专利名称：以植物多酚类物质为底物酶法合成黑色素的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，生物化学制品范围，用茶多酚为反应底物，通过酶促合成黑 色素(Melanins)。
背景技术：
黑色素是生物的保护性色素，广泛存在于动物、植物和微生物中，黑色素有吸收紫外线、 抗氧化、消除自由基的作用，对生物有机体起着保护作用。按黑色素的结构组成，可分为三 种型式，即真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和异黑色素(allpmelanin)。真 黑色素颜色为深棕色或黑色，由酪氨酸经由多巴(Dopa)途径转化而生成，这种黑色素主要 分布于动物表皮和毛发细胞中，以及内脏膜或组织中，可称为动物型黑色素。棕黑色素是真 黑色素的胱氨酸衍生物，含硫原子，颜色为略带红色的棕色或黄色，常见于动物的毛发中。 异黑色素主要分布于植物中，属植物型黑色素，类似于真黑色素为棕色或黑色，它主要是由 儿茶酚等二元酚、三元酚经由多聚羟基萘途径生成的。
黑色素是一种天然色素，在轻工、化工、食品、化妆品等方面有重要的用途。目前制取 黑色素有3种方法， 一是从粮食如黑豆、黑芝麻、高粱等种皮和动物毛发、表皮分离提取的， 产量小，成本高，纯度低；二是发酵黑酵母(&^c/ aroy^ces"i^erMarpm)从酵母菌体分离 制取的，菌种分离困难，设备复杂，投资巨大。三是通过酶法和化学法合成黑色素，如以酪 氨酸为底物酶促合成动物型黑色素，以一元酚和二元酚为底物合成植物型黑色素。但迄今未 见有关利用植物多酚类物质为底物合成黑色素的报道，用植物多酚类物质合成的黑色素由于 其前体物的结构特殊性，使得其合成的黑色素在医药和环保方面有着更大的用途。本发明利 用植物多酚类物质为底物，酶促反应法生产黑色素，简便易行、生产成本低、投资小、设备 简单、产品纯度高。
发明内容
在反应容器中加入介质缓冲液、反应催化剂多分氧化酶和植物多酚类物质，组成酶促反 应系统，在最适宜的pH、温度、催化剂浓度、底物浓度和供氧条件下进行酶促合成黑色素反
应。反应结束后加入酸，使黑色素沉淀析出，再经酶解或酸解处理，消化掉与黑色素混杂的
蛋白质，获得黑色素纯品。
黑色素制备将植物多酚类物质溶于0.05%碳酸氢钠溶液中，在水浴上加热溶解，冷却至
40°C,加入反应催化剂。在384(TC保温40 60分钟进行反应，期间进行充分供氧。反应混 合液逐渐由红褐色变成黑色。待反应结束后，用6M盐酸调节pH〈3，酶蛋白和黑色素一起沉 降到瓶底，过滤收集沉淀，得黑色素粗产物。再经稀酸、稀碱洗涤后，再用水洗至中性。将 洗至中性的黑色素粗制品置于烧瓶中，加适量6NHC1洄流8 20小时，水解其中的蛋白质， 放置冷却，过滤出黑色素，用稀碱洗涤，最后水洗至中性，6(TC烘干，即得黑色素。
具体实施方式
实例1.
多酚氧化酶的制备将250g新鲜马铃薯洗净，切成小块，加入少量石英砂和pH7.8的磷 酸缓冲液1000ml，在高速捣碎机中匀浆2分钟，80-120目尼龙布过滤，滤液4-6。C静置0.5-2 小时，待淀粉沉淀到底部后，倾出上清液，加入达到70%饱和度的硫酸铵，离心收集沉淀， 得多酚氧化酶抽提物，得到多酚氧化酶l，置冰箱中保存备用。
500g新鲜蘑菇，加入500ml甘油，用高速捣碎机(10000rpm)匀浆捣碎1分钟，200目 尼龙布挤滤，弃去滤渣，得到多酚氧化酶2，置于5i:冰箱中保存备用。
实例2.
