专利名称：一种缺磷诱导基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种缺磷诱导基因启动子及其应用。
背景技术：
磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，它不仅是植物细胞中ATP，核苷酸和磷脂的重要组成成份，而且在能量转移、蛋白激活和碳氮代谢中起着非常重要的调节作用。土壤中绝对磷含量通常很高(＞1000μM)，但磷在土壤中极易以有机和无机形式固定，因而有效磷的浓度非常低，大约在2-10μM，扩散到根表面的磷更低，很难满足植物生长发育的需要。在农业生产中，通过大量施用磷肥来满足农作物生长需要。但在大田生产中很难把握准确的施肥时间，通常采用施加底肥的方式。由于雨水的淋洗和土壤的固定，导致施用磷肥的利用效率非常低，往往不能满足植物发育后期的需求。当植物表现明显缺磷症状时再施肥，时间又太晚，已造成的一些生长发育上的伤害不可补救。如果能用一种快速、简便的分子诊断方法来准确地反映植物体内的磷营养状况，就能及早预报和及时施肥，提高磷肥的利用效率和减少环境污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种缺磷诱导基因启动子及其应用。
本发明所提供的缺磷诱导基因启动子，名称为PPDI1(Promoter ofPhosphorus-deficiency-induced genel)，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由1737个脱氧核苷酸组成。
含有上述缺磷诱导启动子的表达盒、表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的缺磷诱导启动子专一受磷饥饿诱导表达，可受磷信号调控，因此可用该启动子与一些目标基因融合，构建有经济价值的载体。例如，将本发明的启动子与LC基因融合，在缺磷的条件下，可诱导启动子启动LC基因的表达，从而使植株大量积累花青素呈现紫红色，可用于监控土壤中有效磷的浓度。本发明的启动子及其分子机理，可为培育磷高效农作物新品种提供理论依据和基因资源。
图1为缺磷诱导启动子-GUS的重组载体PPDI1∷GUS结构简2为转PPDI1∷GUS拟南芥在正常和缺磷条件下培养的植株GUS染色照片图3A为RT-PCR方法分析拟南芥在N、P、K、Mg、Fe不同营养元素胁迫处理3天后PDI1基因在根和叶中的表达谱图3B为RT-PCR方法分析拟南芥在2.5mM磷和0mM磷条件下PDI1基因在不同时间段根和叶中的表达情况图3C为RT-PCR方法分析拟南芥在不同磷浓度下处理3天后PDI1基因在根和叶中的表达情况图4pCAMBIA1391的物理图谱图5为pCAMBIA1391-PPDI1∷LC载体结构简6为转pCAMBIA1391-PPDI1∷LC拟南芥和野生型拟南芥在缺磷条件下的LC表达情况具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、缺磷诱导启动子的获得及其功能验证1、缺磷诱导启动子PPDI1的获得根据拟南芥基因组序列，设计缺磷诱导启动子特异引物F5′-AAG CTTGTTTCA GTA CTA GCC TCA CG-3′和R5′-GGA TCCCAA AAT ATA AAC TCA AG-3′，在引物的5′端分别附加一个HindIII和BamHI酶切位点。提取columbia生态型拟南芥基因组DNA作为模板，用PCR方法扩增出启动子片段；其中，扩增体系为，DNA2μl(10ng)，10x ExTaq buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.0μl，引物F(10μM)0.5μl，引物R(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl)0.2μl，H2O 17.3μl，扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟35个循环；72℃延伸5分钟。扩增得到1749bp片段，将其连接到pMD18-T载体得到重组载体，经测序表明该扩增片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，该扩增片段即为PPDI1启动子。
2、缺磷诱导启动子PPDI1的功能验证
(1)含有PPDI1和GUS基因的质粒PPDI1∷GUS的构建及转基因植株的获得用HindIII和BamHI双酶切重组载体获得启动子片段，将该启动子片段命名为PPDI1。将PPDI1与经过HindIII和BamHI双酶切切去35S启动子的带有GUS基因的pBI121载体连接，转化大肠杆菌，进行酶切和菌落PCR鉴定，将鉴定正确的含有PPDI1的质粒命名为PPDI1∷GUS(结构简图如图1所示，Promoter表示PPDI1)。
将PPDI1∷GUS转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用上述F和R引物进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的阳性克隆大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，当代收获的为T0代转基因种子。T0代转基因种子在含有抗生素Kanamycin和Timenten的培养基上筛选下得到T1代转基因阳性植株，成熟后得到T1代种子。T1代种子在含有抗生素Kanamycin的培养基上筛选，转基因阳性植株成熟后得到T2代种子。T2代种子播种含有抗生素Kanamycin培养基上，全部为绿苗的株系为转基因纯合系，其所获得的种子为T3代。
