专利名称：动物干扰素复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物干扰素复合物及其制备方法和应用，该动物干扰素复合物是经干扰素α和γ的共表达而得到的干扰素产物。
背景技术：
禽流感、口蹄疫等一系列畜禽病毒性传染病的暴发流行给全球社会和经济造成了巨大损失，直接威胁着食品安全和人类健康。为了控制和消灭这些动物疾病，常规途径是通过疫苗免疫预防和使用抗生素，但是由于饲养环境条件差，病毒不断变异，与此同时，食品的生物安全已受到广泛重视，提倡绿色食品，限制抗生素和抗病毒化学药物的使用，加强食品中药物残留检测等，使传统的防治畜禽疾病的方法面临新问题和挑战。
干扰素是由机体细胞在病毒等诱导剂的刺激下产生的，具有抑止病毒在被其激活的细胞内复制的一类细胞因子类蛋白质分子。干扰素分为I型和II型二类，I型干扰素包括干扰素α和干扰素β，其主要活性是通过与靶细胞和其自身的受体相互作用，诱导产生抗病毒蛋白2-5A合成酶和蛋白激酶PKR等，从而抑制病毒在细胞内复制，即抗病毒活性。II型干扰素又称干扰素γ，它除具有I类干扰素所具有的抗病毒活性外，还具有很强的免疫调节活性①通过上调巨噬细胞IgGFc受体促进ADCC作用；②活化NK细胞，提高其杀伤能力，被活化的NK细胞也分泌干扰素γ；③诱导巨噬细胞、T、B等细胞MHCII类分子的表达，从而提高抗原呈递能力；④干扰素γ可诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶的产生，促进NO的合成，是干扰素γ杀伤胞内病原体和抗肿瘤以及抑制病毒复制的分子机制之一。
但是由于干扰素mRNA不稳定和其基因的迅速关闭，细胞通过病毒或聚肌胞诱导而产生的干扰素量少，持续时间也短。因此通过干扰素诱导剂刺激机体产生干扰素来预防和治疗动物病毒性传染病，其效果会大打折扣。同时，通过培养细胞提取干扰素，其可行性也差。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种动物干扰素复合物。
本发明的另一目的是提供该动物干扰素复合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供该动物干扰素复合物在抑制病毒繁殖的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案该动物干扰素复合物，通过以下步骤制得A、获取动物干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体；B、转移载体或表达载体的选择和构建；C、转化或转染宿主菌或细胞；D、表达产物鉴定、纯化和分解。
所述的动物干扰素α和γ基因分别具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。
该动物干扰素复合物的制备方法是由以下步骤组成A、获取动物干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体人工合成动物干扰素α和γ核苷酸序列，或者设计特异性引物，两端加入酶切位点，通过RT-PCR将动物干扰素α和γ基因从经诱导的外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出来，分别连接到T载体；
B、转移载体或表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的转移载体或表达载体，表达载体选用原核表达载体或者真核表达载体，将同种属动物干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到同一表达载体，置于同一启动子控制之下，基因读码框正确并为3的整数倍，并且两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点；C、转化或转染宿主菌或细胞将构建好的转移载体与表达载体同源重组，筛选鉴定阳性表达质粒，利用磷酸钙沉淀法或脂质体感染法或电转化法等方法，将已构建好的表达载体，转化或转染到原核或真核宿主体内，通过PCR或质粒酶切1％琼脂糖凝胶电泳或序列测定鉴定无误后，进行诱导表达和条件优化筛选；D、表达产物鉴定、纯化和分解表达产物经镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化，SDS-PAGE电泳进行鉴定，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将一个蛋白质分子分解成二部分，即得干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
动物干扰素复合物在抑制新城疫病毒、禽流感病毒或传染性法氏囊炎病毒在鸡胚成纤维细胞内复制中的应用。未经处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经鸡干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
动物干扰素复合物在抑制伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒或猪圆环病毒在猪肾细胞或Merc-145细胞内复制中的应用。未经猪干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经猪干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
动物干扰素复合物在抑制牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒在牛肾细胞细胞内复制中的应用。未经牛干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经牛干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
动物干扰素复合物在抑制犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒在犬肾细胞细胞内复制中的应用。未经犬干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经犬干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
