专利名称：一种链球菌重组亚单位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗，具体地说，涉及一种预防猪链球菌病的基因工程重组亚单位疫苗。
背景技术：
猪链球菌是严重危害世界养猪业的一种重要的细菌性传染病，并可引起人类的感染。该病的主要病原为马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis，type 2)。目前，防制该病主要是用抗生素和化学药物，但因存在抗药性和药物残留等不足，研制新型的疫苗是当务之急。
类M蛋白(M-Like Protein)是马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)细胞壁表面一种纤丝状表面蛋白，是该菌重要的毒力因子和保护性抗原(Timoney J F，WalkerJ，Zhou M，et al.Cloning and sequence analysis of a protective M-like gene from streptococcusequi subsp.Zooepidemicus.Infect，Immune，1995，631440-1445)。马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多种生物学功能(Timoney JF，Arliushin SC，Boschwitz JS.Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-like protein Sem and SzPse.Infect Immun，1997，65(9)3600～3605)。其表面有调理素表位，能刺激机体产生抗调理素抗体(Timoney JF，Mukhtar M.Varability in the M proteins of the equine strains of Streptococcus equisubsp zooepidemicus，P.15～20In W.Plowright，P D Rossdale，and J F Wade(ed)，Equine Infectiousdiseases VI，Cambridge 1991，R&W Publications，Newmarket，England)；能抑制补体C3b在菌体表面沉积，从而抑制机体补体系统的活化(Boschwitz JS，Timoney JF.Inhibition of C3deposition of Streptococcus equi by M proteina mechanism for survival in equine blood.InfectImmun，1994，623515～3520)；能结合机体的纤维蛋白原，使其具有抗吞噬细胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF.Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogenfor Streptococcus.zooepidemicus.Microb Pathog，1994，17121～129)。因此，以类M蛋白为靶点，可能研制出防制由马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病的疫苗。
在猪链球菌2型中，存在强毒、弱毒以及无毒三种不同毒力的菌株(Vecht U，Wissclink HJ，Jellema M L，et al.Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suistype 2.Infect.Immun，1991，593156～3162)。强毒株与无毒株的最大差别是前者呈MRP+，而后者MRP-。MRP+的猪链球菌往往可引起严重的临床症状，MRP-的菌株则不致任何症状，可见MRP是该菌重要的毒力因子。MRP是猪链球菌2型菌体表面重要的菌体蛋白，分子量为136000，是该菌重要的保护性抗原，其结构和分布复杂(Smith Hilde E，Vecht Uri，Gielkens Arno L J，et al.Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding the 136-KDSurface Protein(Muramidase-Released Protein)of Streptococcus suis Type 2.Infect Immun，1992，602361～2367)。因此，以MRP为靶点，可能研制出防制由猪链球菌2型引起的猪链球菌病的疫苗。
我国猪链球菌病主要由马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型所引起，目前还没有有效的预防链球菌病的疫苗。亚单位疫苗安全、高效，是目前研究的热点之一。范红结(范红结，陆承平，唐家琪。猪链球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验。微生物学报，2004，44(1)54-57)和苏良科(苏良科，陆承平。马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗对小鼠免疫效果评价。农业生物技术学报，2004，12(2)226-227)等分别研制了类M蛋白和MRP的亚单位疫苗，免疫仔猪后能抵抗强毒菌株的攻击。但单独表达的类M蛋白和MRP的亚单位疫苗因分子量较小，故免疫原性相对较差，对仔猪的免疫保护率还有待提高，并且一次免疫只能预防一种链球菌的感染。通过将含保护性抗原表位的类M基因和MRP基因融合，进行融合表达，制备的亚单位疫苗因分子量大，可提高其免疫原性，从而提高疫苗的免疫保护率，并且免疫一次可以预防两种链球菌引起的感染。因此，将马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌2型MRP抗原表位融合就成为研制预防猪链球菌病基因工程疫苗的一个技术关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防和/或治疗猪链球菌疾病的重组蛋白疫苗，其中包括由马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(Muramidase-Released Protein，MRP)片段融合而成的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明所述融合蛋白的基因。
