专利名称：近平滑假丝酵母cctcc m203011的(s)－羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成的制作方法
技术领域：
近平滑假丝酵母CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，该(S)-专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，属于生物工程技术领域。
背景技术：
光学纯苯基乙二醇，即(S)-苯基乙二醇，又可记作(S)-PED，不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且已成为制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极有意义。
利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机—水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。
目前，部分立体选择性氧化还原酶基因已通过基因工程手段获得，而对于来源于近平滑假丝酵母的立体选择性氧化还原酶基因，仅有用于拆分1，3-丁二醇的脱氢酶CpSADH和用于不对称转化泛解酸内酯的聚酮还原酶C1和C2的报道，而这些酶的同源性不高，基因序列之间存在差异。
发明内容
本发明的目的是提供近平滑假丝酵母CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，以便利用该基因的重组菌株进行外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
本发明的技术方案近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCCM203011的(S)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO1。该近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQ ID NO2。
通过对立体选择性氧化还原酶酶学性质进行研究，认为来源于C.parapsilosis CCTCC M203011的氧化还原酶将(R)-苯基乙二醇不对称转化为(S)-苯基乙二醇的反应机理为在NAD+的存在下，先将(R)-苯基乙二醇选择性氧化为2-羟基苯乙酮，同时NAD+被还原为NADH；然后在NADPH的存在下，将中间体2-羟基苯乙酮不对称还原为(S)-苯基乙二醇，同时NADPH被氧化为NADP+。
C.parapsilosis CCTCC M203011醇脱氢酶对次级醇的活性较高。该酶催化氧化反应的最适pH值为pH9.0，最适温度为40℃。锌离子对该酶有激活作用，而金属螯合剂及重金属离子会对该酶的活力产生抑制作用。
C.parapsilosis CCTCC M203011羰基还原酶催化还原反应的最适pH值为pH4.5，最适温度为35℃，重金属离子对该酶的活性有明显的抑制作用。
近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)菌落形态为乳白色，表面光滑，有光泽，菌落不透明。菌体形态为卵圆形，细胞无性繁殖，芽殖，有时有假菌丝和有隔菌丝。生理生化特性为发酵葡萄糖，能利用D-半乳糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，蔗糖，麦芽糖，海藻糖，甲基-a-D-吡喃葡糖苷，松三糖，甘油，D-山梨醇，D-甘露醇，D-葡糖酸-1，5-内酯，2-酮-D-葡糖酸，琥珀酸，柠檬酸或乙醇作为唯一碳源，能利用乙胺，L-赖氨酸或尸胺作为唯一氮源。淀粉形成试验阴性，醋酸产生试验阴性，尿素水解试验阴性，重氮基蓝B反应阴性。最适生长温度30℃，最适起始作用pH6.5。该菌全细胞转化扁桃醇的最适温度33℃，最适作用pH6.5。
本发明的有益效果本发明用转化效果较好的菌株Candida parapsilosisCCTCC M203011，进行不对称转化外消旋苯基乙二醇得到产物(S)-苯基乙二醇，光学纯度为90％e.e.以上。
经培养基组成和培养条件优化后，所用菌株不对称转化外消旋苯基乙二醇，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度有较大提高，确定了优化的培养基组成和培养条件。
获得近平滑假丝酵母CCTCC M203011的(S)-专一性羰基还原酶的基因，利用该基因的重组菌株进行外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
生物材料样品说明近平滑假丝酵母，保藏日期2003年3月1日，保藏单位中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌株编号M203011。该菌株已在中国专利CN 1212403 C公开。
具体实施例方式
近平滑假丝酵母CCTCC M203011的(S)-专一性羰基还原酶基因的PCR产物经试剂盒纯化后，利用BigDye测序试剂盒和应用生物系统自动DNA测序仪进行核苷酸序列的测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，该还原酶氨基酸组成为SEQ ID NO2。
序列表<210>SEQ ID NO1<211>840<212>DNA<213>近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011<214>