本发明采用基因工程技术，对动物干扰素α和γ基因进行克隆，将同种属动物干扰素α和γ基因进行串联，重组到表达载体，进行体外诱导，实现干扰素α和γ的共表达。使最终的干扰素产品既具有抗病毒活性，同时又具有较强的免疫调节活性，从而实现不同型干扰素的优势互补。
具体实施例方式
下面是本发明的实施例，所述的实施例只是用来说明本发明，而不应当被视为是对本发明的限制。
实施例1鸡干扰素α与γ的制备方法通过由以下步骤进行(1)、人工合成鸡干扰素α和γ核苷酸序列，两端加入BamH I、Hind III和Sph I酶切位点，分别连接到T载体。
鸡干扰素α在原核表达载体中表达时的核苷酸序列请参见所附序列表中的序列1。
鸡干扰素γ在原核表达载体中表达时的核苷酸序列请参见所附序列表中的序列2。
(2)、表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的原核表达载体，将鸡干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到经同样酶切的表达载体，置于同一启动子控制之下，并且两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点；(3)、转化宿主菌将构建好的表达载体利用磷酸钙沉淀法转化宿主菌，通过蓝白斑和抗性筛选，PCR和质粒双酶切鉴定阳性表达质粒，序列测定进一步鉴定无误后，进行IPTG诱导表达和条件优化筛选；(4)、表达产物鉴定、纯化和制备收集菌体，经超声波裂解，变性，镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化表达产物，SDS-PAGE电泳进行鉴定，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将表达的蛋白质分子从凝血酶或肠激酶酶切位点消化分解成二部分，即鸡干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
实施例2猪干扰素α与γ的制备具体由以下步骤组成
(1)、获取猪干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体设计特异性引物，两端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位点，通过RT-PCR技术将猪干扰素α和γ基因从经ConA或PHA诱导的外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出来，分别连接到T载体。
(2)、转移载体或表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的转移载体和表达载体，将猪干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到经同样酶切的表达载体，串联置于同一启动子控制之下，两基因读码框正确并且是3的整数倍，两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点，通过PCR或质粒酶切或序列测定鉴定。
(3)、转化或转染宿主菌或细胞将构建好的转移载体与表达载体同源重组，表达载体可选用原核表达载体或者真核表达载体，筛选鉴定阳性表达质粒，利用电转化或脂质体转化的方法，将已构建好的表达载体，转化或转染到宿主体内，进行诱导表达和条件优化筛选。
(4)、表达产物鉴定、纯化和制备SDS-PAGE电泳或荧光抗体染色镜检鉴定表达产物，镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将表达的蛋白质分子经凝血酶或肠激酶酶切位点消化分解成二部分，即猪干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
实施例3牛干扰素α与γ的制备具体由以下步骤组成(1)、获取牛干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体设计特异性引物，两端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位点，通过RT-PCR技术将牛干扰素α和γ基因从经ConA或PHA诱导的外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出来，分别连接到T载体。
(2)、转移载体或表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的转移载体和表达载体，将牛干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到经同样酶切的表达载体，串联置于同一启动子控制之下，两基因读码框正确并且是3的整数倍，两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点，通过PCR或质粒酶切或序列测定鉴定。
(3)、转化或转染宿主菌或细胞将构建好的转移载体与表达载体同源重组，表达载体可选用原核表达载体或者真核表达载体，筛选鉴定阳性表达质粒，利用电转化或脂质体转化的方法，将已构建好的表达载体，转化或转染到宿主体内，进行诱导表达和条件优化筛选。
(4)、表达产物鉴定、纯化和制备SDS-PAGE电泳或荧光抗体染色镜检鉴定表达产物，镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将表达的蛋白质分子经凝血酶或肠激酶酶切位点消化分解成二部分，即牛干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
实施例4犬干扰素α与γ的制备具体由以下步骤组成(1)、获取犬干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体设计特异性引物，两端加入Not I、EcoR I和Sal I酶切位点，通过RT-PCR技术将犬干扰素α和γ基因从经ConA或PHA诱导的外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出来，分别连接到T载体。