(2)PPDI1启动GUS基因表达选5个T3代转基因纯合系，种子在ATS培养基(包括KNO3(5mM)，MgSO4(2mM)，Ca(NO3)2(2mM)，KH2PO4(2.5mM)，H3BO3(70μM)，MnCl2(14μM)，ZnSO4(1μM)，CuSO4(0.5μM)，NaCl(10μM)，Na2MoO4(0.2μM)，FeSO4(40μM)，蔗糖(43mM)，4.7mM MES，8g/1000ml琼脂(agar)，pH调成6.0)上发芽，生长7天后，把幼苗分别移到ATS培养基(对照)或缺磷的培养基(不含KH2PO4的ATS培养基)继续生长3天，然后取整株进行GUS染色，用70％的乙醇脱绿后，进行镜检观察并照相。其结果如图2所示，在缺磷培养基处理3天的拟南芥，植物的整个根系(包括根毛)和一部分叶片被染成兰色，而在磷充足时整个植株都没有表达。
(3)PPDI1启动子受缺磷诱导为了检测PPDI1启动子在根和叶中启动基因转录是否只受磷元素的调控，对野生拟南芥幼苗进行缺氮、磷、钾、镁、铁处理(缺P，Mg和Fe处理，在ATS培养基中分别不加KH2PO4，MgSO4，FeSO4；对于缺N处理，用5mM KCl和2mM CaCl2取代ATS培养基中的5mM KNO3和2mM Ca(NO3)2以补偿培养基中Ca2+的浓度；对于缺K处理，用2.5mM NH4NO3和2.5mM NaH2PO4取代ATS培养基中的5mM KNO3和2.5mM KH2PO4以补偿培养基中的N和P离子浓度)。当拟南芥在正常加磷的ATS培养基中生长7天后，转移至缺N，P，K，Mg和Fe处理培养基中继续生长3天，然后收集叶片和根系，提取总RNA，用RT-PCR法分析PDI1基因(其基因组基因如序列表中序列2所示，cDNA序列如序列3所示)的表达，其中，PCR扩增PDI1的引物为F1ACA AGA GTC GTT GCC GGA GT和R1GCC ACC TTCACT GGA TCC AC。结果如图3A所示，表明在氮、磷、钾、镁和铁缺乏胁迫处理植株中，只有在缺磷植株中检测到PDI1基因的转录，从而表明PDI1基因在拟南芥根和叶中的转录受磷专一调控。
对于不同时间段的基因表达模式，所用培养基为ATS培养基。首先，野生型拟南芥种子用1％的NaClO消毒15分钟，然后用灭菌的蒸馏水清洗4次，1g/1000mL的琼脂(agar)悬浮后，播种在磷含量在2.5mM的ATS正常培养基上。4℃春化3天后，转移至16小时光照/8小时黑暗、22～24℃的培养间，培养皿垂直放置。生长7天后，再把幼苗分别转移至正常和不加磷的培养基生长6小时，12小时，1天，3天，5天，然后把在缺磷培养基生长5天的幼苗重新转移至正常加磷培养基上继续生长1天和3天。在每个时间点取正常和缺磷培养基上生长幼苗的叶片和根系，在液氮中速冻。用Trizol试剂提取总RNA，用于PDI1基因的表达谱分析，扩增PDI1基因所用引物为R1和F1。结果如图3B所示，结果表明PDI1基因在根和叶中的转录受缺磷诱导。其表达变化是，缺磷后12小时在叶片诱导表达，而在根中缺磷1天后开始诱导表达，到缺磷5天后根和叶中表达量达最大。当把生长在缺磷培养基5天后的植株重新转移至磷充足的培养基中，基因表达关闭。
为了观察在培养基中磷浓度对PDI1基因表达丰度的影响，野生型拟南芥种子在正常加磷的ATS培养基中生长7天后，转移至磷含量分别为0，0.05，0.1，0.25，1.0，2.5和10mM的培养基中继续生长3天，然后收集叶片和根系，提取总RNA，用RT-PCR法分析PDI1基因的表达，扩增PDI1基因所用引物为R1和F1。结果如图3C所示，结果表明不加磷时，PDI1基因只在不加磷时根中强烈表达。叶片中，未加磷时表达量最大，随磷浓度的增加，PDI1基因的转录丰度下降，到磷浓度升至1mM时基本检测不到PDI1的转录产物。
实施例2、用缺磷诱导启动子PPDI1预警植物的磷营养状况由于PPDI1专一受磷饥饿诱导表达，可受磷信号调控，因此可用该启动子与一些目标基因融合，构建有经济价值的载体。
因PPDI1启动子的诱导强度随磷浓度的减少而增强，当培养基中磷浓度为250μM时，PPDI1启动子开始启动基因的表达。根据土壤速效磷丰缺指标，＜5mg/Kg缺磷，5-10mg/Kg中等，＞10mg/Kg不缺。也就是当土壤速效磷为中等或缺乏时，PDI1基因的启动子PPDI1将启动所控制基因的表达。如果将PPDI1启动子与一个色素基因融合，转入到植物中，当转基因植株遭受中等缺磷胁迫时就会快速地在地上部表现出色素变化，从而可预警植物的磷营养状况。玉米的LC基因是一个控制植物花青素合成的调控因子，增加LC基因的表达可增加花青素的合成。因此，可用PPDI1启动子控制LC基因的表达体系，进行农作物磷营养状况的分子诊断。具体方法如下所述将实施例1中用引物F和R PCR获得的PPDI1启动子片段，插入到pCAMBIA1391(图4)载体的HindIII和BamH1酶切位点之间，转化大肠杆菌，酶切和菌落PCR鉴定正确的含有PPDI1启动子的重组pCAMBIA1391质粒命名为pCAMBIA1391-PPDI1。
