专利名称：有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法
技术领域：
本发明涉及一种在实验室阶段小试规模上，能够有效提高阿维菌素产量的新技术，尤其能够缩短发酵周期，减少能耗，降低生产成本。
背景技术：
21世纪是生物农药的世纪，阿维菌素(Avermectins)作为一种新型抗生素类生物农药，具有结构新颖、高效、安全、农畜两用的特点，在常用剂量下，对人、畜安全，不伤害天敌，不破坏生态。
阿维菌素是一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生。阿维菌素药剂的特性主要有如下几点1、杀虫谱广。目前报道阿维菌素杀虫谱有84种，如虫体小、世代多、易出现抗药性的害虫梨木虱、棉蚜等，潜叶性的害虫美洲斑潜蝇等，害螨二斑叶螨、茶橙叶螨、山楂叶螨和寄主广、食性杂的害虫小菜蛾等。2、杀虫机制独特。阿维菌素是一种神经毒剂，其机理是作用于昆虫神经元突触或神经肌肉突触的GABAA受体，干扰昆虫体内神经末梢的信息传递，即激发神经未梢放出神经传递抑制剂γ-氨基丁酸(GA-BA)，促使GABA门控的氯离子通道延长开放，对氯离子通道具有激活作用，大量氯离子涌入造成神经膜电位超级化，致使神经膜处于抑制状态，从而阻断神经未梢与肌肉的联系，使昆虫麻痹、拒食、死亡。因其作用机制独特，所以与常用的药剂无交互抗性。另外，除GABA受体控制的氯化物通道外，阿维菌素还能影响其他配位体控制的氯化物通道，如伊维菌素(Ivermectin)可以诱导无GABA能神经支配的蝗虫肌纤维的膜传导的不可逆增加。3、良好的层移活性。层移活性指的是阿维菌素在喷施后能渗入作物叶片组织中，表皮薄壁细胞内形成药囊，长期贮存，所以阿维菌素有较好的持效期。因为其良好的层移活性，使得阿维菌素对害螨、潜叶蝇、潜叶蛾以及其他钻蛀性害虫或刺吸式害虫等常规药剂难以防治的害虫有高效。阿维菌素在土壤和水中易降解，并在土壤中被土壤吸附，不会淋溶，无残留，不会污染环境；在生物体内也无积累和持久性残留，所以阿维菌素属于无公害农药。阿维菌素还可以通过土壤微生物分解成具有更高活性的衍生物，如对于植物线虫产生的杀虫作用。
“十一五”规划意味着新工业时代的到来，强调绿色、环保、建立和谐社会，给阿维菌素的生产销售带来空前发展机遇，也给阿维菌素的衍生产品带来空前发展机遇。当前阿维菌素在国内面临的最大机遇还在于，我国每年的高毒农药使用量占全部农药使用量的30％左右，而2007年我国全面禁止高毒农药的替代效应，直接为阿维菌素等高效低毒的生物杀虫剂的发展提供了广阔的空间。阿维菌素作为目前主要的生物农药品种呈现供不应求的状态，从而直接导致了2004年3月以来，阿维菌素的价格从900元/kg左右一直盘升到2300元/kg左右。
于是，为了更好的满足现有需求，科研人员和专家长期以来一直致力于提高阿链霉菌发酵效价及缩短发酵周期，在这两个方面做出了很多相关研究。
一.国内关于提高阿链霉菌发酵效价的手段主要分为以下四类1.经典的改造菌株的手段，利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法(或特定的筛子)获得所需要的高产优质菌株。诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变指的是染色体或DNA中的碱基发生变化即点突变。诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌株的育种方法。
A.通过单纯一种诱变剂诱变提高产量高频电子流诱变、亚硝基胍进行诱变B.通过多种诱变剂量混合或多次诱变以提高产量紫外线(UV)，亚硝酸(HNO3)及亚硝基胍(NTG)诱变处理并结合L-异亮氨酸紫外线和亚硝基胍进行诱变处理经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变处理及对其原生质体的诱变再生，并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选2.基因工程技术将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术成为基因工程或DNA体外重组技术。
3.通过优化发酵培养基各组分碳源、氮源、无机盐、生长因子和水的配比使得菌体在一个最适合产生次生代谢物的养分环境中生长。