(2)、转移载体或表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的转移载体和表达载体，将犬干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到经同样酶切的表达载体，串联置于同一启动子控制之下，两基因读码框正确并且是3的整数倍，两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点，通过PCR或质粒酶切或序列测定鉴定。
(3)、转化或转染宿主菌或细胞将构建好的转移载体与表达载体同源重组，表达载体可选用原核表达载体或者真核表达载体，筛选鉴定阳性表达质粒，利用电转化或脂质体转化的方法，将已构建好的表达载体，转化或转染到宿主体内，进行诱导表达和条件优化筛选。
(4)、表达产物鉴定、纯化和制备SDS-PAGE电泳或荧光抗体染色镜检鉴定表达产物，镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将表达的蛋白质分子经凝血酶或肠激酶酶切位点消化分解成二部分，即犬干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
实施例5由实施例1得到的鸡干扰素α和γ复合型基因工程产品在鸡胚成纤维细胞上能够抑制100个TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用RPMI1640培养基培养鸡胚成纤维细胞，5％的CO2培养箱37℃条件下培养24小时，用不同剂量的鸡干扰素α和γ复合型基因工程产品进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒。结果表明鸡干扰素α和γ复合型基因工程产品对新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例1得到的鸡干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
实施例6由实施例2得到的猪干扰素α和γ复合型基因工程产品在猪肾细胞(PK)和Merc145细胞上能够抑制100个TCID50的伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养猪肾细胞(PK)和Merc145细胞，5％的CO2培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的猪干扰素α和γ复合型基因工程产品进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒。结果表明本品对伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例2得到的猪干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例2得到的猪干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
实施例7由实施例3得到的牛干扰素α和γ复合型基因工程产品在牛肾细胞(MDBK)上能够抑制100个TCID50的牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养牛肾细胞(MDBK)，5％的CO2培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的牛干扰素α和γ复合型基因工程产品进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒。结果表明本品对牛口蹄疫病毒、牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例3得到的牛干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例3得到的牛干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
实施例8由实施例4得到的犬干扰素α和γ复合型基因工程产品在犬肾细胞(MDCK)上能够抑制100个TCID50的犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒的增殖。在96孔微量细胞培养板上用DMEM培养基培养犬肾细胞(MDCK)，5％的CO2培养箱37℃条件下培养至细胞长成单层后，用不同剂量的犬干扰素α和γ复合型基因工程产品进行处理，24小时后吸弃，再分别接种100个TCID50的犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒。结果表明本品对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒感染所引起的细胞病变均具有抑制作用。未经实施例4得到的犬干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而经实施例4得到的犬干扰素α和γ复合型基因工程产品处理的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察7天，细胞形态正常，未出现任何病变。
