、罐压0.4～1.0kg/cm，搅拌速率100～250rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间100～200小时，得到雷丸菌丝。
所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、维生素B1微量和琼脂15～25克。具体制备方法为取新鲜去皮马铃薯100～300克，切成0.5立方厘米左右的立方块，立即用水冲洗，用1000毫升蒸馏水煮沸20min，纱布过滤，取滤液加15～25克琼脂、10～30克葡萄糖或蔗糖、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、维生素B1微量加热溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即为斜面培养基。
种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米浆40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。具体制备方法为取葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米浆40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，调pH至4.0～7.0，灭菌后即为种子培养基。
发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米浆50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，培养基的pH值为4.0～7.0。具体制备方法为取葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米浆50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO4～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌做消泡剂，调pH到4.0～7.0，灭菌后即为发酵培养基。
本发明的有益效果(1)本发明中种子培养基提供了菌丝短期内快速生长所需的营养物质，培养72小时左右即可进行深层发酵；(2)本发明中液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证雷丸菌的生长需要，培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会；
(3)采用本发明中的液体深层通气发酵工艺进行分批发酵，每升发酵液可得到10～15克的干菌丝；(4)本发明是适合于雷丸菌大规模生产的发酵培养工艺，对于该菌以后的工业化生产有很大的指导意义。
具体实施例方式
雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.AS 5.158，属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌属。
所述的生产雷丸菌丝的工艺是从野生雷丸菌核上分离纯化得到的纯菌株，依次经固体斜面培养、摇床种子培养和发酵培养完成。
菌株的18S核糖体DNA(18S rDNA)部分序列(NCBI登录号AY944218)如下TTTTTCCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGAGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTGGGATTGGCTTCGGGGAGCCGGCAACGGCACCCTGTTGCTGAGAACTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA。
本发明的放罐标准是发酵液变得粘稠，镜检发现菌丝开始老化。
下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。
实施例11)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度20℃，培养160小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯100克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 1克、维生素B1微量和琼脂15克。
2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20℃培养，转速150rpm，培养62小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖10克、蔗糖10克、玉米浆40毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、维生素B10.01克，pH4.0。
3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为5％，罐温20℃、罐压0.4kg/cm，搅拌速率100rpm，通气量1∶0.3，发酵时间100小时，得到雷丸菌丝。所述的发酵培养基，以每1000毫升计发酵培养基的主要成份为葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米浆50毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、维生素B10.01克，培养基的pH值为4.0。
实施例21)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度30℃，培养240小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯300克、蔗糖30克、KH2PO45克、MgSO4·7H2O 3克、维生素B1微量和琼脂25克。
2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在30℃培养，转速200rpm，培养96小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 1克、维生素B10.05克，pH7.0。
3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为15％，罐温30℃、罐压1.0kg/cm，搅拌速率250rpm，通气量1∶1.2，发酵时间200小时，得到雷丸菌丝。所述的发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖80克、蔗糖80克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O1克、维生素B10.05克，培养基的pH值为7.0。
蛋白水解液的制备取新鲜原料黄豆粉、虾粉、蚕蛹粉等，于600C烘箱中干燥6个小时，然后放于800C烘箱中干燥17个小时，称取干粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加压水解2个小时，过滤，取滤液即得。
实施例31)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度27℃，培养200小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯200克、葡萄糖20克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 2克、维生素B1微量和琼脂20克。
2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在27℃培养，转速180rpm，培养72小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米浆60毫升、酵母粉20克、KH2PO41.5克、MgSO4·7H2O 0.5克、维生素B10.02克，pH6.5。
3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为14％，罐温27℃、罐压0.8kg/cm，搅拌速率200rpm，通气量1∶1.0，发酵时间150小时，得到雷丸菌丝。所述的发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米浆60毫升、酵母粉20克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O0.7克、维生素B10.02克，培养基的pH值为6.5。
实施例41)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度26℃，培养220小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯250克、蔗糖25克、KH2PO44克、MgSO4·7H2O 2.5克、维生素B1微量和琼脂22克。
2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在26℃培养，转速160rpm，培养80小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖30克、蔗糖30克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 0.5克、维生素B10.03克，pH6.0。
3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为10％，罐温26℃、罐压0.6kg/cm，搅拌速率180rpm，通气量1∶0.8，发酵时间160小时，得到雷丸菌丝。所述的发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O0.8克、维生素B10.03克，培养基的pH值为6.0。
蛋白水解液的制备取新鲜原料黄豆粉、虾粉、蚕蛹粉等，于600C烘箱中干燥6个小时，然后放于800C烘箱中干燥17个小时，称取干粉100克，加入6mol/l的盐酸600毫升，在沸水浴中水解30分钟，过滤后收集滤液。
实施例51)固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上，温度28℃，培养180小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯150克、葡萄糖15克、KH2PO43.6克、MgSO4·7H2O 1.2克、维生素B1微量和琼脂18克。
2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在28℃培养，转速170rpm，培养90小时，得到雷丸菌液体种子；所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米浆100毫升、酵母粉40克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O 0.8克、维生素B10.04克，pH5.5。
3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为12％，罐温28℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率220rpm，通气量1∶0.6，发酵时间120小时，得到雷丸菌丝。所述的发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖50克、蔗糖50克、玉米浆90毫升、酵母粉、KH2PO42.2克、MgSO4·7H2O 0.6克、维生素B10.04克，培养基的pH值为5.5。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。
本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，工艺的步骤如下1)固体斜面培养将雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养160～240小时，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；2)摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养62～96小时，得到雷丸菌液体种子；3)雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中，以体积比计接种量为5～15％，罐温20～30℃、罐压0.4～1.0kg/cm，搅拌速率100～250rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间100～200小时，得到雷丸菌丝。
2.根据权利要求1所述的一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，所述的斜面培养基以每1000毫升计，马铃薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、维生素B1微量和琼脂15～25克。
3.根据权利要求1所述的一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，所述的种子培养基以每1000毫升计，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米浆40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。
4.根据权利要求1所述的一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，所述的发酵培养基以每1000毫升计，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米浆50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、维生素B10.01～0.05克，培养基的pH值为4.0～7.0。
全文摘要
本发明公开了一种雷丸菌液体深层发酵生产雷丸菌丝的工艺，其特征在于，工艺的步骤如下固体斜面培养将雷丸菌接种到配制的斜面培养基上培养，得到高活性的固体斜面雷丸菌种；摇床种子培养将上述高活性的固体斜面雷丸菌种接种于装有液体种子培养基的摇瓶中培养，得到雷丸菌液体种子；雷丸菌液体深层通气发酵培养将上述雷丸菌液体种子接种至装有发酵培养基的发酵罐中发酵，得到雷丸菌丝。本发明的培养基营养成分配比合理，能够保证雷丸菌的生长需要，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，省时、省工，又减少了由于中途加料造成染菌的机会；适合于雷丸菌大规模生产的发酵培养工艺，对于该菌以后的工业化生产有很大的指导意义。
文档编号C12N1/14GK1869196SQ200610051608
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者李永泉, 周立华 申请人:浙江大学