用LC基因的特异引物F25′-GGA TCCATG GCG CTT TCA GCT TC-3′(BamHI酶识别位点)和R25′-GGT AACCTCA CCG CTT CCC TAT AGC T-3′(BstEII酶切识别位点)以玉米品种农大3138新鲜雄穗或雌穗的cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，扩增程序为94℃预变性3分钟；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 2分钟35个循环；72℃延伸10分钟。扩增体系为cDNA(20ng/μl)2μl，10xLA buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.0μl，F1(10μM)0.5μl，R1(10μM)0.5μl，LATaq(5u/μl)0.2μl，H2O 17.3μl，扩增得到1.8kb的片段，将其连接到pMD18-T载体，测序表明该片段为5′和3′两端分别带有BamH1和BstEII酶切位点的LC基因(玉米花青素调控基因)的全长cDNA(GENBANK号为168600)，将含有LC基因的pMD18-T载体命名为pMD18-T-LC。进而用BamH1和BstEII双酶切从pMD18-T-LC质粒中获得LC基因cDNA片段，与经过BamH1和BstEII双酶切切去GUS基因的pCAMBIA1391-PPDI1质粒连接，转化大肠杆菌，提取质粒，酶切和菌落PCR鉴定正确的重组质粒命名为pCAMBIA1391-PPDI1∷LC，pCAMBIA1391-PPDI1∷LC载体的结构简图如图5所示。
将pCAMBIA1391-PPDI1∷LC转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101，用上述R和F引物以及R2和F2引物进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的阳性克隆命名为PPDI1∷LC。将PPDI1∷LC大量培养，通过蘸花浸染法转化拟南芥，当代成熟收获后为T0代pCAMBIA1391-PPDI1∷LC的转基因拟南芥种子，T0代转基因种子在含有抗生素Hygromycin和Timenten培养基筛选下得到T1代转基因阳性植株，成熟后得到T1代种子。T1代种子在含有抗生素Hygromycin培养基上筛选，绿苗为T2代转基因阳性植株成熟后得到T2代种子。T2代种子继续在含有抗生素Hygromycin培养基上筛选，获得T3代转基因纯合系。
对获得的T3代转基因纯合系植株和未转基因的Columbia生态型拟南芥(野生型)植株分别进行缺磷处理，检测PPDI1启动子是否在磷饥饿时能启动LC基因表达。处理方法是把转基因植株和野生型植株种子播种在磷含量在2.5mM的ATS正常培养基上生长5天后，把幼苗转移到缺磷的培养基(不含KH2PO4的ATS培养基)继续培养，并观察幼苗叶片和茎的花青素变化，在缺磷培养基生长7天时，幼苗的叶片和茎上可以观察到花青素的积累，到10天，色素积累就非常明显，整个幼苗呈紫红色，而在野生型中观察不到有花青素的积累(图6)。表明LC的表达强烈受PPDI1启动子的诱导表达。
植物对磷从土壤活化、吸收到体内转运和代谢是一个非常复杂的生理生化过程，受一系列基因及复杂的网络调控。从突变体到基因的正向遗传学研究方法是分子生物学研究的一种最常用方法，从自然或人工诱导突变体中分离其对应的基因，进行功能研究。通常，为寻找目的基因的上游调控基因，传统方法之一是将目的基因的启动子克隆在报告基因GUS的上游，转化植株，然后用化学或物理方法诱变转基因种子，筛选出所需要的突变体。GUS编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，其组织化学反应所需X-Gluc为底物，其价格非常昂贵，并且播种、染色和筛选都特别麻烦。用天然的色素基因取代GUS基因作为报告基因，不用染色而可通过目测判断，可大量节省人力、物力和简便突变体的筛选。PPDI1启动子能在低磷胁迫时启动花青素调控基因LC的表达，增加花青素的合成。这样通过花青素的积累就可以直接根据植物的颜色变化，来确定磷的浓度。
也可将LC基因与其他营养元素或逆境(如抗盐、抗旱、抗寒等)诱导表达基因的启动子融合，构建转化载体，转化植株，筛选出相应的突变体，克隆出相应基因用于生物学分析。
序列表<160>3<210>1<211>1737<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1gtttcagtac tagcctcacg tcgtgttggc ctaaatcaga gagagcattc aattttcttt60gttttttttt tgtttgttag acatttttta aggtattcgt aattgtatca atttcttggt120ttctctggca attttaggta ttactgtttc aatttagaag ctagagaagt aaagagtgcc180cacttcatct atctctttcg cctactatta ggggcaaaaa aaagaaagtc aaatctaaaa240agagaagaga