一方面，本发明提供了一种具有免疫原性的融合蛋白，该融合蛋白是由马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)类M蛋白片段和猪链球菌2型(Streptococcus suis，type 2)MRP片段融合而成。在本发明的一个实例中，其中类M蛋白片段位于该融合蛋白的氨基端，MRP片段位于该融合蛋白的羧基端，该融合蛋白具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
本发明所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌2型MRP片段融合形成的融合蛋白在进入猪体内以后，可刺激猪体内外周免疫器官的B淋巴细胞，使其活化、增生、分化为浆细胞，产生针对马链球菌兽疫亚种类M蛋白和猪链球菌2型MRP的特异性抗体分子，借助于ADCC、补体活化以及粘附抑制等途径清除进入体内的马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型，因而对猪链球菌病有预防作用。
另一方面，本发明提供了一种编码本发明所述融合蛋白的嵌合基因。该嵌合基因是将编码马链球菌兽疫亚种类M蛋白的多核苷酸片段和编码猪链球菌2型MRP片段的多核苷酸片段融合形成的。在本发明的一个实例中，该嵌合基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了编码本发明所述类M蛋白片段的多核苷酸片段。在本发明的一个实例中，该多核苷酸片段具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，克隆自马链球菌兽疫亚种ATCC35246株。
另一方面，本发明还提供了编码本发明所述MRP片段的多核苷酸片段。在本发明的一个实例中，该多核苷酸片段具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，克隆自猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)HA9801株。该菌系姚火春等1998年从江苏爆发猪链球菌病的病猪中分离获得的，具体分离过程及该菌株特征参见文献姚火春等，猪链球菌1998分离株病原特性鉴定，南京农业大学学报，1999，22(2)67～70，该文献在此全文引入作为参考。
本发明中的HA9801菌株已于2005年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.1446。
另一方面，本发明提供了一种猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)菌株，其保藏号为CGMCC NO.1446。
另一方面，本发明还提供了一种重组构建体，其中包括上述编码本发明所述融合蛋白的基因，该基因被可操作地连接于表达调控区域。
另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞已被上述重组构建体转化。
另一方面，本发明还提供了一种制备本发明所述融合蛋白的方法，该方法将上述的宿主细胞置于足以表达该融合蛋白的条件下进行培养。
另一方面，本发明还提供了所述融合蛋白在制备用于预防或治疗猪链球菌疾病药物中的用途，其中所述的猪链球菌病是由马链球菌兽疫亚种、猪链球菌以及D、E群链球菌引发的，其中所述猪链球菌病优选是由马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型引发的。
另一方面，本发明还提供了一种疫苗组合物，其中包括本发明所述的具有免疫原性的融合蛋白，以及药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。本发明提供的免疫保护力试验证明该疫苗组合物能够有效预防和/或治疗猪链球菌疾病。在本发明的一个实施例中，使用的佐剂为氢氧化铝凝胶。
本发明所述的由马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原表位和猪链球菌2型MRP抗原表位片段融合形成的融合蛋白具有下述优点(1)使用方便，在向猪施用含该融合蛋白的疫苗组合物后，能够同时提供针对马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型的免疫保护作用；(2)具有良好的免疫原性，本发明人将单独表达的马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原表位和猪链球菌2型MRP抗原表位分别向猪施用，虽然可刺激机体产生针对类M蛋白和MRP的免疫应答，但免疫保护作用与融合蛋白相比明显较弱。
图1.图示的是表达产物SDS-PAGE电泳结果。
其中，第1泳道为含PET32-a(+)的BL21空白菌体；第2泳道为未经IPTG诱导的重组质粒；第3-6泳道为经IPTG诱导后的重组质粒；第7泳道为分子量大小的Marker。
下列实施例的给出是为了更好地理解和阐述本发明，而决不应理解为对本发明的任何限制。
除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。