4.通过优化通气量、发酵温度和接种量等外界条件使得菌体发酵效价达到最大。
传统的提高发酵效价的方法虽然有一定的效果，但是其均有一定的缺点1.通过诱变剂诱变提高产量的方法的缺点a.经过多次诱变处理以后，菌株对诱变剂产生了高度耐受性，导致负突变大量增加，正突变急剧减少，甚至消失。当一株菌株经过数次诱变以后，其高耐受能力阻碍更加高产菌株的获得。
b.诱变后产生的高产菌株在传代的过程中很容易退化，有报道，筛选出的高产阿维链霉菌在传代第3次就退化，高产特性完全消失。
c.诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，需进行大量的筛选才能获得高产菌株。通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件的优化研究，确定最佳的发酵条件，才能使高产菌株的生产能力充分发挥出来，因此诱变和筛选高产菌株工作量大。
d.在筛选过程中，一个直观的，显著的，快速的检测手段对于大批量筛选高产菌是必要的。但是检测阿维链菌素的最成熟和简便的方式是通过HPLC，高产特性不能直观体现在平板上，对于诱变产生高产菌的筛选造成了极大的困难。
2.通过基因工程菌提高产量的方法的缺点a.首先要完全清楚目的菌株的遗传背景，对于其产生阿维菌素的基因片段要精确定位，明确调控序列，这样才能为目的基因片段的提取和扩增提供依据。而阿维链霉菌的基因结构目前还未完全得到阐明，代谢途径过于复杂，还不具备构建基因工程菌的条件。
b.并且，基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定现象。质粒不稳定可以分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。质粒的分裂不稳定是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。由于这类菌与带有质粒的菌相比有一定的生长优势。因此在培养中能逐渐代替带有质粒的菌成为优势菌，以致减少了外源基因的表达产量。
3.通过优化发酵培养基各组分及优化通气量、发酵温度和接种量等外界条件提高产量的缺点对于一株已经确定的菌株，当其碳源、氮源、无机盐、生长因子和水的营养因素和温度，通气量等外界因素达到最优组合时，则不能继续提高其产量。
二.放线菌属微生物生长缓慢，发酵周期长的特点使得单位时间发酵轮数低，此特点长期制约着该工业生产，并限制着产量大幅度提高。
但是，目前为止，无论用上述何种方法，均不能很显著缩短发酵周期，长的发酵周期意味着产量的难以有明显的提高，这成为了制约该工业的一个瓶颈问题。
发明内容
为了克服现有的发酵技术存在的周期长的缺陷，本发明提供一种有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法，采用空气离子对阿维菌素链霉菌平皿培养和液体摇瓶发酵过程进行处理，经过检测利用空气离子处理后的阿维菌素链霉菌在发酵周期上大大缩短，在产量上也有很大的提高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法，其特征在于在阿维链霉菌的发酵过程中通入空气负离子，形成空气负离子环境。
所述的阿维链霉菌的发酵过程是指实验室的阿维链霉菌的平板培养和摇瓶发酵过程。
所述空气负离子，由空气离子发生器产生，主要成份为O-，O2-，O3-，CO3-，HCO3-，NO2-，NO3-，NO3-(H2O)n，NO3-(HNO3)m(H2O)n，浓度为103-107个/cm3。
所述空气负离子浓度为104-105个/cm3。
所述的阿维链霉菌可以由链霉素、卡那霉素、丝裂霉素、井刚霉素、红霉素等放线菌和霉菌、酵母和细菌替代。
技术方案所依据的科学原理空气离子发生器的工作原理是当在电极上较高但未达到击穿的电压时，如果电极表面附近曲率半径很小处的电场很强，则该处的气体介质会被局部击穿而产生电晕放电现象。一个负的电压脉冲被加到针形电极上时，所产生的电离过程不受任何电荷积累的影响。在平行于针形电极轴的位置上就会产生羽毛状的电晕，使得周围的空气大量电离。空气离子发生器把输入的220V的交流电压转变为10000V左右的负脉冲电压。然后把该高电压加到针状电极上，使得电极周围的空气电离，产生大量的空气离子，同时电离空气中的与电极极性相反的离子被电极吸收，从而形成非平衡弱电离气体。在常温常压下，由负离子发生器产生的空气负离子主要有O-，O2-，O3-，CO3-，HCO3-，NO2-，NO3-，NO3-(H2O)n，NO3-(HNO3)m(H2O)n。