aacaaacttt attgttgctc ttatagtttc tatatcattt tcactgtaga300atcaaatttg gcctttggct ttggggttta agctatacca cctacttaga attattcttc360acgtatactt tattctttac ttatgattgg aaacataccc aatcactaat aatgttcgta420atcaccactc aatactcaat agatatcaac aaagttgtgt gattcaaagt tgttgtgatt480gttcaactag acttatcacg caataatttg gtgggtactt actaggattg tacagattaa540aatcataaat ccattttttg cttggtgtct aatcacttgg atttagtgtt tacaaaatat600tagttatgaa tgtctttttt aataaaattg tgtcattcaa gagtttattg ggataaattt660caagagtttt tactttttat ttcatgtcaa aaagttgtat atttcatgct tttatttttg720tcaaaacgtt taattttgat tgacaatttt taattttata agatggacag aaacacgttt780tccaaaaaca acaaatggac ataaacacat tgggcttagc ccatacaaag tggatacata840aaatagaaaa accaaattaa atgactagaa ataaaaggac tgggcccgag aacgtgaaag900taagcccaac ttacatagaa gtccaaaaac actaaaactt tcatgttgtt aatattttcc960agtttgcatt attttacact tatacaaata acaacagatg cttgattctc ttggaatctt1020cgaattctct gtctttaaga ctttacaaag atctcattaa ttaccacttt aaccctgaaa1080tctggtcacg ggtctgggtc attttggtca cttttatctc taatcccaca aacgtaccgg1140caaattcttc cttttttttc tgctcgacgg tctctcgagg acgcgactca cagtcacatc1200aacagcatgc attcagaaaa atcaaaaaac aaatgaatta tatgataaat aaaattagtt1260gatcgaggaa tcaacctaaa ttctatagtt tataccttga caaaaagata gcatgaaatc1320agcaaactca tgtaatatac caaacatacc ataaaaggtc cggtcaaaaa tagaaaaaca1380cgaaaaagca ttataactaa attcaaagtt caaacataag actcaaagag aagttattag1440agaccgaata tgccagagga tttgtatctt cttctttttt tactatacaa caacaataat1500ctaaccttat tttttttcat ctctttatta catgccatat tcacaacact tcgtcacgct1560aaagctaagc atatccgctt tcatattcct ttacacaacc actatttata tatctctata1620tttaccctct tcttcttctt ccaatttcgt tataatatac ttctttccct ttttcaatca1680
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权利要求
1.一种缺磷诱导基因启动子，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述缺磷诱导基因启动子的表达盒。
3.含有权利要求1所述缺磷诱导基因启动子的表达载体。
4.含有权利要求1所述缺磷诱导基因启动子的细胞系。
5.含有权利要求1所述缺磷诱导基因启动子的宿主菌。
6.权利要求1所述的缺磷诱导基因启动子在预警植物的磷营养状况中的应用。
7.权利要求1所述的缺磷诱导基因启动子在培育转基因植物中的应用。
8.权利要求1所述的缺磷诱导基因启动子在构建基因工程载体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种缺磷诱导基因启动子及其应用。该启动子，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的缺磷诱导启动子专一受磷饥饿诱导表达，受磷信号调控，因此可用该启动子与一些目标基因融合，构建有经济价值的载体。
文档编号C12N15/82GK1844394SQ200610075838
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月20日 优先权日2006年4月20日
发明者赵婷, 凌宏清 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所