实施例实施例1获取马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗原表位的编码基因马链球菌兽疫亚种ATCC35246株，1977年分离自我国四川，由ATCC收藏。挑取兔血琼脂平板上ATCC35246株单菌落接种至含5％犊牛血清(卫岗血清厂产品)的Todd-Hewittbroth(THB)(购自Oxford公司)肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0TE缓冲液中，冻存备用。
提取马链球菌兽疫亚种基因组DNA的方法参照按Michael W Lema等(Michael W L，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J MicrobiolMethods，1994，19167-172)的方法稍加改进，步骤如下分别挑取兔血平板上ATCC35246菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL菌液6000g离心5min，沉淀以TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗涤；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL处理菌体1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/L NaI，pH7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g离心10min；沉淀悬浮于200uL40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100uLTE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃备用。
采用聚合酶链反应(PCR)方法自马链球菌兽疫亚种ATCC35246株染色体DNA中分离类M蛋白基因(SzpM)。采用的引物序列分别是正义引物P15′GTTGGATCCTTTGCTGGAGTTGAAGA 3′(SEQ ID NO5)反义引物P25′GTAGAGCTCGGTGAAGAATGGATTTG 3′(SEQ ID NO6)所述PCR操作程序是在一500ul微量离心管中加入下列试剂模板DNA2μL10xPCR buffer 10μL25mM Mgcl28μL2.5mM dNTPs8μL引物 各0.5μLddH2O 70μLTag酶 3μL混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数94℃变性4℃后，进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
按照产品说明书推荐的方法，将扩增出的类M蛋白基因片段与T载体(购自TaKaRa公司)连接，进行克隆。按常规方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序(J Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
实施例2获取猪链球菌2型MRP抗原表位的编码基因猪链球菌2型HA9801株系姚火春等(南京农业大学学报，1999，22(2)67～70)1998年从江苏爆发猪链球菌病的病猪中分离、鉴定，已于2005年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO.1446。挑取兔血琼脂平板上HA9801株单菌落接种至含5％犊牛血清(购自卫岗血清厂)的Todd-Hewitt broth(THB)肉汤中，37℃静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0TE缓冲液中，冻存备用。
提取马链球菌兽疫亚种基因组DNA的方法参照按Michael W Lema等(Michael W L，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J MicrobiolMethods，1994，19167-172)的方法稍加改进，步骤如下分别挑取兔血平板上HA9801菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37℃静止培养过夜；取0.5mL菌液离心沉淀，TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL处理菌体1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/L NaI，pH7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA，10000g离心10min；沉淀悬浮于200uL40％异丙醇中，离心洗涤；70％乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于100uLTE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃备用。
采用聚合酶链反应(PCR)方法自猪链球菌2型HA9801株染色体DNA中分离mrp基因。采用的引物序列分别是正义引物P35′GTAGAGCTCGAACAGGTAACATCAGA 3′(SEQ ID NO7)反义引物P45′GAGAAGCTTAAGAGTAACGAATGTAGG 3′(SEQ ID NO8)所述PCR操作程序是在一500ul微量离心管中加入下列试剂模板DNA 2μL10x PCR buffer 10μL25mM MgCl28μL2.5mM dNTPs 8μL引物 各0.5μLddH2O 70μLTag酶3μL