O.lg茶多酚溶于200ml磷酸缓冲液pH8.0中，在水浴中加温至3S 4(TC ,加入蘑菇匀浆液 5 15ml，快速搅拌，充足供氧，反应混合液很快变成红色，随时间延长，由红色变成褐色， 最后为黑色，继续保温40 60分钟，滴加6N盐酸停止反应，黑色素随酶蛋白沉淀下来。经 抽滤，沉淀于6(TC烘干得黑色素粗制品0.091克。 实例3.
0.2g葡萄多酚加入磷酸缓冲液1000mlpH8.0中，加热至溶解，冷却至4(TC，加入上述多 分氧化酶l 25-30毫克，边保温边搅拌，充足供氧，4(TC保温1小时后，6N盐酸调节反应液 pH<3，出现黑色絮状沉淀，抽滤，水洗3 5次，6(TC烘干，得黑色素粗产物0.094g。
实例4.
O.lg苹果多酚溶于200ml磷酸缓冲液pH8.0中，在水浴中加温至38~40°C ，加入蘑菇匀浆 液5 15ml，快速搅拌，充足供氧，反应混合液很快变成红色，随时间延长，由红色变成褐色， 最后为黑色，继续保温40 60分钟，滴加6N盐酸停止反应，黑色素随酶蛋白沉淀下来。经 抽滤，沉淀于6(TC烘干得黑色素粗制品0.089克。
实例5.
将按实例2、 3、 4所获得的黑色素粗制品研磨或粉碎成细粉末，过240目筛，把黑色素 粗制品悬浮于6N的盐酸中，洄流8 20小时，水解其中的蛋白质，放置冷却，过滤出黑色素， 用稀碱洗涤，最后水洗至中性，6(TC烘干，即得黑色素，纯度达95 98%。
实例6.
将按实例2、 3、 4等所获得的黑色素粗制品研磨或粉碎成细粉末，过240目筛，每g黑色 素粗制品悬浮于100ml拧檬酸缓冲液pH5. 4中，加入蛋白酶制剂100mg， 35t保温30分钟， 5000rpm离心收集黑色素，用水洗涤3次，经检测无蛋白反应，黑色素纯度达95 98%。
权利要求
1. 本发明提出了在生物体外用酶促合成法生产制取黑色素的新途径新方法。
2. 按权利要求l，酶促合成法生产制取黑色素的新途径、新方法，包括酶制剂的分离制备、 酶反应底物、酶促反应系统组成、酶促反应条件和酶促反应产物的分离和纯化。
3. 按权利要求2，所涉及的酶包括多酚氧化酶系统中的所有的参于合成黑色素的酶种类及其 相应的辅酶、辅基和活化因子等，这种包括多酚氧化酶系统的酵制剂，既包括酶粗提物， 也包括经部分纯化的酶制剂粉末和溶液。
4. 按权利要求2，酶反应底物包括一元酚及其衍生物(酪氨酸、酪胺、多巴、多巴胺等及其 衍生物)、二元酚及其衍生物(对苯二酚、邻苯二酚、间本二酚、儿茶酸、异儿茶酸等及 其衍生物)、三元酚及其衍生物(连苯三酚、没食子酸等及其衍生物)。
5. 按权利要求2，酶促合成植物型黑色素反应系统组成包括磷酸缓冲液(pH6-9)、权利要求 5中的底物0.1-3.0g/升、权利要求3中的酶系统5000-100000单位/升。
6. 按权利要求2，用酸调PH^4沉淀析出黑色素，使黑色素从酶反应液中分离出来。
7. 按权利要求2，用3-9N HC1洄流10-30小时或用胰酶水解消化法处理酶法合成制取的黑色 素粗产物，使黑色素产品得以纯化。
全文摘要
本发明属于生物化学制品领域。从植物材料分离制取多酚氧化酶系作为酶制剂，植物多酚类物质为底物，在磷酸缓冲液介质中建立反应系统，进行合成黑色素，并进行分离和纯化，检测所获产物理化性质，所获产物和标准黑色素以及从其他植物分离提取的黑色素基本相同。本发明为生产制取黑色素提供了新途径。
文档编号C12P1/00GK101205547SQ20061015648
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者张金萍, 杜孟浩, 王敬文 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所