一定浓度的空气负离子对阿维菌素产量的提高，以及周期缩短的原理1、空气负离子可以调节细胞呼吸率，提高菌体的整个代谢过程。以往的研究表明，空气离子有着很显著的正生物效应，这些离子与组织细胞线粒体的能量依赖性分化过程有着显著的关系。(Staurouskain研究大鼠吸入空气负离子后肝脑心匀浆中线粒体赖能过程，发现负离子可改善线粒体的呼吸率，摧毁Ca+在线粒体内积累，提高ADP/O值。(Staurouskain IG。Optimization of energy-dependent processes in microchondriafrom rat liver and brain after inhalation of negative air ions。Biofizika)空气离子在加强线粒体氧化磷酸化，调节呼吸率时，主要是保存和维护线粒体三分子体结构的完整性。(Temnor AV，Siroat TV。Effect of superoxide in air on structuralorganization and phosphorylation respiration of microchondria。BiochemistryMosc.1997)。并且，经过空气负离子处理过的动物，其红细胞中SOD活性增强，催化H2O2转化为H2O，清除了H2O2毒害作用—脂质过氧化。(Jacobson，AR.Recent results from theEORTE RF payload.11thInternational conference on AtmosphericElectricity，Proceedings.Guntersville，Alabama，USA，1999)。而这些研究表明适当浓度下空气负离子对细胞活力增强，延缓衰老有着显著的作用。由于细胞活力增强，导致细胞的代谢途径包括次生代谢途径受到了刺激作用，控制次生代谢物的酶的活性提高，使得其次生代谢物产量提高，提早进入产素高峰期，这就是为什么处理后的菌体可以缩短发酵时间提高产量的原因。
2、再者，空气离子中的某些成分可能消除了代谢过程中的产物抑制作用。微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是相互协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反映。在实际生产中，往往需要高浓度地积累某一种代谢产物，而这个浓度又常常超过细胞正常生长和代谢所需的范围。因此要达到超量积累这种产物，提高生产效率，必须打破微生物原有的代谢调控系统，在适当的条件下，让微生物建立新的代谢方式，高浓度地积累人们所期望的产物，而空气负离子中的某种或混合成分协助促进微生物建立新的代谢方式。
本发明的有益效果显著缩短发酵周期，产量平台期出现时间从原来的第8天提早到现在的第4天，使单位时间的发酵轮数提高了100％，并且峰值产量比对照组提高20.4％。处理组第三天和第四天的产量增长率达到78.6％，而对照组仅为55.9％。更为显著的是，处理组在达到平台期的第四天的产量比同期的对照组的产量提高73.5％，大大地减少了人力、财力及能源的消耗
图1为阿维链霉菌平板发酵时的实验装置图。
图2为阿维链霉菌发酵瓶发酵时的实验装置图，可以同时进行5组平行处理。
图3为阿维链霉菌发酵瓶放置在摇床上的实验装置图。
具体实施例方式
参见附图。图中标号1、空气负离子发生器，2、平面皿，3、锥形瓶，4摇床。
平皿实验实验菌株阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)培养基及培养条件培养条件平板培养基酵母提取物4.0g/l
麦芽提取物 10g/l葡萄糖 4.0g/l琼脂 15.0g/l种子培养基淀粉 30g/l豆饼粉 20g/l酵母粉 2g/lCoCl3·6H2O 0.0005g/l发酵培养基葡萄糖 5.0g/lNaCl 0.2g/lK2HPO40.05g/lCoCl2·6H2O 0.0005g/lMgSO4·7H2O 0.01g/lMnSO4·7H2O 0.005g/lZnSO4·7H2O 0.005g/lFeSO4·7H2O 0.005g/lPH7.0蒸馏水配制，分装40ml/250ml三角瓶。