混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数94℃变性4℃后，进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
将扩增出的类M蛋白基因片段与T载体连接，进行克隆。按常规方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序(J Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
实施例3构建猪链球菌2型mrp基因片段与马链球菌兽疫亚种类M基因片段融合基因及克隆将扩增的类M蛋白基因片段和mrp基因片段分别以DNA回收试剂盒(Roche公司产品)纯化，具体步骤按说明书进行。纯化后类M基因片段以BamHI和SacI(纽英伦公司产品)进行酶切；mrp基因片段以SacI和HindIII(纽英伦公司产品)进行酶切。酶切产物再次以DNA回收试剂盒回收。
将回收的类M基因片段与经BamHI和SacI双酶切的空pET-32a(+)质粒(TaKaRa公司产品)以T4连接酶(纽英伦公司产品)连接，转化感受态的DH5α以氨苄抗性平板筛选重组菌。利用QIAgen质粒提取试剂盒(QIAgen公司产品)，提取含类M基因片段的重组质粒，以SacI和HindIII进行双酶切后，以T4连接酶将其与经SacI和HindIII酶切并回收的mrp基因片段相连接，转化感受态的DH5α，以氨苄抗性平板筛选重组菌。
目的片断的回收和纯化PCR产物经1％琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即琼脂糖电泳后割下含DNA的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL ependoff管中；按每100mg琼脂糖块加入300μL结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将ependoff管涡旋振荡15～30s，置50℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2～3min涡旋振荡一次；按每100mg琼脂糖块加入150μL异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200μL洗脱缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15～25℃离心1min，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL ependoff管中，在吸附膜中央加入50～100μL溶解缓冲液，静置1min后，12000g、15～25℃离心1min，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20℃冻存备用。
PCR产物的酶切反应体系为20μL，在0.5mL ependoff管中依次加入SalI 0.5μLBamHI 0.5μL10X buffer 1 1μLDNA(PCR产物) 8μLddH2O 10μL混匀，37℃酶切2h，65℃15min终止反应。
质粒pET-322a(+)的扩增、提取接种含pET-322a(+)空质粒的宿主菌DH5α至LB肉汤(含Amp100ug/ml)中，37℃摇振培养12～14h。按QIAGEN质粒提取试剂盒说明书进行。
取3mL菌液至1.5mL ependoff管中，4℃、8000rpm离心3min，彻底弃上清；加250μL p1缓冲液至ependoff管中，重新溶解菌泥沉淀，混匀；加250μL p2缓冲液至ependoff管中，轻轻颠倒混匀4～6次，静置4min，可见溶液变澄清；加350μLN3缓冲液至ependoff管中，立即轻轻颠倒混匀4～6次；4℃、12000rpm离心10min，将上清吸至QIAprep柱中；4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；加0.5mL PB缓冲液至QIA prep柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去柱内的弃液；加0.75mLPE缓冲液至柱中，4℃、12000rpm离心1min，甩去离心柱内的弃液；再次离心1min；彻底弃去柱内的液体；将离心柱安置干净的1.5mL ependoff管中，加入50μL EB缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.5)至柱子中央，37℃静置1～2min，4℃、12000rpm离心1min，收集洗脱液，即为提取的质粒，-20℃冻存备用。
质粒pET-322a(+)酶切在0.5mL的eppendorf管依次加入质粒 8μL10X buffer 1 2μLBamHI1μLSacl 1μLddH2O 8μL
混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。
按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。
重组质粒的构建0.5mL ependorff管中依次加入载体DNA 0.5μLmrp基因PCR回收产物 4μL10X连接buffer2μLT4DNA连接酶 1μLddH2O12.5μL16℃连接过夜。
感受态细胞的制备和转化从新鲜LB平板挑取单菌落的DH5α接种10mL LB肉汤，37℃剧烈摇振培养3～4h后，冰上放置10min；4℃、6000rpm离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaCl2悬浮沉淀，置冰浴10min；4℃、6000rpm离心4min，加400μL冰预冷的0.1mol/mL CaCl2重新悬浮沉淀，4℃放置待用；取200μL感受态细胞至eppendorff管中，加入10μL的连接产物，立即混匀，冰上放置30min；42℃热休克90s，迅速转移至冰浴2min，然后加入800μL 37℃预热的LB培养基，37℃缓慢摇振2h；取100μL培养液涂布LB平板(含Amp 100μg/mL)37℃培养14～16h。
