专利名称：：螺内酰胺类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用曲霉B-F-2(Aspe^Z^sp.B-F-2)(该菌株已于2005年12月16日保藏在武汉中国菌种保藏中心，保藏编号是:CCTCCM205148)制备新螺内酰胺类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
：螺内酰胺类化合物已有一些文献报道，该类化合物显示了多种生物活性，如细胞分化诱导齐U(Komagata,D.;Fujita,S.;Yamashita，N.;Saito,S.;Morino,T.1996,49(9),958.)，抗菌抗肿瘤活性(Hayashi，Y.;Shoji'M.;Mukaiyama,T.;Gotoh,H.;Yamaguchi，S.;Nakata，H.;Osada,H.Org.Lett.2005,70，5643.)，以及抑制血管生成活性(Asami,Y.;Kakeya，H.;Onose，R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada,H.Org.Left2002，4(17),2845)等。该类化合物是一类较常见的真菌代谢产物，其结构特征是都具有l-0xa-7-azaSpir0[4,4]non-2-ene-4，6-dione的结构母核，pseurotinA，synerazolandazaspirene都是该类化合物的例子(Ando，O.;Satake，H.;Nakajima,M.;Sato,A.;Nakamura，T.;Ki腦hita，T.;Furuya,K,丄A打"砲.1991,44(4)，382.;Asami,Y.;Kakeya,H.;Onose,R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada，H.Org.Leff.2002,4(17)，2845)。母丰亥上连接的侧链常见为临二醇或共轭双键，而我们的化合物与母核相连的侧链为乙基呋喃环，这是非常少见的。本发明人研究发现曲霉B-F-2(A平ergfflwsp.B-F-2)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞坏死活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了两个新的螺内酰胺类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。本发明首次从曲霉B-F-2(A印"g"/"ssp.B-F-2)(该菌株已于2005年12月16闩保藏在武汉中国菌种保藏中心，保藏编号是:CCTCCM205148)发酵物中发现了结构新颖的新螺内酰胺类化合物，如式I所示R2式I其结构特征是其中式IR,、R3,R4为氢、甲基、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2为氢、烃基、羟基或酰基。本发明的式I化合物优选其中化合物为化合物1，其中^为甲基，R2为氢，R3为羟基，R4为甲氧基；或化合物2，其中R,为甲基，R2为氢，R3R4均为羟基。上述发明中最优选的化合物是由海洋来源的曲霉B-F-2(A印wg"Ztwsp.B-F-2)的液体发酵物经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇8:2的洗脱物，再经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮6:4洗脱产物再经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水60:40洗脱得式I化合物1，2。本发明采用MTT法测试了化合物1，2对P388，A-549,HL60和BEL-7402细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，这2个化合物对这四种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。因此本发明的式I化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。式I化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I化合物。本发明的实施例中列举了利用曲霉B-F-2株制备优选的本发明式I化合物的实例。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产新螺内酰胺类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可用作产素菌用于制备式I化合物。具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物1-2的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)式I式I中化合物1的R,为甲基，R2为氢，R3为羟基，R4为甲氧基；或化合物2的R,为甲基，R2为氢，R3R4均为羟基。实施例1化合物1-2的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取曲霉B-F-2(A^岬!7tosp.B-F-2)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。取斜面培养4天的曲霉B-F-2(A印wgZ/^sp.B-F-2)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的500mL锥型瓶中，在28°C、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得曲霉B-F-2G4印erg"/wsp.B-F-2)的种子培养液。将该种子培养液按10%接种量分别接种于装有300毫升生产培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的1000mL三角烧瓶中，进行为期25天24。C的静置生产发酵，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓縮至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓縮，得粗浸膏。发酵液减压浓縮为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共15.0克。3化合物的分离精制浸膏(22.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶剂溶解后，加70克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为16个流份。Fr-ll(2克，氯仿-甲醇8:2洗脱物)，再经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮6:4洗脱产物再经HPLC，以甲醇-水6:4洗脱得化合物1(60mg)2(llmg)。化合物1黄色固体，分子式C22H21N07，HRESI-MSm/z:412.1380[M+H]+，计算值:412.1396.UVXmaxnminMeOH:337,284，253.IRvmaxcm-1(KBr):3479,3271,3137,2975，2936,1735'1684，1619，1568，1508，1412，1162,1108,803'754,691，667.'H及13CNMR数据见表1。化合物2无色固体，分子式C21H19N07,HRESI-MSm/z:428.2434[M+H]+，计算值428.2437。IRvmaxcm-1(KBr):3190,2980，1727,1691，1604，1554,1494,1244,1096，807'790'689。及'SCNMR数据见表2。表1600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof1inCDCl.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof2inCDC13<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1-2。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。细胞系及细胞的继代培养活性测试采用P388，A-549，HL-60和BEL-7402细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37°C通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan,formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。活性测试时，取对数生长期的P388，A-549,HL-60和BEL-7402细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5xl0"个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37。C下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入2C^L含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L),再培养4小时，移出15(HiL培养液后加入150nLDMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR%=(OD如对照-OD附,,)/OD如对照X1009fc式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。2实验结果化合物1-2的细胞增殖抑制活性表3.化合物1-2对P388，A-549,HL-60和BEL-7402细胞的抑制率12<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3结论化合物l-2对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用。因此，本发明的式I化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。权利要求1.式I或式II化合物式I其中式IR1、R3、R4为氢、甲基、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2为氢、烃基、羟基或酰基。2.权利要求1所述的式I化合物，其中式I化合物为化合物1，其中R,为甲基，R2为氢，R3为羟基，R4为甲氧基；或化合物2，其中R,为甲基，R2为氢，&114均为羟基。3.权利要求2所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养曲霉B-F-2C4，^ksp.B-F-2),获取含有上述式I化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物1和化合物2。4.权利要求3所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇8:2的洗脱物，再经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮6:4洗脱产物再经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水60:40洗脱得式I化合物1，2。5.权利要求1所述的式I化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其中所述抗肿瘤药物是指所述的式I化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。7.根据权利要求5所述的用途，其中所述抗肿瘤药物是指所述的式I化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。1.式I或式II化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本发明涉及新螺内酰胺类化合物及其制备方法和用途。本发明用从海洋样品中分离得到的曲霉B-F-2(Aspergillussp.B-F-2)生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。文档编号C12R1/66GK101113151SQ20061010365公开日2008年1月30日申请日期2006年7月26日优先权日2006年7月26日发明者睿刘,方玉春,朱伟明,朱天骄,顾谦群申请人:中国海洋大学;中国大洋矿产资源研究开发协会