以上培养基0.1Mpa，121℃灭菌30min培养温度均为28℃摇床转速220转/分阿维菌素含量检测方法HPLC法色谱柱HYPERSIL C18 150×4.6mm流动相CH3OH∶H2O＝90∶10流速1.0ml/min检测波长246nm柱温25℃进样量20ul
1.平皿实验A.选择将斜面培养基上培育10天，已长出丰富灰色孢子的斜面，用10ml无菌水洗下，迅速倒入盛有90ml无菌水，并带有玻璃珠的250ml摇瓶中，沿顺时针转动摇瓶10min。
B.吸取菌液0.1ml于盛有4ml固体培养基的细胞培养皿(规格35mm×10mm)上，用玻璃涂棒将菌液涂抹均匀。
C.如图1所示，将涂好的平皿敞口放置于灭过菌的封闭的干燥皿中，通入104-105个/立方厘米的空气负离子，主要含有O-，O2-，O3-，CO3-，HCO3-，NO2-，NO3-，NO3-(H2O)n，NO3-(HNO3)m(H2O)n负离子，持续通入9天，在通气后第三天取样，以后每天同时取下对照组和负离子处理组，并下样检测。
D.平皿菌苔检测法铲取28℃培养的菌苔，放置于-20℃预冷研钵中，迅速研磨，待细胞研磨破碎后，再加入10ml分析级无水乙醇，倒入50ml离心管中，随后将离心管在旋涡式混合震荡器上混匀，最后以3000转/分离心5分钟。吸取上清夜，用0.22um的滤膜过滤，用HPLC检测。
实验结果 附摇瓶实验方法A.选择将斜面培养基上培育10天，已长出丰富灰色孢子的斜面，用接种环挑取一个菌落直接接入种子瓶，摇床培养24h，随后吸取2ml菌液于盛有40ml液体培养基的250ml摇瓶中，摇床上培养。处理组通入105-106个/立方厘米的负离子。如图2所示。
B.从发酵开始后第三天开始取样。
C.摇匀发酵液，吸取发酵液2ml，离心除去上清夜，将菌体沉淀移入-20℃预冷研钵中，迅速研磨，待细胞研磨破碎后，再加入8ml分析级无水乙醇，倒入50ml离心管中，随后将离心管在旋涡式混合震荡器上混匀，最后以3000转/分离心5分钟。吸取上清夜，用0.22um的滤膜过滤，用HPLC检测。
权利要求
1.有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法，其特征在于在阿维链霉菌的发酵过程中通入空气负离子，形成空气负离子环境。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的阿维链霉菌的发酵过程是指实验室的阿维链霉菌的平板培养和摇瓶发酵过程。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述空气负离子，由空气离子发生器产生，主要成份为O-，O2-，O3-，CO3-，HCO3-，NO2-，NO3-，NO3-(H2O)n，NO3-(HNO3)m(H2O)n，浓度为103-107个/cm3。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述空气负离子浓度为104-105个/cm3。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述的阿维链霉菌可以由链霉素、卡那霉素、丝裂霉素、井刚霉素、红霉素等放线菌和霉菌、酵母和细菌替代。
全文摘要
本发明公开了一种有效缩短阿维链霉菌发酵周期提高阿维菌素产量的方法，是在阿维链霉菌发酵过程中通入空气负离子。本发明能够显著缩短发酵周期，使产量平台期出现时间从原来的第8天提早到现在的第4天，使单位时间的发酵轮数提高了100％，并且峰值产量比对照组提高20.4％.处理组第三天和第四天的产量增长率达到78.6％，而对照组仅为55.9％。更为显著的是，处理组在达到平台期的第四天的产量比同期的对照组的产量提高73.5％，大大地减少了人力、财力及能源的消耗。本发明还可应用于链霉素、卡那霉素、丝裂霉素、井刚霉素、红霉素等放线菌和霉菌、酵母和细菌的发酵。
文档编号C12R1/01GK1928108SQ200610086279
公开日2007年3月14日 申请日期2006年8月29日 优先权日2006年8月29日
发明者杨倩, 许勇建, 余增亮, 吴跃进, 郑之明 申请人:中国科学院等离子体物理研究所