atgggcgaaa tcgaatctta ttgtaacaaa gagttgggac cattgccaac aaaagctcca 60actttgtcaa agaacgtgct tgacttgttt tcccttaagg gtaaagttgc ttctgtgact 120ggatcatctg gtggtattgg ttgggctgtt gctgaagctt acgctcaagc tggtgcagat 180gtagccattt ggtacaactc ccatccagct gatgagaaag ccgaacactt gcaaaagaca 240tatggggtcc attcgaaagc ttacaagtgt aacattagtg acccaaagag cgttgaagaa 300accatctctc aacaagaaaa agactttgga accatcgacg tgtttgtcgc taatgctggt 360gttacttgga cacaaggacc agagattgat gttgacaact acgattcatg gaataagata 420attagtgttg atttgaatgg cgtatactac tgctcacaca atatcggtaa gatcttcaaa 480aaaaacggca aagggtcttt gatcataaca tcatcgatat ccggcaagat tgtcaatatc 540cctcagcttc aagctccata taacacggct aaagctgctt gtacacattt ggcaaaatcc 600ttggccatcg agtgggcacc atttgctaga gtgaacacca tttcaccagg ttatattgat 660actgatatta cagattttgc aagcaaagat atgaaagcta agtggtggca attgacacca 720ttgggaaggg aggggcttac tcaagagcta gttggtggat atttgtactt ggcatcgaat 780gcgtctacat tcacaactgg ttctgatgtt gttattgacg gtggatacac gtgtccatag 840<210>SEQ ID NO2<211>279<212>PRT<213>近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011<214>
Met Gly Glu Ile Glu Ser Tyr Cys Asn Lys Glu Leu Gly Pro Leu1 5 10 15Pro Thr Lys Ala Pro Thr Leu Ser Lys Asn Val Leu Asp Leu Phe20 25 30Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Val Thr Gly Ser Ser Gly Gly35 40 45Ile Gly Trp Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp50 55 60
Val Ala Ile Trp Tyr Asn Ser His Pro Ala Asp Glu Lys Ala Glu65 70 75His Leu Gln Lys Thr Tyr Gly Val His Ser Lys Ala Tyr Lys Cys80 85 90Asn Ile Ser Asp Pro Lys Ser Val Glu Glu Thr Ile Ser Gln Gln95 100 105Glu Lys Asp Phe Gly Thr Ile Asp Val Phe Val Ala Asn Ala Gly110 115 120Val Thr Trp Thr Gln Gly Pro Glu Ile Asp Val Asp Asn Tyr Asp125 130 135Ser Trp Asn Lys Ile Ile Ser Val Asp Leu Asn Gly Val Tyr Tyr140 145 150Cys Ser His Asn Ile Gly Lys Ile Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly155 160 165Ser Leu Ile Ile Thr Ser Ser Ile Ser Gly Lys Ile Val Asn Ile170 175 180Pro Gln Leu Gln Ala Pro Tyr Asn Thr Ala Lys Ala Ala Cys Thr185 190 195His Leu Ala Lys Ser Leu Ala Ile Glu Trp Ala Pro Phe Ala Arg200 205 210Val Asn Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Asp Thr Asp Ile Thr Asp215 220 225Phe Ala Ser Lys Asp MET Lys Ala Lys Trp Trp Gln Leu Thr Pro230 235 240Leu Gly Arg Glu Gly Leu Thr Gln Glu Leu Val Gly Gly Tyr Leu245 250 255Tyr Leu Ala Ser Asn Ala Ser Thr Phe Thr Thr Gly Ser Asp Val260 265 270Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Cys Pro275 279
权利要求
1.近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO1。
2.如权利要求1所述的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCCM203011的(S)-专一性羰基还原酶，其氨基酸组成为SEQ ID NO2。
全文摘要
近平滑假丝酵母CCTCC M203011的(S)－羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成，该(S)－专一性羰基还原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，属于生物工程技术领域。本发明确定近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCCM203011的(S)－专一性羰基还原酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO1，其氨基酸组成为SEQ ID NO2。利用该基因可使其重组菌株用于外消旋手性拆分，并为进一步研究用于手性拆分的微生物立体选择性氧化还原酶的多样性，转化途径及反应机理创造条件。
文档编号C12R1/72GK1884502SQ200610088058
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者徐岩, 肖荣, 聂尧 申请人:江南大学