含mrp基因重组质粒酶切在0.5mL的eppendorf管依次加入重组质粒 8μL10X buffer 1 2μLBamHI 1μLSacl 1μLddH2O8μL混匀，37℃水浴酶切2h，65℃15min终止反应。
按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物基因融合0.5mL ependorff管中依次加入载体DNA 0.5μL类M基因PCR回收产物4μL10X连接buffer 2μLT4DNA连接酶 1μLddH2O 12.5μL16℃连接过夜。
将含融合基因的的重组质粒pET-S-M转化大肠杆菌BL21，感受态制备的方法及细菌的转化同上，用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。
重组质粒冰冻保存于-20℃，重组菌在含20～50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
融合基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。结果表明，所得到的融合基因的序列与设计的完全一致。
实施例4猪链球菌2型mrp基因片段与马链球菌兽疫亚种类M基因片段融合基因的表达将重组融合质粒转化感受态大肠杆菌BL21(TaKaRa公司产品)，以氨苄平板筛选。挑取单菌落接种含Amp的LB肉汤5mL，28℃摇振4～5h，接种含Amp的LB肉汤1000mL，28℃剧烈摇振4～5h，当OD600达0.6时，加IPTG(Sigma公司产品)诱导，37℃剧烈摇振2～4h。三角烧瓶于冰上5分钟，4℃5000g离心5分钟，弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。
实施例5猪链球菌2型mrp基因片段与马链球菌兽疫亚种类M基因片段融合蛋白的纯化重组菌经IPTG诱导后，离心，菌体沉淀以pH7.2、浓度为10m Mol的PBS溶液洗涤2次后，加入50mLpH7.2、浓度为10mMol的PBS溶液重新悬浮沉淀，以超声波仪进行破碎，破碎功率设定为800瓦、共破碎100次，每次破碎10s钟，间隔15s。破碎完毕后10000rpm离心10min，收集上清。取20μL离心后的上清，加等量SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，BL21空宿主菌亦经同样的处理作为对照，后进行SDS-PAGE。电泳结果如图1所示。电泳后凝胶经染色、脱色后，以薄层扫描测定融合蛋白占菌体总蛋白的含量，同时以BIO-RAD(Smart SpecTM3000)测定上清内菌体蛋白的总量。
破碎上清以His亲和层析柱层析(QIAGEN公司产品)，纯化重组蛋白，并以BIO-RAD(Smart SpecTM3000)测定收集蛋白的浓度。采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)测定蛋白的纯度，蛋白纯度为99％。
实施例6重组蛋白疫苗对仔猪的免疫保护效力试验1菌株和质粒马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)ATCC35246株，分离自我国四川，购自美国菌种保存中心；猪链球菌2型HA9801株系姚火春等从江苏1998年爆发猪链球菌病的病猪中分离、鉴定。
2实验动物实验猪为安徽省地方优良品种定远猪，由安徽芜湖某养猪场提供，重约8kg，免疫前饲养1周，确证无任何疫病。试验猪共40头，分4组，10头/组。
3试验方法3.1类M蛋白和MRP亚单位疫苗的制备将本实验室构建的含类M基因片段和含mrp基因片段的重组菌pET-32a(+)分别经IPTG诱导表达，以His亲和层析柱层析(QIAGEN公司产品)纯化，将蛋白浓度调整至2.0mg/mL，加入10％的氢氧化铝凝胶(南京药械厂产品)制备免疫用疫苗。
3.2融合蛋白免疫原的制备将重组菌的纯化融合蛋白调整浓度至2.0mg/mL，加入10％的氢氧化铝凝胶制备免疫用疫苗。
3.3疫苗猪体免疫实验及攻击将40头仔猪分成4组，每组10头。第1组用重组类M蛋白亚单位疫苗免疫，第二组重组MRP亚单位疫苗免疫，第三组用纯化的融合蛋白免疫，第四组为对照组。初次免疫1月后，各组以同样的疫苗加强免疫一次。再次免疫2周后，连同对照组均以强毒菌株攻击，记录每组的死亡猪头数。
4试验结果及结论强毒菌株攻击后，第一组两周内有3头猪发病死亡；第二组攻击后第5天有一头猪死亡，两周内共有4头猪死亡；第三组第六天开始有猪死亡，两周内共有2头猪死亡。对照组全部发病死亡(表1)。
表1融合蛋白的免疫保护效力试验
结论是重组融合蛋白对猪有80％的免疫保护率，经过优化和添加适当佐剂，其免疫保护效力会更高，其可作为预防猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种有效的重组亚单位二联疫苗。
序列表<110>范红结 陆承平 姚火春<120>一种链球菌重组亚单位疫苗及其制备方法<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>480<212>DNA<213>马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)<220>
<221>基因组<222>(1)..(480)<223>