以上对本发明所提供的动物干扰素复合物及其制备方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表<110>周继臣<120>动物干扰素复合物及其制备方法和应用<160>2<210>1<211>582<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cggggctacg gcatcctgct gctcaccctc 60cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc acaggatgcc 120accttctctc acgacagcct ccagctcttc cgggacatgg ctccaacact gctccagctg 180tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240cagcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300ccaagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccgcatccac 360cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacccgctc ccggacccgc 420tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccatcctc 480caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acccgcactt aa 582<210>2<211>495
<212>DNA<213>人工序列<400>2atgacttgcc agacttacaa cttgtttgtt ctgtctgtca tcatgattta ttatggccat 60actgcaagta gtctgaatct tgttcaactt caagatgata ttgacaaact gaaagctgac 120tttaactcaa gtcattcaga tgtagctgac ggtggcccta ttattgtaga gaaactgaag 180aactggacag agcgcaatga gaaacgcatc attctgagcc agattgtttc gatgtacttg 240gaaatgcttg aaaacactga caagtcaaag ccgcacatca aacacatttc tgaggagctc 300tatactctga aaaacaacct tcctgatggc gtgaagaagg tgaaagatat catggacctg 360gccaagctcc cgatgaacga cttgcgcatc cagcgcaaag ccgcgaatga actcttcagc 420atcttacaga agctggtgga tcctccgagt ttcaaacgca aacgcagcca gtctcagcgc 480cgctgcaatt gctaa 49权利要求
1.一种动物干扰素复合物，其特征在于，通过以下步骤制得A、获取动物干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体；B、转移载体或表达载体的选择和构建；C、转化或转染宿主菌或细胞；D、表达产物鉴定、纯化和分解。
2.如权利要求1所述的动物干扰素复合物，其特征在于，所述的动物干扰素α和γ基因分别具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列。
3.一种动物干扰素复合物的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成A、获取动物干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体人工合成动物干扰素α和γ核苷酸序列，或者设计特异性引物，两端加入酶切位点，通过RT-PCR将动物干扰素α和γ基因从经诱导的外周血淋巴细胞或脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出来，分别连接到T载体；B、转移载体或表达载体的选择和构建选择可通过Lac Z基因筛选的含有His×6标签的具有氨苄青霉素或卡那霉素或庆大霉素或四环霉素抗性的转移载体或表达载体，表达载体选用原核表达载体或者真核表达载体，将同种属动物干扰素α和γ基因分别从已构建的T载体中经双酶切后连接到同一表达载体，置于同一启动子控制之下，基因读码框正确并为3的整数倍，并且两基因之间插入凝血酶或肠激酶切位点；C、转化或转染宿主菌或细胞将构建好的转移载体与表达载体同源重组，筛选鉴定阳性表达质粒，利用磷酸钙沉淀法或脂质体感染法或电转化法等方法，将已构建好的表达载体，转化或转染到原核或真核宿主体内，通过PCR或质粒酶切1％琼脂糖凝胶电泳或序列测定鉴定无误后，进行诱导表达和条件优化筛选；D、表达产物鉴定、纯化和分解表达产物经镍亲和层析或单克隆抗体偶联载体颗粒层析纯化，SDS-PAGE电泳进行鉴定，纯化表达产物经凝血酶或肠激酶消化，将一个蛋白质分子分解成二部分，即得干扰素α分子和干扰素γ分子的复合物。
4.权利要求1或2所述的动物干扰素复合物在抑制新城疫病毒、禽流感病毒或传染性法氏囊炎病毒在鸡胚成纤维细胞内复制中的应用。
5.权利要求1所述的动物干扰素复合物在抑制伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪圆环病毒在猪肾细胞或Merc-145细胞内复制中的应用。
6.权利要求1所述的动物干扰素复合物在抑制牛流行性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛细小病毒在牛肾细胞内复制中的应用。
7.权利要求1所述的动物干扰素复合物在抑制犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、犬冠状病毒在犬肾细胞内复制中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种动物干扰素复合物及其制备方法和应用。该动物干扰素复合物通过获取动物干扰素α和γ基因，构建重组克隆载体；转移载体或表达载体的选择和构建；转化或转染宿主菌或细胞；表达产物鉴定、纯化和分解制得。本发明还公开了该动物干扰素复合物的制备方法和应用。本发明公开的动物干扰素复合物产品既具有抗病毒活性，同时又具有较强的免疫调节活性，从而实现了不同干扰素的优势互补。
文档编号C12P21/02GK1887344SQ20061010382
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者王彦彬, 周继臣, 魏云强, 张翠义 申请人:周继臣