<400>1tttgctggag ttgaagaaaa gcatgctcaa gcaatggctg catttgaagc agcattcgca 60gcatacaagg aagctgttaa ggctgaattg aaggcagcag gtgctagcga cttctacacc 120aagaagattg actctgccaa cacagttgac ggtgttaaga cactcagaga aatgatctta 180gactcaattg ctaagccaga ggttgaacca gaggctaagc ctgaacctaa gccagaacca 240aaacctgagc caaaaccaga acctaaacca gaacctaaac cagaacctaa gccagagcca 300aaaccagaac ctaagcctga gcctaagcca gaaccaaaac cagaacctaa gccaaaacct 360caacctaaac cagctccagc tccaaaacct gaagctagga aggaagagaa gaaagcagcg 420cctaagcaag acgccaacaa attgccatca acaggtgaag ctacaaatcc attcttcacc 480
<210>2<211>529<212>DNA<213>猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)<220>
<221>基因组<222>(1)..(529)<223>
<400>2aagagtaacg aatgtaggca tcaacttcag ctcctttata agttgagcta gccatatttt60tattatatga gtacaaatcg tacgattcaa aagtatacca atttggctct gatgtcgctt120taattccatc ttgagttcga agtgtatgtg gagcaattgc tgcaccattt ggctcagcca180ttgaaggcgt tgctgttgta gtgctatcta gaagggtacc ttcgccatca ccaactttca240atgttgatgc agttgtatca ggtgctactg tatcaagagc cgctgtcaag agaccatcta300cagtgtattt ttgcaattca ttccctagcg cctcgttggc tactttaacc gctgcgactt360gcgcttcaac ttgctcaaca gttgcttctg agtcagccaa aattgcctta gctgctgcaa420gttttgtttg agcatcctct atagcttttg caagagttgc atcttcagtt ttagccaact480ctttttgacc aagaccagcc aaaagtggtg attctgatgt tacctgttc529<210>3<211>1015<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>融合基因<222>(1)..(1015)
<223>
<400>3tttgctggag ttgaagaaaa gcatgctcaa gcaatggctg catttgaagc agcattcgca60gcatacaagg aagctgttaa ggctgaattg aaggcagcag gtgctagcga cttctacacc120aaraagattg actctgccaa cacagttgac ggtgttaaga cactcagaga aatgatctta180gactcaattg ctaagccaga ggttgaacca gaggctaagc ctgaacctaa gccagaacca240aaacctgagc caaaaccaga acctaaacca gaacctaaac cagaacctaa gccagagcca300aaaccagaac ctaagcctga gcctaagcca gaaccaaaac cagaacctaa gccaaaacct360caacctaaac cagctccagc tccaaaacct gaagctarga aggaagagaa gaaagcagcg420cctaagcaag acgccaacaa attgccatca acaggtgaag ctacaaatcc attcttcacc480gagctcgaac aggtaacatc agaatcacca cttttggctg gtcttggtca aaaagagttg540gctaaaactg aagatgcaac tcttgcaaaa gctatagagg atgctcaaac aaaacttgca600gcagctaagg caattttggc tgactcagaa gcaactgttg agcaagttga agcgcaagtc660gcagcggtta aagtagccaa cgaggcgcta gggaatgaat tgcaaaaata cactgtagat720ggtctcttga cagcggctyt tgatacagta gcacctgata caactgcatc aacattgaaa780gttggtgatg gcgaaggtac ccttctagat agcactacaa cagcaacgcc ttcaatggct840gagccaaatg gtgcagcaat tgctccacat acacttcgaa ctcaagatgg aattaaagcg900acatcagagc caaattggta tacttttgaa tcgtacgatt tgtactcata taataaaaat960atggctagct caacttataa aggagctgaa gttgatgcct acattcgtta ctctt 1015<210>4
<211>338<212>PRT<213>融合蛋白<220>
<221>misc_feature<222>(133)..(133)<223>第133位的′Xaa′为Arg或Lys.
<220>
<221>misc_feature<222>(247)..(247)<223>第247位的′Xaa′为Leu或Phe.
<400>4Phe Ala Gly Val Glu Glu Lys His Ala Gln Ala Met Ala Ala Phe Glu1 5 10 15Ala Ala Phe Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Val Lys Ala Glu Leu Lys Ala20 25 30Ala Gly Ala Ser Asp Phe Tyr Thr Lys Lys Ile Asp Ser Ala Asn Thr35 40 45Val Asp Gly Val Lys Thr Leu Arg Glu Met Ile Leu Asp Ser Ile Ala50 55 60Lys Pro Glu Val Glu Pro Glu Ala Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro65 70 75 80Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro85 90 95
Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro100 105 110Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Pro Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro115 120 125Lys Pro Glu Ala Xaa Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ala Pro Lys Gln Asp130 135 140Ala Asn Lys Leu Pro Ser Thr Gly Glu Ala Thr Asn Pro Phe Phe Thr145 150 155 160Glu Leu Glu Gln Val Thr Ser Glu Ser Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly165 170 175Gln Lys Glu Leu Ala Lys Thr Glu Asp Ala Thr Leu Ala Lys Ala Ile180 185 190Glu Asp Ala Gln Thr Lys Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ile Leu Ala Asp195 200 205Ser Glu Ala Thr Val Glu Gln Val Glu Ala Gln Val Ala Ala Val Lys210 215 220Val Ala Asn Glu Ala Leu Gly Asn Glu Leu Gln Lys Tyr Thr Val Asp225 230 235 240Gly Leu Leu Thr Ala Ala Xaa Asp Thr Val Ala Pro Asp Thr Thr Ala245 250 255
Ser Thr Leu Lys Val Gly Asp Gly Glu Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr260 265 270Thr Thr Ala Thr Pro Ser Met Ala Glu Pro Asn Gly Ala Ala Ile Ala275 280 285Pro His Thr Leu Arg Thr Gln Asp Gly Ile Lys Ala Thr Ser Glu Pro290 295 300Asn Trp Tyr Thr Phe Glu Ser Tyr Asp Leu Tyr Ser Tyr Asn Lys Asn305 310 315 320Met Ala Ser Ser Thr Tyr Lys Gly Ala Glu Val Asp Ala Tyr Ile Arg325 330 335Tyr Ser<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>5gttggatcct ttgctggagt tgaaga 26
<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>6gtagagctcg gtgaagaatg gatttg 26<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>7gtagagctcg aacaggtaac atcaga 26<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>
<400>8gagaagctta agagtaacga atgtagg2权利要求
1一种用于预防和/或治疗猪链球菌疾病的重组蛋白疫苗，其中含有由马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)类M蛋白片段和猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2)溶菌酶释放蛋白片段融合而形成的融合蛋白，以及药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
2.权利要求1所述重组蛋白疫苗，其中类M蛋白片段位于融合蛋白的氨基端，猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白片段位于融合蛋白的羧基端。
3.权利要求2所述重组蛋白疫苗，其中所述的融合蛋白具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项所述重组蛋白疫苗，其中所述的马链球菌兽疫亚种为马链球菌兽疫亚种ATCC35246株。
5.权利要求1-3中任一项所述重组蛋白疫苗，其中所述的猪链球菌2型为猪链球菌2型CGMCC NO.1446株。
6.权利要求1所述重组蛋白疫苗，其中所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白片段的编码基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.权利要求1所述重组蛋白疫苗，其中所述的猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白片段的编码基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
8.权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中所述融合蛋白的编码基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
9.上述权利要求中任一项所述重组蛋白疫苗在制备用于预防和/或治疗猪链球菌疾病药物中的用途。
10.一种猪链球菌2型菌株，其保藏号为CGMCC NO.1446。
全文摘要
本发明提供了一种疫苗组合物及其制备方法，其中所述疫苗组合物中包括由马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)类M蛋白片段和猪链球菌(Streptococcussuis)2型溶菌酶释放蛋白片段融合而形成的融合蛋白，该融合蛋白具有良好的免疫原性，可有效防制猪链球菌病。本发明还提供了编码该融合蛋白的基因。
文档编号C12N15/62GK1833723SQ200610075969
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月25日 优先权日2006年4月25日
发明者范红结, 陆承平, 姚火春 申请人:范红结, 陆承平, 姚火春